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木下, 健 ; Kinoshita, Takeshi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />昨年度単離したBid結合因子(clone-2)の機能解析を進めた。1,clone-2遺伝子の発現分布をNorthern Blotで解析した。正常組織(CLONTECH社のMultiple Tissue
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Northern Blotを利用した)ではBrain、Liverで強いmRNAの発現を検出した。培養細胞(Cos7,Hela, HEK293,HepG2,Jurkat K562,THP1)ではHepG2細胞でやや強く、Cos7,HEK293で弱いmRNA発現を検出した。RT-PCR解析では全てのcell lineで発現が確認された。2,clone-2の安定発現細胞株の樹立を試みた。Jurkat細胞にのcDNAを組み込んだpIRES2-EGFP(CLONTECH社)ベクターを導入し、G418耐性、GFP発現を指標にclone-2の安定発現クローンを4種類得た。4クローン中2クローンがレコンビナントFasリガンドで誘導されるアポトーシスに耐性を示した。3,clone-2の細胞内局在を調べた。clone-2に対するポリクローナル抗体を作製し、HepG2細胞を免疫染色したところ、ミトコンドリアに強い染色像が見られた。HepG2細胞を分画し、western blot解析したところ、ミトコンドリアを含むheavy membrane画分にclone-2のカルボキシ末端側とみられる14kDaのバンドを検出した。clone-2の全長に相当する蛋白のバンドは確認できなかった。4,アンチセンスRNA発現ベクター導入による内在性clone-2の発現阻害を試みたが、14kDaのバンドの消失は認められなかった。以上の結果より、過剰発現系においてはclone-2がBidで誘導されるアポトーシスに対して抑制的に働く可能性が示唆された。<br />研究課題/領域番号:13770106, 研究期間(年度):2001-2002<br />出典：「アポトーシス促進因子Bidの制御機構」研究成果報告書 課題番号13770106（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13770106/ ）を加工して作成
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高仲, 強
概要:
金沢大学 医 放射線医<br />1)放射線誘発アポトーシスは小細胞癌細胞株であるSBC-1, SBC-3に発現し,その最大発現頻度はSBC-1において10Gy照射48時間後17.9±0.1%, SBC-3において20Gy照射72時間後9.
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6±2.3%であった. 2)放射線誘発アポトーシスの発現は照射された生検腫瘍組織においても確認された. 3)Fas抗原の発現はSBC-3及び腺癌細胞株であるRERF-LC-MSに,Bc1-2蛋白の発現は全細胞株に認められた. 4)10Gy照射後SBC-3においてFasmRNA発現の増加とそれに伴うFas抗原発現の増加があり,抗Fas抗体によるアポトーシスの誘発が促進された. 5)RERF-LC-MSでは放射線誘発アポトーシスは認められず,抗Fas抗体によるアポトーシスの誘発も認められなかった
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笠原, 寿郎 ; Kasahara, Kazuo
概要:
金沢大学附属病院<br />1、肺癌細胞株におけるアポトーシスの検討肺癌細胞株PC-9及びそのシスプラチン耐性細胞株PC-9/CDDPを用い実験を行った。それぞれの細胞株をシスプラチンに2時間接触させて後、24時間培養し、細胞を回収した。シ
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スプラチンにより誘導されるアポトーシスはPC-9において有意に多く、さらに脂質メディエーターであるトロンポキサンA2(TXA2)拮抗薬、合成酵素阻害薬を併用したところ、シスプラチンにより誘導されるアポトーシスは有意に増強した。即ち、TXA2の機能を阻害する事でシスプラチン誘導細胞死が増加した。血小板活性化因子(PAF)拮抗薬についても同様の結果を得た。2、細胞死に関するプロテアーゼの解析TXA2拮抗薬の併用により、シスプラチン誘導アポトーシスの増強が確認されたので、細胞死に関わるシステインプロテアーゼであるカズパーゼについて検討した。ウェスタンブロット法を用い、蛋白量を検討したところ、TXA2拮抗薬の処理によってカスパーゼ2が誘導された。PAF拮抗薬ではカスパーゼ1が誘導された。3、Mitogen-activated proteinキナーゼ(MAPK)の検討TXA2拮抗薬、PAF拮抗薬のシスプラチン誘導細胞死の増強機序を解析するために脂質メディエーターと深く関わりを持つMAPKが果たす役割を検討した。活性化状態のMAPKを確認する抗リン酸化抗体を用いウェスタンブロット法で検討したが、TXA2拮抗薬、PAF拮抗薬、共に影響を与えなかった。以上の結果から、脂質メディエーターであるTXA2、PAFを阻害する事によりシスプラチン誘導アポトーシスが増強し、これはカズパーゼ蛋白を誘導する事に起因すると考えられた。<br />研究課題/領域番号:10770264, 研究期間(年度):1998 – 1999<br />出典：「肺癌細胞のアポトーシスにおける脂質メディエーターの役割」研究成果報告書 課題番号10770264（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10770264/)を加工して作成
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和田, 泰三
概要:
金沢大学 医 小児科<br />1)家系1-症例1(8ヵ月女児),2(2歳9ヵ月男児,症例1の兄)では母由来の変異対立遺伝子において点突然変異があり,このため変異対立遺伝子由来のmRNAではエキソン7と8の間にGCAGの4塩基の挿入が認めら
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れた.変異由来のFasレセプターは細胞内部分がなく異常な3量体を形成するため,ドミナントネガティブ効果により細胞死に至るシグナルが伝達されないと考えた. 2)家系2-症例3(1歳女児)ではイントロン3に点突然変異があるためエキソン4のスキップが認められた.両親がいとこ婚で変異対立遺伝子のホモ接合体となっていたためFasレセプターそのものの発現が全く欠如し細胞死に至るシグナルが伝達されないと考えた. 5)患児ではT細胞のFas誘導性アポトーシスが欠如しているほかAICDも減弱しているため,自己反応性T細胞が排除されず,自己寛容が破綻し様々な自己免疫状態が生じているものと考えた
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小林, 顕 ; Kobayashi, Akira
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />研究代表者は、眼科領域におけるアポトーシス研究の第一人者であるマイアミ大学のAndrew Huang博士(マイアミ大学バスコンパルマー眼研究所、眼科助教授)の協力を得て、マウスの角膜輪部においてbcl
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-2のみならず、bcl-xが特異的に発現していることを免疫染色法によって明らかにし、角膜輪部幹細胞のマーカーとしての可能性を見出した。また、bcl-2のトランスジェニックマウスとノックアウトマウスを用いて、アポトーシス関連遺伝子(bcl-2、bcl-x、bax)の角結膜における発現を調べ、成果を1999年ARVOmeeting(The Association for Research and Vision in Ophthalmology, Fort Lauderdale, USA)において報告した。また、再発翼状片においてのアポトーシス関連遺伝子(bcl-2、bcl-x、bax、p53)などにつき、免疫染色法を用いて調べ、その局在について明らかにした。さらに、色素性乾皮症に生じた難治性の翼状片についてもアポトーシス関連遺伝子をしらべ、現在その結果について解析中である。<br />研究課題/領域番号:11771042, 研究期間(年度):1999 – 2000<br />出典：「角膜、結膜、眼瞼におけるアポトーシス関連遺伝子の局在解明-眼表面疾患の治療に向けて-」研究成果報告書 課題番号11771042, （KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11771042/ ）を加工して作成
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須田, 貴司 ; Suda, Takashi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />ASCはCARD12等と結合してアポトーシスと炎症のシグナルを伝達する細胞質アダプター蛋白である。我々は、CARD12とmuramy1 dipeptide(MDP)刺激で活性化するNod2の融合蛋白(C
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12N2)を用い、MDPでASCを特異的に活性化する実験系を開発し、ASCはがん細胞にアポトーシスとIL-8産生を誘導すること、後者の応答にNF-KBとAP-1の活性化が寄与していることを示してきた。昨年度はAP-1活性化の分子機構を解明し、ヒト胃癌細胞株NUGC4にC12N2とASCを安定導入した細胞株(NUC12N2)の腫瘍をヌードマウスに形成させ、MDPを投与すると腫瘍が完全に退縮することを示した。,本年度は、以下の点を明らかにした。1)ASCの活性化により転写因子 STAT1,ISGF3,STAT3,NFATの内STAT3のみが活性化されること、STAT3の活性化はAP-1とNF-kBに依存した2次的な応答であることを示した。2)DNAマイクロアレー解析でASCの活性化により誘導される遺伝子を網羅的に解析し、転写関連(24%)、炎症関連(21%)、細胞死関連(16%)を含む75種類の遺伝子が有意に誘導されることを示した。3)NUC12N2またはNUGC4の腫瘍を形成させたヌードマウスにMDPを投与し、24時間後の腫瘍組織のアポトーシス細胞をTUNEL法で染色したところ、NUC12N2腫瘍組織でのみ、著しいアポトーシスが検出された。また、NUC12N2にNUGC4を5%以上混入させた場合には、MDP投与で腫瘍が拒絶されなかったことから、このがん治療モデルにおける腫瘍退縮はがん細胞のアポトーシスによるもので、炎症反応による周囲のがん細胞の巻き込み排除はほとんど寄与していないことが示された。<br />研究課題/領域番号:18013022, 研究期間(年度):2006 – 2007<br />出典：「ASC依存性AP-1活性化機構の解明とASCのがん分子標的としての可能性の検討」研究成果報告書 課題番号18013022（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18013022/)を加工して作成
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中西, 義信 ; Nakanishi, Yoshinobu
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />アポトーシス細胞表層へのホスファチジルセリンの露出機構の解析多くのアポトーシス細胞では膜リン脂質のひとつであるホスファチジルセリン(PS)が,細胞膜内側層から外側層へ移行して,食細胞に認識される目印分
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子として働く。このアポトーシス細胞におけるPS露出の機構を解明するために,細胞膜中でのPSの移動を規定する酵素を新たにクローニングあるいは他の研究者より供与してもらい解析を進めた。しかし,研究開始後にこれらのタンパク質がPS移動酵素の本体ではないことが判明した。そのため,あらためて真の酵素を同定するには時間がかかりすぎると考え,この課題の展開を断念した。新規貧食目印分子PH2抗原の性状及びアポトーシス細胞表層への移動機構の解析アポトーシス細胞全体を免疫原として作成されたモノクローナル抗体群をスクリーニングすることにより,マクロファージによるアポトーシス細胞の貧食反応を阻害するクローンPH2を同定した。PH2が認職する抗原は新規貧食目印分子と予想されるため,その性質と細胞内局在性を調べた。その結果,PH2抗原はタンパク質であり,正常細胞内の膜構造部分に存在することがわかった。さらに解析を進め,PH2抗原の少なくとも一部がトランスゴルジに局在することが判明した。よって,アポトーシス誘導時に,「トランスゴルジ→エンドソーム→細胞膜」という小胞輸送を経て,PH2抗原が細胞表層に露出して貧食目印となることが示唆された。アポトーシス細胞表層へのリボソームタンパク質の移動の解析アポトーシス細胞におけるリボソームの構造変化を調べた。その結果,アポトーシスの後期段階に,調べた28種類のヒトリボソームタンパク質のうち3種類が分解してリボソームから離脱することがわかった。さらに,6種類のリボソームタンパク質がアポトーシス時に細胞表層に検出されるようになることが見いだされた。よって,アポトーシス細胞において,リボソームタンパク質がリボソームを離れて細胞表層に移動し,貧食目印として働く可能性が初めて示唆された。<br />Mechanism of phosphatidylserine externalization in apoptotic cellsIn order to elucidate the mechanism by which the membrane phospholipid phosphatidylserine (PS) translocates from the inner to the outer leaflet of the membrane bilayer and serves as a phagocytosis marker, we examined changes in the amount and activity of candidate enzymes responsible for the localization of PS in apoptotic cells. We have cloned a gene coding for presumed amino phospholipid translocase and obtained other candidate enzymes, but all of them turned out to be unrelated to the aimed enzymes. We thus gave up this project.Analysis of candidate novel phagocytosis markerWe generated a monoclonal antibody named PH2 that inhibits macrophage phagocytosis of apoptotic cells. The antigen recognized by PH2 was thus considered to be a novel phagocytosis marker. We then characterized the PH2 antigen and found that it consists of protein and is localized to the membranous structures in normal cells. Furthermore, some fractions of the antigen was detectable in trans-Golgi. These results suggest that the PH2 antigen undergoes membrane vesicle transport and is exposed to cell surface upon apoptosis induction.Externalization of ribosomal proteins in apoptotic callsWe determined structural change of ribosomes during apoptosis. When 28 out of 79 kinds of human ribosomal proteins were analyzed, 3 proteins were found to be degraded and released from ribosomes in apoptotic cells. In addition, 6 ribosomal proteins became detectable on cell surface upon apoptosis. These results suggest that some ribosomal proteins move from the ribosome to cell surface during apoptosis and serve as phagocytosis markers.<br />研究課題/領域番号:12680630, 研究期間(年度):2000 – 2001<br />出典：「アポトーシス細胞における貧食目印分子の出現機構の解析」研究成果報告書 課題番号12680630（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12680630）を加工して作成
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清水, 宣明 ; Shimizu, Nobuaki
概要:
肝細胞特異認識タンパク質preS1/S2固定化TiO_2ナノ粒子を用いて、培養がん細胞に対する細胞損傷効果および担がんマウスに対する抗腫瘍効果を解析した。その結果がん細胞がOHラジカルなどの化学種の酸化作用により損傷を受け、アポトーシスを誘
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導し細胞死に至ること、周波数1MHz,照射強度1W/cm^2,照射時間1minという条件で週3回担がんマウスに超音波照射を行い、有意な腫瘍の成長抑制を確認した。<br />研究課題/領域番号:19300182, 研究期間(年度):2007–2009
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須田, 貴司 ; Suda, Takashi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />ASCはCARD12等と結合してアポトーシス等を誘導する細胞質蛋白質で、その遺伝子は様々ながん組織で発現が抑制されている。しかし、ASCのアポトーシス誘導機構は明確になっていない。我々は、CARD12と
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Nod2の融合蛋白(C12N2)を発現させ、MDP(Nod2のリガンド)でASC依存性アポトーシスを誘導する実験系を開発した。本研究では、この実験系を用いASC依存性アポトーシスの分子機構を検討した。さらに、我々が最近発見した新規ASC阻害蛋白PYNODについて、がん細胞における発現とASC誘導アポトーシスに対する効果を検討した。結果は以下の通りである。1)種々のがん細胞にC12N2とASCを発現させ、MDPで刺激したところ、調べた全ての細胞株でアポトーシスが誘導された。2)種々のドミナントネガティブ(DN)変異体やsiRNA、カスパーゼ阻害剤などを用いた検討から、ASCはFADD非依存性にカスパーゼ8を介してアポトーシスを誘導し、さらにタイプ2細胞においてはカスパーゼ8で切断されるBid依存性に、ミトコンドリア経路のアポトーシスを誘導することが判明した。3)ASCとカスパーゼ8は細胞内でスペックと呼ばれる凝集塊に共局在した。一方、FADD, Bax, Nod2などとの共局在は認められなかった。4)組替ヒトPYNOD蛋白を特異的に検出する単クローン抗体の樹立に成功した。5)この抗体を用い、PYNOD mRNAの発現が確認された10種類のヒトがん細胞株についてPYNOD蛋白の検出を試みたが、検出できなかった。内在性PYNODの検出にはより高親和性の抗体が必要と思われる。6)PYNODを細胞に一過性に発現させるとASC依存性アポトーシスを阻害した。以上、ASCは種々のがん細胞にカスパーゼ8依存性のアポトーシスを誘導し、PYNODはこのアポトーシスを抑制しうることが判明した。<br />研究課題/領域番号:17014035, 研究期間(年度):2005<br />出典：「ASC依存性アポトーシスの分子機構とPYNODの抑制効果の検討」研究成果報告書 課題番号17014035（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17014035/)を加工して作成
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小川, 数馬 ; Ogawa, Kazuma
概要:
金沢大学学際科学実験センター<br />アポトーシスは生体のホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしていることが知られており、アポトーシスを体外から非侵襲的にイメージングすることが可能であれば、これら疾患の臨床診断、病態解明に非常に有用であ
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る。昨年度の研究にて、生体内で安定であり、かつ代謝物が代謝臓器から速やかにクリアランスされることが予想されるbis(benzohydroxamamide)誘導体の^<99m>Tc錯体[^<99m>Tc-C_3(Bham)_2]とAnnexin A5とをリンカーを介して結合した^<99m>Tc-C_3(Bham)_2-Annexin A5を作製し、Annexin A5の生理活性を調べたところ、既存の化合物である^<99m>Tc-HYNIC-Annexin A5とほぼ同程度の生理活性を示した。今年度の研究にて、この標識体のノーマルマウスにおける体内放射能分布を調べた結果、^<99m>Tc-C_3(Bham)_2-Annexin A5の血液クリアランスは^<99m>Tc-HYNIC-Annexin A5よりも遅く、^<99m>Tc-HYNIC-Annexin A5が非常に高い放射能集積を示す臓器である腎臓において、大きく放射能集積を低減させた。また、肝臓においては、投与早期においては、^<99m>Tc-C_3(Bham)_2-Annexin A5は、^<99m>Tc-HYNIC-Annexin A5よりも高い放射能集積は示したが、^<99m>Tc-HYNIC-Annexin A5の放射能が滞留を示すのに対し、^<99m>Tc-C_3(Bham)_2-Annexin A5の放射能は時間経過とともに低減し、投与後6時間後における放射能は同程度であった。以上の結果より、^<99m>Tc-C_3(Bham)_2-Annexin A5はアポトーシスイメージング剤として有用である可能性が示された。今後、担癌動物に抗癌剤を投与した時のアポトーシスのイメージングを行う予定である。<br />研究課題/領域番号:18790879, 研究期間(年度):2006 – 2007<br />出典：「新規アポトーシスイメージング剤による癌・虚血再灌流障害治療効果超早期診断法の確立」研究成果報告書 課題番号18790879（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18790879/)を加工して作成
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