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渡邉, 琢夫 ; Watanabe, Takuo
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />1.細胞表面受容体のオリゴマー化モニタリング系の開発細胞膜受容体であるRAGE (receptor for advanced glycation endproducts)をモデルとし、2分子FRET法
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により受容体オリゴマー化をモニタリングする技術を確立した。これにより、受容体の蛍光タンパク融合組換え体を作製することなくFRETでオリゴマー化をモニタリングすることが可能となった。(1)RAGE細胞外ドメインに結合し、かつRAGEとリガンドとの結合を阻害しないモノクローナル抗体を作製し、FRETのドナーとアクセプターの対をなす2種の蛍光色素で標識した。(2)RAGE過剰発現細胞株の培養液中に上記の2種の蛍光標識抗体を加え、生細胞表面のRAGEを蛍光標識し、RAGEのオリゴマー化をFRETシグナルの変化を測定することによりモニタリングした。(3)その結果、リガンド刺激後20分をピークとするFRETシグナルの上昇が検出され、本技術の有効性が示された。2.1分子FRET法による細胞内シグナルモニタリングと受容体発現量の相関関係の解析細胞内シグナル強度のモニタリングと、受容体の発現量解析を同時に行うことにより、受容体発現量とシグナル強度の相関解析が可能な系を開発した。(1)NFκBの活性化によりβ-ラクタマーゼを発現するレポーター遺伝子を組み込んだ細胞株に、RAGE発現ベクターを導入した。(2)上記細胞にβ-ラクタマーゼによる分解で分子内FRETが消失する蛍光色素分子を取り込ませ、FRETシグナルによりNFκB活性化を検出すると同時に、蛍光抗体でRAGEを標識し発現量を測定した。(3)その結果、RAGE発現量が中程度の細胞において最も強くNFκBが活性化されており、発現量が過剰な細胞ではむしろ活性化の程度が低いことが明らかとなった。<br />研究課題/領域番号:18038017, 研究期間(年度):2006<br />出典：「細胞膜受容体の分子挙動と細胞応答の統合的測定技術の開発」研究成果報告書 課題番号18038017（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18038017/)を加工して作成
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棟居, 聖一 ; Munesue, Seiichi
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />マルチリガンド受容体として知られるRAGE（receptor for advanced glycation end-products）は種々のリガンドと結合して細胞内シグナルを誘導し、その結果、糖尿病
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血管障害、がん、炎症、アルツハイマー病等の病態を悪化させる。それゆえ、RAGEシグナルを阻害することは、RAGE関連疾患の予防・治療にとって重要である。研究代表者らはRAGEシグナル阻害成分が含まれる醤油由来の低分子画分を分離・精製し、その成分を明らかにした。さらに、RAGEの多量体形成に及ぼす細胞外領域を明らかにするためリガンド結合部位等を欠損させた組換えRAGEを作製しCOS7細胞に導入した。<br />Receptor for advanced glycation end products (RAGE) is a pattern recognition receptor, which has been implicated in the pathogenesis of diabetic complications, inflammation, Alzheimer's disease, and cancer. Therefore it is important for RAGE relation diseases to inhibit RAGE signaling. In this study, we isolated and identified RAGE signaling inhibitory components derived from Japanese soy sauce low molecular fraction. Furthermore cos7 cells were transfected with a plasmid containing full length RAGE cDNA and V1, C1, C2 domain-deleted RAGE cDNAs to clear the essential domain for RAGE multimerization.<br />研究課題/領域番号:26450152, 研究期間(年度):2014-04-01 - 2017-03-31
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山本, 靖彦 ; Yamamoto, Yasuhiko
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />糖尿病血管障害の新規予防・治療法の開発を目指した。標的とするのは、パターン認識受容体の一つで糖尿病血管合併症に関わる膜型受容体RAGE（receptor for advanced glycation
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end-products）であり、その受容体のectodomain sheddingの誘発によりシグナル伝達型RAGEを切断し、デコイ受容体として働く可溶型RAGE（soluble RAGE, sRAGE）を生み出す手法に焦点を当てた。薬剤・化合物ライブラリースクリーニングと検証実験から、複数の候補化合物を同定することに成功し、今後は糖尿病血管障害の新規治療法として臨床への応用が期待された。<br />Receptor for advanced glycation end-products (RAGE) is considered linked to the onset and progression of diabetic vascular complications and atherosclerosis. By focusing on target therapies against RAGE, one potentially useful strategy is the conversion of the membrane-bound form of RAGE (mRAGE) to soluble isoform (sRAGE). The ectodomain shedding can increase the sRAGE level and concomitantly decrease mRAGE expression, potentially leading to the prevention and the attenuation of the diabetic vascular diseases. In this study, we screened drug and chemical libraries and identified useful candidates to mediate the ectodomain shedding of RAGE. Our finding will provide promising drugs for treating diabetic patients.<br />研究課題/領域番号:24590375, 研究期間(年度):2012-04-01 - 2015-03-31
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喜多, 大輔 ; Kita, Daisuke
概要:
金沢大学附属病院<br />本研究は、水頭症発生とRAGEの関与につき探求することを目的とした。内因性分泌型esRAGE遺伝子導入マウスにおける水頭症浸透率は3%程であった。ヒト特発性正常圧水頭症でRAGEの関与は見いだせなかった。ヒトでの
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長期に渡る水頭症患者において脳実質破壊の度合いが脳室の形状に相関があり、RAGE発現との相関が示唆された。本研究とともに、ヒトにおける脳室拡大の継時的変化に関する研究、長期にわたる水頭症患者における髄液吸収能の保持に関する論文、さらに脳室拡大と脳室形状に関する国際学会発表を行った。<br />The main aim of this study was to investigate whether there is co-relation between RAGE and hydrocephalus. In endosecratory RAGE (esRAGE) transgenic mice, we identified about 3% of penetration rate of hydrocephalus, while in human hydrocephalus patients, we couldn’t find such relationship because of difficulty in measuring expression levels of esRAGE from human cerebrospinal fluid. Next, we focused on expression of esRAGE in brain and the way of enlargement of ventricular system. We found that esRAGE was expressed abundantly in human choroid plexus, though there was no relationship between the expression of RAGE and development of hydrocephalus in human. Besides RAGE study, we published two papers on developmental process of hydrocephalus in a young adult, and retention of CSF absorptive capacity in long-standing hydrocephalus patients. We presented a paper on relationship between white mater damage and hydrocephalus in the elderly in an international meeting on hydrocephalus.<br />研究課題/領域番号:25670620, 研究期間(年度):2013-04-01 – 2016-03-31
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山本, 博 ; Yamamoto, Hiroshi
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />2型糖尿病では膵ランゲルハンス島β細胞からのインスリン分泌が徐々に低下し膵β細胞疲弊が生じる。このメカニズムを解明するため、高血糖による糖毒性物質advanced glycation end-prod
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ucts (AGE)とその細胞膜受容体receptor for AGE (RAGE)に着目し、レプチンシグナル不全のdb/dbマウスを使って検討した。また、マウス膵β細胞由来MIN6細胞を用いて糖脂肪毒性の影響を調べた。レプチン受容体シグナルの遮断と、遊離脂肪酸の暴露によって膵β細胞膜上のRAGE発現誘導が生じ、さらにAGE刺激によって膵β細胞はアポトーシス、インスリン分泌不全に陥ると結論された。<br />Glucolipotoxicity, which is exerted by free fatty acids (FFA) and prolonged hyperglycemia, is implicated in pancreatic β-cell failure in diabetes. We examined whether advanced glycation end-products (AGE) and RAGE contribute to β-cell failure in a type 2 diabetes mouse model. Pretreatment of FFA combined with a leptin antagonist induced RAGE expression, AGE-elicited apoptosis, and impaired glucose-stimulated insulin secretion by AGE in MIN6 cells. FFA elevation with concomitant AGE formation during prolonged hyperglycemia could cause β-cell damage through insufficient leptin action and subsequent RAGE induction in type 2 diabetes.<br />研究課題/領域番号:25461335, 研究期間(年度):2013-04-01 – 2016-03-31
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山本, 博 ; Yamamoto, Hiroshi
概要:
1)マウスマクロファージの培養系を用いて,リガンド添加によるRAGEシグナルがcAMP 依存性シグナル伝達経路によって抑制されることを明らかにした。 (2)cAMP依存性シグナルは,MMP9を活性化し膜結合型RAGEのシェディングを促進する
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ことにより,膜結合型RAGEを減少させ可溶型RAGEを増加させることを明らかにした。 (3)cAMP依存性シグナルがRAGEリガンド-RAGE系シグナルを抑制するメカニズムとして,cAMP依存性シグナルによる膜結合型RAGEのシェディング促進が,シグナル伝達に関わる膜結合型RAGE を減少させる一方,デコイ受容体として働く可溶型RAGE を増加させることが考えられた。<br />(1) We found that ligand-dependent RAGE signal was suppressed by cAMP-dependent signaling pathway, using mouse macrophage culture system.(2) We showed that cAMP-dependent signal caused activation of MMP9 that accelerated shedding of membrane-bound form RAGE, which resulted in decrease of membrane-bound form RAGE and increase of soluble form RAGE.(3) The mechanism of the suppression of ligand-dependent RAGE signal by cAMP-dependent signal was supposed that the acceleration of shedding of membrane-bound form RAGE via cAMP-dependent signal resulted in decrease of membrane-bound form RAGE functioning signal transducer and increase of soluble form RAGE functioning decoy receptor.<br />研究課題/領域番号:23659430, 研究期間(年度):2011–2012
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山本, 博
概要:
(1)分泌型RAGE(receptor for AGE)の生成に関わると推定されるシスエレメントとトランス因子候補が同定された。(2)分泌型RAGEを過剰発現するトランスジェニックマウスを作製し、RAGEがアミロイドβの脳への移行に関わるこ
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とを証明した。(3)RAGEと、リポポリサッカライド誘発炎症、およびホスファチヂルセリンによって仲介されるアポトーシス細胞除去との関わりも明らかにされた。<br />First, we identified cis-acting regulatory elements and a putative trans-acting factor that may participate in the production of secretory RAGE. Second, we created a secretory RAGE-overexpressing transgenic mouse model, and demonstrated with it that RAGE accounts for the transition of amyloid・into the brain. Further, we also found that RAGE is involved in lipopolysaccharide-induced inflammation and in phosphatidyl serine-mediated apoptosis.<br />研究課題/領域番号:19390085, 研究期間(年度):2007–2010
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渡邉, 琢夫 ; Watanabe, Takuo
概要:
金沢大学医学系研究科<br />細胞表面受容体RAGEの細胞内シグナル生成に関わる分子を同定することを目的とし、研究実施計画に基づいて研究を遂行した結果、以下の成果を得た。1.RAGE分子のアスパラギン酸結合型糖鎖修飾部位に変異を導入し、糖
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鎖を持たないRAGE分子を細胞に発現させることにより、糖鎖のリガンド結合およびシグナル生成への関与を検討した。その結果、糖鎖の付加によって一部のリガンドとの親和性が低下し、細胞内シグナル生成も減弱していることが明らかとなった。2.RAGE分子の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を蛍光色素で標識し、生細胞表面RAGEを蛍光標識することによりRAGE分子の挙動を観察した。その結果、RAGEはpinocytosisの関わる機構により恒常的に細胞内へ取り込まれていることが明らかとなった。この細胞内取り込みはリガンド刺激による影響を受けなかった。3.上記モノクローナル抗体をFRETのドナーとアクセプターの対をなす2種の蛍光色素で標識し、生細胞表面RAGE分子同士の2分子FRETを観察することにより、高分子リガンド依存性のRAGEのオリゴマー化の検出に成功した。4.RAGE分子のオリゴマー化を引き起こさないと予想される低分子量ヘパリンなどの低分子RAGEリガンドは、RAGEを介する細胞内シグナルを惹起せず、むしろ高分子リガンドによるシグナル生成を阻害する。これらの新知見から、高分子リガンドによるRAGEのオリゴマー化が細胞内シグナル生成の最初のステップであることが強く示唆され、臨床的応用が期待されるRAGE拮抗薬開発の基本原理が明らかになった。<br />RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) is a cell surface receptor that bind several ligands, such as AGE (advanced glycation endproducts), HMGB-1 (high mobility group box-I protein), amyloid beta. The intracellular signals evoked by RAGE-ligand interaction were thought to play pivotal roles in development of various diseases. However, the mechanism of generation of intracellular signals by RAGE was poorly understood.This study shed lights on several new aspects of RAGE signaling mechanism as follows.I. Recombinant wild-type, de-N-glycosylation and G82S RAGE proteins were produced in COS-7 cells, purified and assayed for ligand-binding abilities. De-N-glycosylation at N81 and G82S mutation decreased Kd for glycolaldehyde-derived AGE to three orders of magnitude lower levels compared with wild-type. AGE-induced upregulation of VEGF mRNA was significantly augmented in endothelial cell-derived ECV304 cells expressing de-N-glycosylated and G82S RAGE when compared with wild-type expresser.2. RAGE molecules of living cell surface were labeled by fluorescent dye-conjugated monoclonal antibody that binds to extracellular domain of RAGE (mAbl3G4), and the dynamic state of RAGE was analyzed by confocal fluorescence laser microscopy. The results indicated that RAGE molecules were constitutively internalized, and pinocytotic mechanism was, at least partly, involved in RAGE internalization. The rate of RAGE internalization was not altered by addition of RAGE ligand.3. RAGE molecules of living cell surface were labeled by mixture of mAbl3G4 conjugated with Alexa 488 and mAbl3G4 with Alexa 594, which are a pair of donor and acceptor for FRET (fluorescence resonance energy transfer), to detect oligomerization of RAGE molecule by FRET. The results indicated that the RAGE molecule oligomerized upon binding its ligand.4. Low molecular weight RAGE ligands such as low molecular weight heparin, which are speculated not to induce the RAGE oligomerization, did not evoke RAGE-mediated intracellular signal, and inhibited the signaling by high molecular weight ligands.These new findings strongly suggested that the oligomerization is the first step of the signal generation, and revealed the principle of the development of RAGE antagonists that should be promising candidates of the preventive medicine for RAGE-related diseases.<br />研究課題/領域番号:18590260, 研究期間(年度):2006-2007<br />出典：「マルチリガンド受容体RAGEによる細胞内シグナル生成機構の解明」研究成果報告書 課題番号18590260（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-18590260/185902602007kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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渡邉, 琢夫 ; Watanabe, Takuo
概要:
金沢大学医学系研究科<br />本研究は、糖尿病血管症などの病態に重要な細胞表面受容体RAGE(receptor for advanced glycation endproducts)により活性化される細胞内シグナルの解析を通してRAGEに
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よるシグナル生成機構を明らかにすることを目指し、当初計画に沿って遂行され、以下の成果を得た。(1)全長型RAGE発現細胞と、細胞内ドメイン欠失RAGE発現細胞をAGEによって刺激した所、全長型RAGE発現細胞でのみチロシンリン酸化が亢進するタンパク質が複数同定された。その一部は、新たなRAGE依存性チロシンリン酸化タンパク質と考えられたため、質量分析により数個の候補タンパク質を同定した。(2)各種の酵素阻害剤を用い、これらのタンパク質のチロシンリン酸化はERKの上流もしくは別個のシグナル伝達経路に位置し、チロシンホスファターゼによる制御を受けているものがあることを明らかにした。(3)RAGE発現細胞をAGEで刺激後、クロスリンカーにより細胞表面上で隣接しているタンパク質同士を架橋し、抗RAGE抗体で免疫沈降を行った。次に還元剤処理によりクロスリンカー分子内のジスルフィド結合を切断した後、ウェスタンブロットによりチロシンリン酸化タンパク質を検出した。その結果、複数のチロシンリン酸化タンパク質がRAGEと複合体を形成してることが示された。(4)上記チロシンリン酸化タンパク質の一部はAGE刺激によりチロシンリン酸化が亢進し、刺激時間依存性およびAGE濃度依存性が認められた。また、(1)で同定されたタンパク質と一致する分子量を示すものもあった。(5)全長型RAGE、またはを細胞内ドメイン欠失RAGEを発現している細胞をAGEで刺激後、既知チロシンキナーゼ型受容体のチロシンリン酸化をアッセイする抗体アレイで解析したところ、AGE刺激依存性にチロシンリン酸化が亢進する受容体が見出された。<br />RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) is a cell surface receptor that bind several ligands, such as AGE (advanced glycation endproducts), HMGB-1 (high molecular group box-1 protein), amyloid beta. The intracellular signals evoked by RAGE-ligand interaction were thought to play pivotal roles in development of various diseases. However, the mechanism of generation of intracellular signals by RAGE was poorly understood.In this research we revealed the presence of novel signaling pathway that is activated by the association of RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) with its ligands. The pathway appears to involve tyrosine phosphorylation. We also found tyrosine-phosphorylated proteins that associate with RAGE on cell surface.(1) We found increased tyrosine-phosphorylation of several proteins after ligand stimulation. Their phosphorylation requires cytoplasmic domain of RAGE because the increase of tyrosine-phosphorylation was not observed in a cell line that expres s cytoplasmic domain-deleted RAGE. We identified several candidates of those proteins by mass-spectrometry.(2) We revealed that the stimulation-dependent tyrosine phosphorylation event was located upstream of ERK activation or on ERK-independent signaling pathway, using kinase inhibitors. Furthermore, tyrosine phosphorylation of a few proteins was regulated by tyrosine phosphatase.(3) We found that several tyrosine-phosphorylated proteins associated with RAGE on cell surface using cross-linking followed by immunoprecipitation.(4) We found that the tyrosine phosphorylation of the RAGE associated proteins was enhanced by ligand stimulation in dose-dependent and time-dependent manner. These proteins might be co-receptors of RAGE.(5) We identified a known whose tyrosine-phosphorylation was enhanced by RAGE ligands using antibody array that evaluate tyrosine phosphorylation of known receptor tyrosine. A few known receptor tyrosine kinases were constitutively activated by full-length RAGE or cytoplasmic domain-deleted RAGE. These receptors might be involved in RAGE dependent-signaling pathways.<br />研究課題/領域番号:16570113, 研究期間(年度):2004-2005<br />出典：「多機能受容体RAGEによるシグナリングネットワークの解明」研究成果報告書 課題番号16570113（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） 本文データは著者版報告書より作成
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渡邉, 琢夫 ; Watanabe, Takuo
概要:
金沢大学医学系研究科<br />本研究は、糖尿病性血管合併症の発生に重要と考えられている終末糖化産物(AGE, advanced glycation endproducts)とその受容体RAGE(Receptor for AGE)の結合によ
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る血管細胞障害のメカニズムについて解明することを目指し、当初計画通りに遂行され、以下の成果を得た。1.ウシ血清アルブミンをグリセルアルデヒドまたはグリコールアルデヒドとインキュベートして得られた新規AGE分子種-AGE2とAGE3-が細胞表面RAGEと強く結合することを明らかにした。2.表面プラスモン共鳴法を用いた解析により、AGE2・AGE3結合部位は、いずれもRAGEのアミノ端の免疫グロブリンV領域様ドメイン上に存在することを明らかにした。3.培養血管内皮細胞を用いた解析により、AGE2・AGE3いずれもERK1・ERK2などのMAPキナーゼ経路を活性化するとともにVCAM-1発現量を増加させることを明らかにした。4.RAGEノツクアウト糖尿病マウスでは対照糖尿病マウスに比して糖尿病性腎症の進行が有意に抑制されてることを明らかにし、RAGEが糖尿病性腎症に促進的に働いていることを示した。5.ヒト血管内皮細胞から分泌型RAGE蛋白をコードするcDNAを単離し、esRAGE(endogenous secretory RAGE)と命名した。6.esRAGEの血管細胞での役割を解析し、esRAGEは細胞外でAGE2・AGE3などのRAGEリガンドを補足することにより、血管保護作用を有することを明らかにした。7.esRAGE ELISA定量系を開発し、血中esRAGEと生活習慣病罹患との相関を解析することにより、esRAGEが生活習慣病の罹患リスクマーカーとなる可能性を示した。血中esRAGE量の生活習慣病の罹患リスクマーカーとしての臨床応用に関する特許出願を平成16年5月に予定している。<br />In this research, we revealed that the novel species of advance glycation endproducts (AGE), whose level in serum is elevated in diabetic patients, do bind to their cellular receptor RAGE and induce intracellular signals.We also identified a novel splicing variant of RAGE-endogenous secretory RAGE (esRAGE)-and found that this variant has protective effect against vascular injury induced by the novel AGE species. Moreover, we found the significant coirelation between serwn esRAGE level and susceptibility of some life-style related diseases.(1) We demonstrated that the novel AGE species, which is generated by incubating bovine serum albumin with glyceraldehyde or glycolaldehyde, strongly binds to cellular RAGE at comparable dissociation constants calculated by the suiface plasmon resonance method.(2) We mapped the binding region of the novel AGEs on RAGE at an inununoglobulin V-domain-like region on its N-terminal end.(3) We demonstrated that the interaction of the new AGEs to RAGE activated MAP kinase signaling pathway and induced V CAM-i expression in cultured human endothelialcells.(4) We created RAGE knockout mice and demonstrated that the development of diabetic nephropa thy was dramatically suppressed in the absence of RAGE..(5) We isolated a novel splicing variant of RAGE from human endothelial cells that lacks transmembrane domain and is secreted from cells, and termed this novel variant esRAGE (~ndogenous secretory RAGE).(6) Furthennore we found that esRAGE has a protective effect against the vascular injuly induced by the novel AGEs, by extracellular capture of the RAGE lingads.(7) We established esRAGE ELISA system and analyzed serum level of esRAGE in patients with life-style related deseases. Then we found significant correlation between serum esRAGE level and susceptibility of some life-style related diseases, suggesting that. the serum esRAGE level could be a useful risk marker for some life-style related deseases.<br />研究課題/領域番号:14580645, 研究期間(年度):2002-2003<br />出典：「新規糖化蛋白分子種による血管障害機序の解明」研究成果報告書 課題番号14580645 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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