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清木, 元治 ; Seiki, Motoharu
概要:
金沢大学がん研究所<br />1、各種のマトリックスメタロプロテイナーゼに対する単クローン抗体で胃癌組織を調べることにより、72-kDaと92-kDa type IV collagenaseの発現は共に初期癌では認められず進行癌でのみ高頻度
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(65%)に起こることを示した。一方で、collagenaseの発現は初期から高頻度の発現を示した。2、92-kDa type IV collagenaseの発現誘導機構についてプロモーターの解析から、以下の点を明らかにした。炎症性サイトカインとv-Srcに代表されるシグナルによってそれぞれ独立に制御される。v-Srcシグナルによる誘導を受けるかどうかは細胞によって異なるがそれはプロモーター中のRCE(Rb control element)への結合活性の有無によって決まる。3、胃癌細胞を正所移植すると組織の線維芽細胞の産生するTGF-bによって癌細胞による72-kDaと92-kDa type IV collagenaseの発現が誘導され、転移能が昂進する。TGF-bの作用は細胞によって異なるがそれを決定する因子の一つとしてRbの欠失があることを明らかにした。所見:本研究班は今年で最終年度を迎える。この3年間で癌細胞の浸潤に関わる様々な細胞外マトリックスの分解酵素に関する情報が遺伝子から組織レベルで蓄積した。癌細胞の浸潤制御を可能にする標的分子としてどの細胞外マトリックス分解酵素が妥当かを決めることが今後の問題である。<br />研究課題/領域番号:05151027, 研究期間(年度):1993<br />出典：「がん細胞の浸潤性獲得の分子機構」研究成果報告書 課題番号05151027（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-05151027/）を加工して作成
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清木, 元治 ; Seiki, Motoharu
概要:
金沢大学がん研究所<br />清木班員はヒト胃癌細胞株を用いて実験的にマトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)の活性発現が必須であることを特異的インヒビターであるTIMP-1遺伝子導入実験により示した.同時に、TIMP-1発現の低下が悪性形
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質発現の一因となることも示された.岡田班員はヒト骨肉腫OST細胞、ヒト単球様細胞U937を用いて細胞の浸潤能および転移能の発現とIV型コラーゲナーゼ(MMP-9)の発現との相関が高いことを示した.中島班員は腎臓癌細胞KG12がヌードマウスへの正所移植では転移するが異所である皮下からは転移しないことを示した.組織由来の線維芽細胞が産生するTGFbがKG12細胞のIB型コラーゲナーゼおよびウロキナーゼ産生と浸潤能発現の制御因子であることを明らかにした.浸潤・転移能に関連して重要性が示されたMMP-9遺伝子発現制御機構を解析することにより、佐藤班員はTPA、TNFaとc-Srcを介するシグナルがそれぞれ独立にMMP-9の伝写を制御していることを明らかにした.MMP以外の浸潤能に関する細胞外マトリックス分解酵素として宮崎班員は胃癌細胞株からトリプシン1を精製し、同定した.早川班員はもう一つのMMPインヒビターであるTIMP-2に対する単クローン抗体を作成し、サンドイッチELISA法による測定系を確立した.木村班員は転移抑制遺伝子として報告されたNKPキナーゼ(NM23)遺伝子の二つのアイソフォームをラットからcDNAと対応する染色体遺伝子として単離し、その構落を明らかにした.また、ラット高転移性乳癌細胞での発現低下を確認した.谷口班員はbmアクチンの転移の抑制活性が細胞運動の抑制と相関しすることを明らかにした.若い研究者伊藤君は大腸癌でMMP-7の発現が特異的に見られること丹田君は血管作動薬による腫瘍組織血流量の増加が化学療法剤の効果を増強することを見いだした.<br />研究課題/領域番号:04151024, 研究期間(年度):1992<br />出典：「がん細胞の浸潤性獲得の分子機構」研究成果報告書 課題番号04151024（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-04151024/）を加工して作成
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清木, 元治 ; Seiki, Motoharu
概要:
金沢大学がん研究所<br />がん細胞の浸潤能に関係する因子としてメタロプロテア-ゼとTIMPに着目し、まずは報告された遺伝子配列に基づいて72kDa,92kDaIV型コラ-ゲナ-ゼ、ストロムライシン、TIMPのcDNAクロ-ンをPCR法で
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単離した。また、TIMP関連蛋白質の部分的アミノ酸配列を入手し、これを基に合成DNAプロ-ブを調整して新しいTIMP遺伝子のcDNAをクロ-ニングした。しかし、これは本年、L.Liottaらが報告したTIMPー2と同一であることが判明した。上記のcDNAをプロ-ブとして用いて、様々ながん遺伝子でトランスフォ-ムしたNIH3T3細胞の転移・浸潤能との関連を調べた。1、転移能は鶏卵法を用いて調べた。ヌ-ドマウスによる実験的転移能の解析で報告されている結果と一致して、ここでもrasトランスフォ-マントがもっとも強い転移能を示し、src,fos,ablもrasほどではないが明らかに造腫瘍性と転移能を増加させた。2、ノ-ザン法でメタロプロテア-ゼ、インヒビタ-の発現を調べると、親株のNIH3T3で既に72kDa,92kDaコラ-ゲナ-ゼ、ストロムライシンが発現しており、細胞の転移能との相関は認められなかった。TIMP,TIMPー2の発現量にもトランスフォ-メ-ションや転移能と相関した変化はなかった。3、前年度にrasトランスフォ-マントではAutocrine Motility Factorの産生が昂進していることを報告した。本年度の結果と合わせて考えると、ras遺伝子による高転移性のNIH3T3細胞では浸潤性の昂進は細胞外マトリックスの分解能の昂進よりもむしろ運動性の昂進によって引き起こされていると考えられる。<br />研究課題/領域番号:02152041, 研究期間(年度):1990<br />出典：「癌遺伝子rasによる高転移性獲得過程の分子生物学的解析」研究成果報告書 課題番号02152041（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-02152041/）を加工して作成
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清木, 元治 ; Seiki, Motoharu
概要:
金沢大学がん研究所<br />癌の転移は癌患者の死因の大半を占めている。しかし、転移を防ぐ有効な方法は未だ確立されていない。その原因の一つは、転移の成立過程は複雑であり、その成立機序の解析が困難であったことによる。本研究では癌細胞の転移能と
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良く相関している基底膜の浸潤能のステップに焦点を絞って解析を進めた。用いた細胞はNIH3T3であり、ras癌遺伝子の導入によって高転移性にトランスフォームした細胞での変化を調べた。癌細胞の運動性の昂進は、基底膜を破壊しながら通過する際に必要とされる性質である。ras癌遺伝子の導入による細胞の運動性昂進の機序に着目して以下のことを明らかにした。1、ras遺伝子の導入によって自らの運動性を刺激するAutocrine Motility Factor(AMF)の産生が昂進していた。2、AMFに対する反応性にはras遺伝子の導入によって変化がないことから、運動性の昂進はAMFの産生量の増大によると結論される。3、AMFはクロマトグラフ的に単一成分からなる。4、ヒトメラノーマで最初のAMFが報告されているが、それとは見かけの分子量や安定性などの点で異なる。5、NIH3T3のAMFとヒトメラノーマ細胞のAMFの作用はGタンパク・インヒビターに対する感受性が異なること、また二つのAMFがそれぞれの細胞に対して相加的に働くことから細胞の受容体も異なると考えられる。以上のことから、rasトランスフォーマントでもAutocrineの機構で運動性の昂進が引き起こされていることが明らかになった。<br />研究課題/領域番号:01015032, 研究期間(年度):1989<br />出典：「癌遺伝子rasによる高転移性獲得過程の分子生物学的解析」研究成果報告書 課題番号01015032（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-01015032/）を加工して作成
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滝野, 隆久 ; Takino, Takahisa
概要:
HT1080細胞のI型コラーゲンおよびファイブロネクチン(FN)上での細胞運動はMMP阻害剤BB94により抑制され、ECM分解の減少、細胞接着斑の過形成と運動極性の喪失が認められた。一方、MT1-MMPの過剰発現はECM分解、細胞運動と細胞
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接着斑の代謝回転を誘導し、阻害変異体の発現でその抑制が認められた。HT1080細胞のBB94処理は細胞接着により誘導されるERK活性化を抑制した。以上の結果からMT1-MMPは細胞接着により誘導されるERK活性化を調節することにより細胞接着斑の代謝回転と細胞運動を制御していることが示唆された(T. Takino et al., Experimental Cell Research,2006)。 細胞運動時、MT1-MMPは細胞接着斑の集積と代謝回転が頻繁に起こる運動先端部の内側でECMを分解していた。細胞接着斑におけるMT1-MMPの機能に着目し、FAKの細胞接着斑標的ドメインをMT1-MMPとMT1-MMPの阻害変異体に付与し、細胞接着斑におけるMT1-MMPの役割を解析した。細胞接着斑に標的したMT1-MMPはFNへの接着後、迅速に細胞接着斑でFNを分解した。 細胞接着斑に標的したMT1-MMPの阻害変異体はMT1-MMP発現細胞におけるFN分解と細胞運動、3次元ECMへの細胞浸潤を顕著に抑制した。以上の結果から、細胞接着斑におけるMT1-MMP機能の重要性と、その活性阻害ががん浸潤・転移抑制に効果的であることが示された(T. Takino et al., Cancer Research, 2007)。<br />Membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) has been implicated in tumor invasion and metastasis. We previously reported that extracellular matrix degradation by MT1-MMP regulates cell migration via modulating sustained integrin-mediated signals. In this study, MT1-MMP-expressing cells were plated onto fibronectin-coated plates and monitored for cell-matrix adhesion formation and fibronectin degradation. The fibronectin was degraded and removed in line with the cell migration track. The migrating cells showed a polarized morphology and were in contact with the edge of fibronectin through the leading edge in which cell-matrix adhesions are concentrated. Expression of MT1-MMP targeted to cell-matrix adhesions by fusing with the focal adhesion targeting (FAT) domain of focal adhesion kinase (FAK) promoted the initial fibronectin lysis at the cell periphery immediately after adhesion. These results suggest that fibronectin is degraded by MT1-MMP located at cell-matrix adhesions which are concentrated at the leading edge of the migrating cells. lb inhibit MT1-MMP at cell-matrix adhesion, the dominant negative form of MT1-MMP (MT1-Pex) was targeted to the cell-matrix adhesion by fusing with the FAT domain (MT1-Pex-FAT). MT1-Pex-FAT accumulated at cell-matrix adhesions and inhibited fibronectin degradation as well as FAK phosphorylation more effectively than parental MT1-Pex. MT1-Pex-FAT was also shown to suppress the invasion of tumor cells into 3-dimensional collagen gel more strongly than MT1-Pex. These results suggest that MT1-MMP-mediated extracellular matrix lysis at cell-matrix adhesions induces the establishment of cell polarity, which facilitates cell-matrix adhesion turnover and subsequent cell migration. This model highlights the role of MT1-MMP at the leading edge of migrating cells.<br />研究課題/領域番号:18590287, 研究期間(年度):2006–2007<br />出典：「JNK結合分子による細胞接着斑と運動極性形成制御機構の解析」研究成果報告書 課題番号18590287 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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滝野, 隆久 ; Takino, Takahisa
概要:
FAK活性はJSAP1とp130casの共発現により増強され、その結果JSAP1とp130casのリン酸化を亢進した。JSAP1をグリオーマ細胞株U87MG細胞に遺伝子導入するとJNKのリン酸化が誘導され、fibronectin(FN)上で
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の細胞運動が亢進された。しかし、JNK結合部位を欠質したJSAP1変異体発現では細胞運動の亢進は認められなかった。JSAP1を遺伝子導入した細胞の運動先端部にJNKとJSAP1の集積が認められ、細胞運動はJNK阻害剤により抑制された。また、脳腫瘍組織を用いてMAPK足場蛋白(JIP-1,-2,JSAP1)のmRNA発現を検討した結果、JSAP1の発現と悪性度に正の相関が認められた。JSAP1は運動細胞の先端部にJNKを誘導し、FAKを介したJNK活性化経路を亢進することにより細胞運動を調節していると考えられた。 また、HT1080細胞のI型コラーゲンおよびFN上での細胞運動はMMP阻害剤BB94により抑制され、ECM分解の減少、細胞接着斑の過形成と運動極性の喪失が認められた。一方MT1-MMPの過剰発現はECM分解、細胞運動と細胞接着斑のturnoverの亢進を誘導し、dominant-negative体の発現でその抑制が認められた。HT1080細胞のBB94処理は細胞接着により誘導されるERK活性化を抑制する一方で、FAKの自己リン酸化(チロシン397番)を亢進していた。以上の結果からMT1-MMPは細胞接着により誘導されるERK活性化、FAKの自己リン酸化を調節することにより細胞接着斑、細胞運動を制御していることが示唆された。 細胞運動時の極性形成・維持機序は方向性を持った細胞運動およびその延長線上にあるがん浸潤・転移の機構を解明する上で重要である。JNK結合分子は細胞接着斑におけるJNKの局在と活性化部位を誘導することで細胞運動時の極性形成・維持を制御していると予想される。また、MT1-MMPによるECMの分解・再編をともなった微小環境の整備が細胞極性形成・維持に密接に関与していると推測される。ECMにおける極性を有した細胞運動とMT1-MMP活性発現の協調的な制御機構を解明することは、がんの浸潤・転移阻止の標的分子の同定、薬剤開発に貢献できるものと思われる。<br />JNK/SAPK-associated protein 1(JSAP1) mediated an association between focal adhesion kinase (FAK) and JNK, which was induced by either co-expression of Src or attachment of cells to fibronectin (FN). Complex formation of FAK with JSAP1 and p130 Crk-associated substrate (p130^<Cas>) resulted in augmentation of FAK activity and phosphorylation of both JSAP1 and p130^<Cas>, which required p130^<Cas> hyperphosphorylation and was abolished by inhibition of Src. JNK activation by FN was enhanced by JSAP1, which was suppressed by disrupting the FAK/p130^<Cas> pathway by expression of a dominant-negative form of p130^<Cas> or by inhibiting Src. JSAP1 was co-localized with JNK and phosphorylated FAK at the leading edge and stimulated of cell migration, which depended on its JNK binding domain and was suppressed by inhibition of JNK. The level of JSAP1 mRNA correlated with advanced malignancy in brain tumors, unlike other JIPs. We propose that the JSAP1/FAK complex functions cooperatively as a sc affold for the JNK signaling pathway and regulator of cell migration on FN, and we suggest that JSAP1 is also associated with malignancy in brain tumors.MT1-MMP expression promoted FN-induced cell migration, which was accompanied by FN degradation and reduction of stable focal adhesions, which function as anchors for actin-stress fibers, and attenuated integrin clustering. The attenuation of integrin clustering was abrogated by MT1-MMP inhibition. When cultured on fibronectin, HT1080 cells, which endogenously express MT1-MMP, showed so-called motile morphology with well-organized focal adhesion formation, well-oriented actin-stress fiber formation and the lysis of FN through trails of cell migration. Inhibition of endogenous MT1-MMP resulted in the suppression of FN lysis and cell migration and promotion of stable focal adhesion formation concomitant with enhanced phosphorylation of tyrosine 397 of FAK and reduced ERK activation. These results suggest that lysis of the extracellular matrix by MT1-MMP promotes focal adhesion turnover and subsequent ERK activation, which in turn stimulates cell migration.<br />研究課題/領域番号:16590241, 研究期間(年度):2004–2005<br />出典：「JNK結合分子による細胞運動極性制御機構の解析」研究成果報告書 課題番号16590241 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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