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近藤, 悟 ; Kondo, Satoru
概要:
MDM2は癌抑制遺伝子p53分解を促進し、この過剰発現は各種の悪性腫瘍において認められる。MDM2プロモーターに存在する一塩基多型(SNP)が、p53遺伝子異常を伴うLi-Fraumeni症候群患者における悪性腫瘍の発生年齢に有意に影響を与
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えることが近年報告された。本研究では上咽頭癌で先述のSNPは上咽頭がん発症リスクに関与しないか検証し、また上咽頭がんの発症、病態、予後に影響を与えるかについて検証した。更に横断的に他の頭頸部癌患者でも解析を行った。<br />研究課題/領域番号:19791198, 研究期間(年度):2007-2008<br />出典：「MDM2プロモーター遺伝子多型の上咽頭がんに対する関与」研究成果報告書 課題番号19791198（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-19791198/19791198seika/)を加工して作成
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森, 厚文 ; Mori, Hirofumi
概要:
癌の診断、治療を目的とした放射性薬剤の開発を目的として、シグマレセプターをターゲットとした新規薬剤の開発を試みた。放射性ヨウ素標識ベサミコール誘導体([^(125)I]pIV)を作製し、担癌マウスを用いて[^(125)I]pIVの体内放射能
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分布を評価した結果、腫瘍へ高い放射能集積を示した。次に、治療用核種である^(131)Iを用い[^(131)I]pIVを作製し、治療実験を行った結果、[^(131)I]pIV投与群は、非投与群に比べ、腫瘍の増殖を抑制する傾向が観察され、本薬剤が有効である可能性が示された。<br />研究課題/領域番号:19591404, 研究期間(年度):2007-2008<br />出典：「シグマレセプター標的包括的癌治療法の確立を目指した新規放射性薬剤の開発と評価」研究成果報告書 課題番号19591404（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-19591404/19591404seika/)を加工して作成
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中本, 安成 ; Nakamoto, Yasunari
概要:
慢性肝炎から肝がんへ進展するB型肝炎ウイルス表面抗原のトランスジェニックマウスモデルを用いて、肝発がんの病態機序を解析するとともに、発がんを制御する分子のスクリーニングを進めた。検討結果は、以下のごとくである。1)肝発がんの病態の検討として
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、肝炎の誘導の際に行う各種の細胞免疫学的操作によって、前がん状態の異形性が変化し発がん率に違いが生ずることが分かった。異なるリンパ球分画によって誘導した慢性肝炎を観察したところ、CD8+Tリンパ球、CD4+Tリンパ球、B(CD19+)リンパ球の順に肝組織の異形性の程度、発がん率(それぞれ、86%、24%、0%)に寄与していることが明らかになった(Cancer Res.64:3326,2004)。2)これまで肝細胞障害に重要なFasリガンド(FasL)を介する経路を抑制すると、肝炎が軽快し発がんが著明に減少するという結果を得ているので(J.Exp.Med.196:1105,2002)、FasL抗体の投与による影響を約2万個の遺伝子解析が可能であるDNAチップを用いて検討した。抗体の投与によって352遺伝子(1.7%)の発現が有意に変動していた(P<0.05)。このうち機能が予測される遺伝子が190個認められた。なかでも、細胞死・増殖因子に関する遺伝子群の変動が4.7%と最も高率であった。3)発がんに関連する候補遺伝子の1例として、セリン・スレオニンキナーゼpim-3の解析を行うことによって、細胞増殖を促進しアポトーシス(細胞死)を抑制して肝がんの進展に関与していることが示唆された(Int.J.Cancer 114:209,2005)。これらの結果から、発がん病態の細胞免疫学的特徴が明らかになるとともに、発がん過程に関与する遺伝子のスクリーニングを継続することによって肝発がんの制御に有用な遺伝子が絞り込まれる可能性が示された。<br />Hepatocellular carcinoma (HCC) is a common complication of chronic viral hepatitis. Recently, we have reported that Fas ligand (FasL) is critically involved in the induction of chronic immune-mediated liver cell injury that increases HCC incidence (J Exp Med 196 : 1105, 2002) ; however, the molecular mechanisms potentially responsible for carcinogenesis are not well defined. In the current study, we asked the regulatory molecules in liver diseases that displayed different procarcinogenic potentials in a hpatitis B virus (HBV) transgenic mouse model. The results are summarized as follows.1)Transfer of CD8^+-enriched splenocytes caused prolonged disease kinetics and a marked increase in the extent of hepatocyte apoptosis and regeneration. In 12 out of 14 mice the transfer resulted in multiple hepatocellular carcinomas (HCCs) comparable to the manifestations seen in the mice transferred with total splenocytes. In contrast, mice that had received CD4^+-enriched cells demonstrated lower lev els of liver disease and developed fewer incidences of HCC (4 of 17). The experiment also revealed that all the groups of mice complicated with HCC developed comparable mean numbers and sizes of tumors. B cell depletion had no effect on disease kinetics in this model. (Cancer Res. 64 : 3326, 2004)2)During more than twelve months of disease progression, 352 (1.7 % of all) genes were expressed differentially between the mice treated with anti-FasL Ab and with PBS (P<0.05), 190 genes of which were assigned to functional groups based on Gene Ontology categories. In the gene groups of enzymes, cell communication, cellular components, signal transduction, and nucleic acid binding, the significant changes due to anti-FasL Ab treatment were observed in 43(1.6% of the gene group), 42(2.0%), 31(1.3%), 28(1.4%), and 22(1.8%) genes, respectively. In the cell communication group, high proportion (4.3%) of cell death control genes was involved in this expression dynamics.3)We identified several genes expressed differentially at the pre-malignant lesions. Among these genes, we focused on Pim-3, which is reported as a member of a proto-oncogene Pim family, but its contribution to hepatocarcinogenesis remains elusive. The mRNA expression was selectively detected in human hepatoma cell lines, but not in normal liver tissues. Pim-3 protein was also expressed in human hepatocellular carcinoma tissues and cell lines but not in normal hepatocytes. Moreover, cell proliferation was attenuated in human hepatoma cell lines, HepsB and HuH7, by RNA interference ablation of Pim-3 gene expression. (Int.J.Cancer 114 : 209, 2005)Taken together, these data suggest the molecular mechanisms potentially responsible for hepatocarcinogenesis and the future studies for the development of molecular targets.<br />研究課題/領域番号:15590631, 研究期間(年度):2003-2004<br />出典：「トランスジェニックマウスモデルを用いた肝発がん制御分子の研究」研究成果報告書 課題番号15590631 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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高, 栄哲 ; Koh, Eitetsu
概要:
前立腺癌細胞株(LNCaP,PC-3,DU145)を用いたステロイド代謝について、各ステロイドを基質にした薄層クロマトグラフィーによる分析結果、副腎ステロイドが、とりわけDHEAがステロイドプールとして大きく関与していることを平成11年度に
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明らかにした。また、アンドロゲン依存性前立腺癌株においてアンドロステンジオンからDHEAにいたる経路が優位に代謝しており、非依存性癌ではその逆の代謝活性を認めた。これらの現象の一部はステロイド代謝系におけるグルクロン酸抱合及び硫酸抱合がホルモン依存性に関与している可能性を示唆した。その代謝酵素のひとつであるglucuronosyltransferaseの発現の相違について明らかにし、その関与の可能性を検証した。これらの現象を分子生物学的に検討した結果、前立腺癌細胞株LNCaPにおいてはグルクロン酸抱合を触媒するglucuronosyltransferaseが強く発現しており、PC3,DU145において少ないことを見出した。平成12年度は、LNCaPに対してglucuronosyltransferaseの選択的なanti-sense oligomaやアンチセンスDNAを作製導入し、その増殖活性が抑制されるかどうか検討した。anti-sense oligoma導入し前立腺癌細胞の増額やステロイド代謝について検討したが、有意差をみとめなかったが、アンチセンスDNA導入によって、増殖活性の増加を抑制することを証明した。したがって、in vitro系であるが前立腺癌におけるアンドロゲン依存性は、アンドロゲン除去機構の低下がみられた結果であると結論できたが、その機構について今後の課題となった。<br />Adrenal androgens function as an androgen source within prostate and androgen target tissue. In this study, we compared the ability of three human prostatic cancer cell lines to metabolize the adrenal androgens, dehydroepiandrosterone (DHEA) and androstenedione in living cultured condition. Androgen-independent cell lines PC-3, DU145 and androgen-dependent cell line LNCaP were investigated. The effect of glucuronide and sulfate conjugates was also investigated. There is a strong tendency in PC-3 or DU145 to convert androstenedione to DHEA or DHEA-S reservoir. On the other hand, LNCaP is capable of converting DHEA into androstenedione and subsequently into dihydrotestosterone (DHT). Moreover, androgens were converted into a glucuronide conjugate in LNCaP, but not in PC-3 or DU145. As a result, the metabolism of the adrenal precursor shifted to androgen formation in LNCaP.This could be confirmed by means of reverse transcription-PCR of uridine diphospho-glucuronosyltransferase (UGT) 2B15. Kinetic properties of UGT activity in LNCaP revealed DHT to be a better substrate than testosterone for prostatic UGTs. In conclusion, our findings show that the adrenal precursor pool has the potential to contribute to the regulation of prostatic cells. Moreover, the presence of UGT activities in LNCaP may have a regulatory effect on the active androgen level in the intracellular environment.<br />研究課題/領域番号:11671542, 研究期間(年度):1999-2000<br />研究機関: 金沢大学医学部附属病院<br />出典：「前立腺癌細胞におけるステロイド代謝及びレセプター間のクロストーグに関する研究」研究成果報告書 課題番号11671542(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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金子, 周一 ; Kaneko, Shuichi
概要:
癌に対するバイオセンサー型DNAチップを作製するため、初年度は1)肝癌に関連する肝臓内の遺伝子の発現のパターンを明らかにすると同時に、その情報を用いてDNAチップを作製すること、2)このチップの情報を微少電極集積型バイオセンサーにて読みとる
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技術を開発することを目的とした。2年目以降はチップの開発をさらにすすめ臨床応用をめざすことを目的とした。肝細胞癌等を用いて、DNAチップにおける解析を行った。100例におよぶ臨床材料の解析から、従来の生化学所見や病理組織では得られなかった情報が得られ、DNAチップが新たな診断法のひとつになりうる可能性を示すことが出来た(Gastroenterology 2001)。また肝癌由来培養細胞および肝癌を用いて、新たな腫瘍マーカーの可能性、および分化度を推定する診断法になる可能性を示した(Hepatology 2001a, 2001b)。serial gene expression analysis(SAGE)法を行い、包括的な遺伝子発現のプロファイルを作製し(BBRC 2000, 2001)、世界最大の肝臓発現遺伝子データベースを有することが出来た。一連の成果から、C型慢性肝炎の薬剤反応性をDNAチップで検査する方法を開発し、臨床検査試薬として平成14年に発売した。微小電極を用いて、液層における反応系を考案し、目的とする核酸の測定を可能とした(平成13年特許出願)。微小電極測定に導入するため小型のサーマルサイクラーを開発し、特許出願した(平成12年)。基盤上の微小な金属電極にDNAをスポットする装置を開発した(特許出願準備中)。これらの研究をもとに微小電極を用いた核酸測定系を開発した(特許出願準備中)。このバイオセンサー型DNA測定系は、臨床の現場で使用することを目的とし、小型で安価、かつ迅速に試料を測定できるものが作製された。<br />Development of a biosensor-type-DNA chip for the diagnosis of cancer is an objective of this research. To attain this objective, two lines of research projects were designed.For the first line of the project, we systematically examined expression profiles in the liver with various diseases including hepatocellular carcinoma. Over one hundred clinical materials were analyzed with home-made DNA chips, and the expression profile in each disease was demonstrated. This study revealed that a DNA chip analysis gives new information that cannot be obtained by routine biochemical and pathological examinations, and made the DNA chip be a new diagnostic technique, or a new tumor marker. Using serial analysis of gene expression (SAGE), over 300,000 expressed tags in the liver were obtained and deposited into databases. A DNA chip, which predicts the efficacy of drugs against chronic hepatitis C, was put on the market.Another line of the project is to make a biosensor-type-DNA chip, which can be used in routine clinical settings on site. Using microelectrodes on a chip, target nucleic acids can be measured in liquid (applied for a patent in 2001). A small-size thermal cycler for the introduction of measurement on microelectrodes was developed (applied for a patent in 2000). A DNA spotter on a microelectrode was also developed (pending for a patent). Using these successive developments, a biosensor-type-DNA chip, which is small-size, less expensive compared with former laser-detection-type DNA chips, and faster for the clinical diagnosis, was made.<br />研究課題/領域番号:11794017, 研究期間(年度):1999-2001<br />出典：「癌に対するバイオセンサー型DNAチップの開発」研究成果報告書 課題番号11794017(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
テロメラーゼは抗がん剤研究の有力な標的である。本年度、FLAG標識hTERT発現HeLa細胞のヒトテロメラーゼ複合体とhTERTと相互作用するヌクレオリンの生物的機能の解析(村上)、hTERT発現による不死化ヒト初代細胞系の解析(本多)、更
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に細胞の増殖・分化などに重要な役割を担う受容体型チロシンキナーゼの解析(善岡)を行った。得られた主な結果は、1)HeLa細胞にFLAG-hTERTを導入して得られた活性型組み換え型テロメラーゼは、昆虫細胞系2成分発現ヒトテロメラーゼ複合体と類似して、分子篩法で2種類の複合体(IとII)に分画された。Hsp90を含まず、Hsp90阻害剤に耐性の複合体Iと、Hsp90を含む後者の複合体IIは、Hsp90阻害剤に感受性を示し内在性及びFLAG標識hTERTは共に不安定であった。また内因性hTERTとFLAG-hTERTの大半は複合体Iに分布した。ヌクレオリンが複合体Iに含まれ、複合体IIには殆ど含まれない。これらの結果は、細胞内で異なる2種類の活性型テロメラーゼ複合体が存在し、テロメラーゼの異なる局在或いは活性型テロメラーゼの異なる機能を示唆した。2)hTERT発現レトロウイルスベクターをヒト正常線維芽(BJ)細胞に感染させ、hTERT発現細胞が不死化した細胞株を樹立した。ジーンチップ解析では、hTERT導入不死化BJ細胞ではBJ細胞に比較し、細胞増殖、細胞周期に関与する因子の発現亢進が認められた。3)hTERTと特異的に相互作用するヌクレオリンは、C型肝炎ウイルス(HCV)複製に必須であることが、ヌクレオリン結合性を消失したHCV NS5B変異を持つHCVサブレプリコン系ではHCV複製が全く起きないことと、RNAi法でヌクレオリン発現が低下した細胞では、HCV複製が大きく低下する結果により示された。<br />Since telomerase activity is barely detectable in primary cells but clearly detected in cancerous cells, telomerase has been considered to be a strong candidate of the targets to cancer treatment In the fiscal year, we concentrated in several experiments including purification and characterization of recombinant human telomerase complex, and biological function of the specific interaction of nucleolin and hTERT recovered from a HeLa cell line stably expressing FLAG-hTERT (Murakami), analyses of human primary cells immortalized by hTERT (Honda), and the tyrosine kinases of receptor type which play critical odes in cell proliferation and differentiation (Yoshioka). The followings are the main conclusions of the experiments.1) The partially purified active telomerase complexes comprise two different complexities, complex I (around 680 kDa), and complex II (around 400 kDa), that are quite alike to those that can be recovered firm the insect cells co-expressing FLAG-hTERT and hTERC. The com plex I does not contain Hsp90 and is resistant to Hsp90 inhibitors, whereas complex II contains Hsp90 and is sensitive to Hsp90 inhibitors. Human TEAT in the complex II is rather unstable during incubation in vim and in ring. Such unstable property was not observed with the complex I. Since MG132, a specific proteasome inhibitor, but not MG133, a negative control, stabilized hTERT in the complex Z strongly suggesting that hTERT in the complex If is under degradation pathway under the control of proteasome. The two different complexities of human telomerase seem to imply two different entities of active telomerase in different subcellular localization or its different functions. 2) We have established a cell line of the human primary fibroblasts(BJ cells) stably expressing hTERT, and we compared expression profiles of RI cells and the KJ cells immortalized by MERE Some genes involving in cell cycle progression and cell proliferation were evidently expressed higher in the immortalized 131-hTERT than these in in the primary cells. 3) Nucleolin, one of the specific interacting partners of hTERT can bind to Hepatitis C Virus (HCV) NS5B, RNA-dependent RNA replication of HCV. We evaluated the role of the specific interaction of nucleolin and NS5B in HCV replication. The HCV subreplicon system has been applied for the address We found that the HCV subreplicons harboring alanine substitution mutations or mutation at the residue(s) either one of two critical sequences within NS5B both of which are necessary for the nucleolin-binding could not replicate at all in a transient HCV replication system in HepG2 ml/s., although the wild replicon could support efficient HCV. By introducing transiently RNAi of nucleolin, that down regulated expression of nucleolin by half to one third, reduced HCV evidently reduced HCV replication using the HCV subreplicon system. Taken together, the specific interaction of nucleolin and NS5B is critical for HCV replication.<br />研究課題/領域番号:17390091, 研究期間(年度):2005-2007<br />出典：「テロメラーゼの細胞内局在と活性制御」研究成果報告書 課題番号17390091 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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大熊, 勝治 ; Ohkuma, Shoji
概要:
本研究は、新規H^+/CΓシンポーターであるプロジギオシン類のアポトーシス誘導機構解明に当たり、これまで殆ど注目されてこなかったオートファジーの役割を、体細胞遺伝学的・分子生物学的に明らかにしようとした。先ず、(1)プロジギオシン類のアポト
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ーシス誘導機構を、オートファジーに注目して解明、動物細胞オートファジー関連遺伝子の同定を目指し、(2)CHO細胞を用いてオートファジー突然変異体を単離、(3)酵母オートファジー関連遺伝子の動物細胞ホモローグを単離、(4)オートファジーに伴って発現量の変動する遺伝子・蛋白資を同定。動物細胞オートファジー関連遺伝子が単離された暁には、(5)アポトーシスに伴うオートファジー関連遺伝子の動態を解明、(6)アポトーシスにおけるオートファジー関連遺伝子機能を、トランスフェクタント(ドミナント・ネガティブ体の強制発現等を含む)作成を通じて解明。平行して、(7)各種癌細胞に対する、H^+/Γシンポーターのアボトーシス誘導型制癌剤の可能性を追及、した。先ず、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いて、Wortmannin,3-methyladenine他の各種選択的阻害剤を用いて解明する系を確立した。次に"プロジギオシン類H^+/CΓシンポーターの、オートファジー・アポトーシス制御における働きを、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いて、蛍光を指標として生化学的・細胞生物学的に解析した。同時に、細胞内pH測定を通じて、H^+/Cγシンポーターのどのような活性が関与するかを解析した。その結果、PC12細胞の分化誘導とアポトーシス誘導にはオートファジー自体は関与していないことが示唆された(日本薬学会発表)。また、体細胞分子遺伝学的にオートファジー変異体の単離を目指して、CHO細胞を用いて実験系を確立した。今後、(毒素等を利用した)細胞生存率と、強制発現させたGFP蛋白質の分解異常を指標とし、フローサイトメトリー・セルソーター法を主に使い、動物細胞のオートファジー変異体を選択したい。リソソーム膜融合反応に必要なシンタキシン・ホモローグの単離・同定には成功しているが、それがオートファゴソームとリソソームの膜融合に必須であるか否かは決定出来ていない。酵母遺伝子のヒトホモログ釣りは成功し、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いてドミナントネガテイブ体を作成し、その遺伝子産物の動物細胞オートファジーにおける役割を解明した(投稿準備中)。また、一次元・二次元電気泳動法等を用いて、オートファジーに伴い量的に変動する蛋白質を単離・同定。現在、各種処理で誘導されるタンパク質に差を見い出している(投稿準備中)。更に、種々の合成化合物について、H^+/CΓシンポーターとして満たすべき構造を検討している。ヌードマウスに移植した膵癌由来細胞に対して、プロジギオシン類似体H^+/CΓシンポーターも制癌効果を示すことを見い出している(投稿準備中)。<br />In this project, we have investigated the role of autophagy in the induction of neurite outgrowth (NOG), growth inhibition and apoptosis by a new type of H^+/CL^- symporting antibiotics like prodigiosins.We found the followings: (1) Prodigiosins, like bafilomycins, inhibited pancreatic cancer transplanted into nude mice. (2) Prodigiosins also induced apoptosis and NOG in RNA_-, protein-syntheses, and serine/threonine kinase-dependent manners, and K_-252_<a-> or A_-kinase-independent manners, but induced apoptosis differently from NOG in its in-sensitivity to tyrosine phosphates inhibitors. (3) E-58591, a prodigiosin-like tambjamine antibiotics, also showed H^+/CL^- symport activity and strongly inhibited spleen cell immune responses, gastric acid secretion and inhibited osteoclastosis and induced NOG at higher concentrations. (4) We have succeeded in the synthesis of affinity probe for concanamycins (analogs of bafilomycins) and showed concanamycin-induced NOG from outside of plasma membranes. (5) 3-Methyladenine, and inhibitor against autophagy, did not induce apoptosis in the presence of serum, suggesting little participation of autophapy on the bafilomycin-induced apoptosis. (6) We isolated human-homologs of autophagy-related genes from HeLa cells. They showed cell death of CHO in the absence of amino acid- or serum-free medium. (7) We established a system to look into degradation of GFP-labeled organelles (mitochondria and peroxisomes). (8) We showed that apoptosis and NOG was not induced by pH-differences between inside and outside of cells, because they were not induced by NH_4Cl. (9) Prodigiosins also strongly and reversibly uncoupled (H^+/K^+) ATPase-dependent proton-translocation from rabbit gastric mucosa. (10) We have succeeded in the cloning, proton pump-dependent ATP synthesis, and determation of operon structure of V-ATPase from a eubact rium (Thermus termophilus).<br />研究課題/領域番号:11470483, 研究期間(年度):1999-2001<br />出典：「新規H^+/Cl^-シンポーターによるオートファジー・アポトーシス制御機構」研究成果報告書 課題番号11470483(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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森, 厚文 ; Mori, Hirofumi
概要:
金沢大学学際科学実験センター<br />本研究では、癌を対象とした分子イメージング薬剤並びに分子イメージングによる治療モニタリング法の開発を目的とした。そこで、まず、新規分子イメージング薬剤としては、種々の癌に発現が確認されているシグマレセ
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プターをターゲットとして、シグマレセプターに高い親和性を有する薬剤開発に関する基礎的研究を行った。これまでに、ベサミコールがシグマ受容体に高い親和性を持つことが報告されていることから、ベサミコールを基本骨格として新規シグマ受容体リガンドを探索した結果、ベサミコール誘導体の(+)の光学活性体で、ベサミコール誘導体のフェニルピペリジン部分のパラ位にヨウ素を導入した化合物がシグマ受容体に対して高い親和性を示した。そこで、放射性ヨウ素標識体の前駆体となりうるトリブチルスズ体であるp-トリブチルスズベサミコールの合成行い、総収率15.1%で合成した。また、p-トリブチルスズベサミコールから高収率で、[^<125>I]pIVを高収率で得ることに成功し、シグマレセプターが発現している腫瘍の診断剤としての可能性が示された。一方、分子イメージングによる治療モニタリング法としては、担癌マウスに化学療法や血管新生阻害治療を施した際の^<99m>Tc-MIBI、^<99m>Tc-HL91といったトレーサーの腫瘍への集積の変化についての研究を行った。その結果、^<99m>Tc-MIBIの集積は化学療法によって治療前に比べて減少し、^<99m>Tc-HL91の集積は増加した。それに対して、血管新生阻害治療時には治療前と治療後でトレーサーの腫瘍への集積に有意な差は観察されなかった。これら結果により、血管新生阻害治療効果をトレーサーで評価する場合、化学療法の治療効果評価とは異なった見方をすべきであることが示された。<br />Fvourable effects of cytotoxic chemotherapy for tumours are characterized by the reduced accumulation of radiotracers such as ^<99m>Tc sestamibi (MIBI). Antiangiogenic therapy is primarily cytostatic consequently, its influence on tracer accumulation may differ from that of cytotoxic treatments.Ati-angiogenic therapy employing 2-methoxyestradiol was administered in mice bearing subcutaneous xenografts of LS180 colon cancer cells. The effects of chemotherapy with 5-fluorouracil were examined as a cytotoxic counterpart. Treatments were conducted for 4 days from day 8. Distribution of ^<99m>Tc-MIBI and ^<99m>Tc-HL91, a hypoxic marker, was observed on days 8 and 12. Oxygen tension (PO_2) in tumours was measured by a microelectrode. Cellular uptake of tracers was examined in vitro in normoxic and hypoxic conditions.^<99m>Tc-MIBI accumulation decreased with increasing tumour weight when no treatment was conducted. Tumour growth was suppressed by anti-angiogenic therapy and chemotherapy. ^<99m>Tc-MIBI accumulation in tumours decreased after chemotherapy as compared to pretherapeutic values, whereas accumulation of ^<99m>Tc-HL91 increased. In contrast, accumulation of tracers did not significantly change after anti-angiogenic therapy as compared to that observed pre-therapeutically. Tumour PO_2 decreased with increasing tumour volume when no treatment was conducted. Chemotherapy reduced PO_2 in tumours. PO_2 in tumours treated with anti-angiogenic therapy was as high as that observed before treatment. 2-Methoxyestradiol or 5-fluorouracil did not significantly affect tracer accumulation in cells under both normoxic and hypoxic conditions in vitro.These findings indicate that scintigraphic assessment of therapeutic efficacy of anti-angiogenic therapy should be performed from a perspective distinct from that of cytotoxic treatment.<br />研究課題/領域番号:16591193, 研究期間(年度):2004 – 2006<br />出典：「分子イメージングによる「がん治療指針・効果予測」に関する基盤的研究」研究成果報告書 課題番号16591193（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-16591193/165911932006kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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京, 哲 ; Kyo, Satoru
概要:
金沢大学大学院・医学系研究科<br />我々は細胞の不死化過程に関わるとされるテロメレースをターゲットにした遺伝子治療の戦略をたて、これを婦人科癌の遺伝子治療に応用することを試みた。まずテロメレースの構成成分であるhuman telomer
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ase RNA(hTR)をターゲットとしてこれに対するantisense DNAを合成し、その5'端に2-5Adenylate(以下2-5A)を付加したキメラ合成DNAによる癌の遺伝子治療の基礎実験を試みた。2-5AはRNAse Lのactivatorであり、antisense sequenceによって会合したtarget RNAをRNAse Lの活性化により分解することが期待される。子宮頚癌細胞であるME180 cellに2-5A anti-hTRをlipofectionにより導入し、hTRの発現を観察したところ、hTRは25-48時間で効率的に分解された。さらにテロメレース活性もそれに引き続いて低下し、細胞増殖も抑制された。細胞増殖抑制の原因としてflow cytometryの解析によりアポトーシスが誘導されていることが判明した。現在アポトーシス誘導機構の解析を行うとともに、動物実験でのin vivoの効果についても検討中である。また我々はテロメレースの酵素活性を担うhuman telomerase reverse transcriptase(hTERT)のプロモーターをクローニングし、これが極めて癌特異性が高いことを報告してきたが、このプロモーターを様々なアポトーシス誘導遺伝子とともにベクターに組み込み、in vitroおよびin vivoでの癌増殖抑制効果を検討した結果、本プロモーターを組み込んだベクターが極めて癌特異性の高い治療用ベクターをなり得ることが確認された。<br />We established novel methods that inhibit telomerase activity in cancer cells using 2-5Adenylate-linked antisense DNA against human telomerase RNA component (hTR). This antisense DNA effectively blocked telomerase activity in cervical cancer ME180 cells. Growth of ME180 cells in vitro was significantly inhibited by the treatment with 2-5A anti-hTR. Surprisingly, inhibition of cell growth was observed in 24-48 hr after treatment, quite earlier than expected. Telomere length was not shortened in this short period. These findings suggest that blockade of telomerase led to cell growth inhibition via telomere-independent mechanisms. We confirmed that growth inhibition of cells by the treatment with 2-5A anti-hTR was due to induction of apoptosis. The further anaylsis of mechanisms how 2-5A anti-hTR induces apoptosis is on going.We also established novel vector system for cancer gene therapy. We previously cloned promoter of human telomerase reverse transcriptase (hTERT), which is highly specific to cancer cells. We thus used this promoter for cancer-specific gene expression in gene delivery system. Various apoptosis-inducible genes, such as caspase-8 and FADD, were combined with hTERT promoter and used as vectors for cancer gene therapy. Introduction of these vectors effectively induced apoptosis of cancer cells but of surrounding normal tissues.<br />研究課題/領域番号:13557138, 研究期間(年度):2001 – 2002<br />出典：「婦人科癌をターゲットにした新たな遺伝子治療の戦略」研究成果報告書 課題番号13557138（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-13557138/135571382002kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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絹谷, 清剛 ; Kinuya, Seigo
概要:
1.副作用の少ないアイソトープ内用療法を行うために、ビオチンに高い親和性を有するアビジンとエンドサイトーシス機構により治療核種標識ビオチンの細胞内移行が可能なスカベンジャー受容体を融合したタンパク質(アビジン・スカベンジャー受容体複合タンパ
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ク質;スカビジン)の構築を行った。融合タンパク質を構築するためには、それぞれの遺伝子をクローニングしてくる必要がある。まず、ヒトスカベンジャー受容体(hSR-A-II)のクローニングを行った。THP-1細胞(ヒト単球性白血病細胞)に12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acet ateを負荷し、トータルRNAの抽出を行った。次に、hSR-A-IIを認識するプライマーを用いてPCRによりhSR-A-II cDNAを増幅した。PCR産物のアガロース電気泳動を行い、予想されるバンドを切り出し、精製キットを用いてPCR産物の精製を行った。このPCR産物を用い、StrataClone PCR cloning Kitを使って、hSR-A-II cDNAのクローニングを行った。いくつかのシングルコロニーを選択し、制限酵素処理を行った後にPCR産物の導入の確認を行った。導入が確認されたコロニーに対し、シークエンス反応を行い、hSR-A-II cDNAであることを確認した。アビジンのクローニングは、ニワトリの卵管からトータルRNAを抽出した後、hSR-A-IIのクローニングと同様の方法で行い、シークエンスにより確認を行い、アビジンcDNAを得た。アビジンcDNAをhSR-A-II cDNAと融合させる部位については、hSR-A-IIのエンドサイトーシス機能を保持するために、hSR-A-IIのコラーゲン様ドメインとN結合糖鎖領域の間にアビジンcDNAを導入することを計画した。そのためには、hSR-A-II cDNAの813番目の塩基をチミンからシトシンに変換する必要がある。この点変異によりこの部分のアミン酸が変化することはなく、hSR-A-IIの機能を保持できると考えている。2.内用療法の効果・毒性に深く関与する放射性核種選択に関わる検討を行った。^<186>Reが^<131>Iに比べ、治療効果・毒性の双方において優位であることが明らかとなった。3.癌治療における治療前効果予測は、近い将来可能となるであろういわゆるテイラーメイド医療に深く関わっている問題である。^<99m>Tc-sestamibi等によるシンチグラフィ効果予測に関わる因子を検討した。<br />1. We aimed to develop effective non-toxic targeted radiotherapy for malignant tumors. A complex of avidin that has intense binding affinity to biotin and scavenger receptors that would internalize radiolabeled biotin into cells via endocytosis processs. In order to attain this complex named Scavidin, genes determining each molecules were cloned. That is hSR-A-II for human scavenger receptor. Total RNA fraction was extracted from human monocytic leukemia cells, THP-1, after loading 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate. hSR-A-II cDNA was amplified by PCR. Avidin cDNA was similarly cloned from materials of fallopian tubes of chicken. A complex coding Scavidin was then obtained by inserting avidin cDNA so that endocytotic functions of hSR-A-II would not be destroyed.2. Characteristics of radionuclides labeled to targeting molecules extremely affect both effectiveness and toxicity of targeted radiotherapy. Superiority of targeted radiotherapy with ^<186>Re to that with ^<131>I was determined in animal models bearing colon cancer metastases.3. Pre-therapeutic prediction of therapeutic outcomes is a key for so-called tailor-made management of cancer patients ; therefore, scintigraphic assessment with a cationic compound, "mTc-sestamibi, was investigated.<br />研究課題/領域番号:16591194, 研究期間(年度):2004-2006<br />出典：「癌細胞膜アビジン発現とスカベンジャー受容体内在化による特異的普遍的内照射法の開発」研究成果報告書 課題番号16591194 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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