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山本, 健一
概要:
巻頭言
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山本, 健一 ; 赤池, 聡 ; 清水, 弘子 ; 早部, 紘子 ; 林, 直之 ; 望月, めぐみ ; 小林, 昌彦 ; 森村, 容子 ; 武, 紀代子 ; 塩谷, 裕司
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山本, 健一 ; Yamamoto, Ken-ichi
概要:
DNA二重鎖切断等のDNA損傷応答に中心的な役割を果たしているATMの下流で,c-AblチロシンキナーゼがATM依存性に,DNA相同組み換えタンパク質RAD51をリン酸化するが,相同組み換え修復経路におけるRAD51の多岐にわたる機能のうち
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のどの部分に関わるかは明らかではない.我々は,c-Ablのクロマチン結合はGlivecで阻害され,Kinase-dead変異体では起こらないことを明らかにした.また最近新たに同定したRAD51-R167G変異体(R167G)は,単独発現ではクロマチンに集積しないが,c-Ablとの共発現により,RAD51野生型と同様に,クロマチン分画に集積し,抗Y-54pあるいはY-315p特異抗体を用いた解析により,c-AblによるRad51の54番,315番のチロシンのリン酸化がクロマチン分画でのみ起こることを認めた.R167Gは,RAD51がフィラメントを形成した時に,隣接するRAD51分子との境界領域に存在すると考えられている.やはり,この領域に存在すると予想されるRAD51-F86E変異体(ケンブリッジ大,Venkitaraman博士から供与された.)についても,c-Ablとの共発現でクロマチン集積が回復し,54番,315番のチロシンリン酸化を確認した.さらにR167Gの54番と315番のどちらのチロシンがリン酸化によるクロマチン集積に必要かを調べるために,二重の変異体(RAD51Y54F/R167GとRAD51R167G/Y315F)を作製して,蛍光抗体法でc-Abl共発現の場合のRAD51の局在を検討した.その結果,R167Gのc-Abl共発現によるクロマチン集積には,RAD51の315番のチロシンのリン酸化が重要であることが判明した.以上の結果から,c-Ablが自身のキナーゼ活性依存性にDNA損傷部位に移行し,BRCA2依存性にDNA損傷部位に移行したRad51のチロシン隣酸化を行い,おそらくはRad51の自己集合あるいはDNA結合を制御することにより,最終的にRad51のDNA損傷部位でのフィラメント形成を促進すると考えられる.今後,DNA損傷によるc-Ablファミリーの活性化と,チロシンキナーゼ活性依存性に起こるDNA損傷部位への集積の機序について,BRCA1とTopBP1の役割に重点をおいて検討すると共に,Rad51の相同組み換えDNA修復能への,分子標的薬剤Glivecの影響について検討する.<br />c-Abl tyrosine kinase is activated by DNA damage, such as ionizing radiation (IR), in an ATM-dependent manner, and plays important roles in growth arrest and cell death. c-Abl has also been shown to be involved in DNA repair through the phosphorylation of Rad51, a key molecule in homologous recombination repair (HRR). However, it is unclear how c-Abl mechanistically regulates Rad51 functions. In the present study, we show that c-Abl associates and is activated in the chromatin in kinase activity dependent manners. By using self-association defective Rad51 mutants, we further show that c-Abl phosphorylates and stabilizes Rad51 chromatin association in a Tyr-31 5-dependent manner. However, c-Abl cannot restore the defect of the self-association defective mutants in IR-induced nuclear focus formation, suggesting that c-Abl functions the early step of Rad51 chromatin assembly, before self-association-dependent Rad51 nucleoprotein filament formation at DNA damage sites.<br />研究課題/領域番号:18590286, 研究期間(年度):2006-2007<br />出典：「c-AblファミリーのクロマチンにおけるRad51の機能制御の意義」研究成果報告書 課題番号18590286 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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山本, 健一 ; Yamamoto, Ken-ichi
概要:
我々は,c-Ablファミリーの一員で機能が明らかではないArg(Abl related gene)について,そのノックアウト細胞がATMノックアウト細胞と同じように,Rad51 focus形成,放射線感受性,DNA組み換えや修復,等の異常を
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示し,さらに,ATM依存的に活性化されたArgがRad51と結合して燐酸化することから,ATMのDNA修復機能にArgが関与していることを明らかにした.今後,ATMがどのようにArgを活性化し,Argが燐酸化したRad51がどのように機能するのか,共同研究により生化学的解析を進める.また,ATM/ATRによって燐酸化されると同時に,DNA損傷のセンサーとして機能しているPCNA様のRad9およびRFC様のRad17のノックアウト細胞を作成し,その解析を行った.その結果,その機能は予想されるATRの機能と一致し,ATMの機能とは異なると考えられた.さらに,Rad9がTopBP1とは結合できるが,polymeraseδ,ε,ηとは結合していない予備的結果を得ている(東大分生研鶴尾教授および阪大花岡教授との共同研究,未発表).TopBP1に相当する酵母のDpb11はpolymeraseεと相互作用することから,Rad17-9はTopBP1を介して損傷部位にpolymeraseを動員している可能性が考えられる.我々は今後この重要な仮説を検証するため,TopBP1のノックアウト細胞を作成して解析するとともに,様々なノックアウト細胞におけるpolymeraseδ,ε,ηの動態を,BrdU, Rad9, TopBP1 focusとともに,抗体(現在作成中)を用いて解析する.<br />c-Abl tyrosine kinase is activated by DNA damage in an ataxia telangiectasia mutated (ATM)-dependent manner, and plays important roles in growth arrest and apoptosis. Arg (abl-related gene) is an only known homologue of c-Abl, and shares considerable structural and sequence homology with c-Abl in the N-terminal SH3, SH2 and tyrosine kinase domains. However, Arg roles in cellular response to DNA damage are unknown. To study possible roles for Arg in cellular response to ionizing radiation (IR), we generated Arg-/- cells from a chicken B cell line (DT40) by targeted disruption. We found that, unlike c-Abl-/-DT40 cells (1) but similar to ATM-/-DT40 cells (2), ionizing radiation (IR)-induced Rad51 focus formation is reduced in Arg-/-DT40 cells. This is consistent with the findings that Arg-/-DT40 cells display hypersensitivity to IR, elevated frequencies of IR-induced chromosomal aberrations, and reduced targeted integration frequencies. All of these abnormalities in DNA damage repair are also observed in ATM-/- but not in c-Abl-/-DT40 cells (1, 2). Finally, we found that Arg interacts with and phosphorylates Rad51 in 293T cells. These results suggest that Arg plays a role in homologous recombinational DNA repair by phosphorylating Rad51.<br />研究課題/領域番号:13680776, 研究期間(年度):2001-2002<br />出典：「高等動物ATMファミリーの細胞周期制御における機能とその活性化」研究成果報告書 課題番号13680776 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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山本, 健一 ; Yamamoto, Kenichi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />免疫抑制剤FK506によるNF-κB活性化の機序を明らかにするため、そのインヒビターのIκBαの分解について解析した。その結果、その分解は、IκBαのN末部の32番目と36番目のセリン残基(Seri32
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/Ser-36)に依存し、従来指摘されていたプロテアソームが関与していることを確かめた。さらに、Ser-32で燐酸化されたIκBαに対する特異抗体を用いてウェスタンブロットした結果、FK506がIκBαのSer-32の緩徐な燐酸化を引き起こすことが確認された。しかし、FK506はJNKの強い活性化を引き起こすにも関わらず、FK506によるIκB Kinase(IKK-1/-2)の活性化は認められなかった。また、IL-1によるIκBαの分解では、N末部のセリン残基の燐酸化に依存したN末部の21番目と22番目のリジン残基(Lys-21/Lys-22)へのユビキチン化が必須であるが、FK506によるIκBαの分解はこのN末部のユビキチン化部位に依存しないで起こった。以上、FK506によるIκBαの分解は、従来考えられている機構とは異なり、N末部のセリン残基の燐酸化には依存するが、N末部のユビキチン化部位には依存しないプロテアソーム蛋白分解機構によって起こると考えられた。現在我々は、FK506/FKBPによって活性化される新規IKKとFK506/FKBPによって抑制されるフォスファターゼの同定を進めている。<br />研究課題/領域番号:11153208, 研究期間(年度):1999<br />出典：「シグナルモジュレーターとしてのFKBPシャペロンの役割」研究成果報告書 課題番号11153208（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11153208/)を加工して作成
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山本, 健一 ; Yamamoto, Kenichi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />免疫抑制剤FK506によるNF-κB活性化の機序を明らかにするため、そのインヒビターのIκBαの分解について解析した。その結果、その分解は、IκBαのN末部の32番目と36番目のセリン残基(Seri32
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/Ser-36)に依存し、従来指摘されていたプロテアソームが関与していることを確かめた。さらに、Ser-32で燐酸化されたIκBαに対する特異抗体を用いてウェスタンブロットした結果、FK506がIκBαのSer-32の緩徐な燐酸化を引き起こすことが確認された。しかし、FK506はJNKの強い活性化を引き起こすにも関わらず、FK506によるIκB Kinase(IKK-1/-2)の活性化は認められなかった。また、IL-1によるIκBαの分解では、N末部のセリン残基の燐酸化に依存したN末部の21番目と22番目のリジン残基(Lys-21/Lys-22)へのユビキチン化が必須であるが、FK506によるIκBαの分解はこのN末部のユビキチン化部位に依存しないで起こった。以上、FK506によるIκBαの分解は、従来考えられている機構とは異なり、N末部のセリン残基の燐酸化には依存するが、N末部のユビキチン化部位には依存しないプロテアソーム蛋白分解機構によって起こると考えられた。現在我々は、ユビキチン化部位に依存しないプロテアソーム蛋白分解機構の解析を進めている。<br />研究課題/領域番号:11144217, 研究期間(年度):1999<br />出典：「細胞ストレス応答におけるプロテアソームの活性制御機構」研究成果報告書 課題番号11144217（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11144217/を加工して作成
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論文
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山本, 健一 ; Yamamoto, Keiichi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />多様なストレスにたいする細胞の応答機構における分子シャペロンの役割について明らかにするため、これらストレスによって活性化されてストレス応答に重要な役割を果たしていると考えられているNF-κB転写因子の活
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性化のシグナル伝達機構における分子シャペロンの役割について研究し、現在までに次のような成果を上げた。我々は前に免疫抑制剤FK506によりIκBαの分解を介してNF-κBの活性化が起こることを明らかにした(J.Clin.Invest.,1996)。NF-κBの活性化には、そのインヒビターであるIκBαのN末部のセリン残基の燐酸化とユビキチン化に依存したプロテアソームによる蛋白分解が必須であると考えられている。我々はFK506とFKBP分子シャペロンによるNF-κBの活性化ではIL-1/TNF-αの場合と異なり、N末部のユビキチン化部位の非依存性にプロテアソームによる分解が起こることを明らかにした。また、42番目のチロシン残基のアラニンへの置換には影響されないが、N末部のセリン残基の変異によって分解はブロックされた。しかし、燐酸化したN末部のセリン残基に対する抗体を用いたウェスタンブロティングや、in vitro kinase assayによるIκBαキナーゼの活性化の測定、等IκBαの燐酸化を検出できないという興味ある結果が得られた。今後FKBPがIκBαの燐酸化とプロテアソームによる分解にどのように関わっているのか明らかにしていく。<br />研究課題/領域番号:10172207, 研究期間(年度):1998<br />出典：「シグナルモジュレーターとしてのFKBP分子シャペロンの役割」研究成果報告書 課題番号10172207（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10172207/)を加工して作成
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山本, 健一 ; Yamamoto, Kenichi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />免疫不全やリンパ腫等の頻発を主病状とするataxia telangiectasia(AT)の原因遺伝子(ATM)の異常がどのような機序によって免疫異常を引き起こすのかは明らかではない。我々はこの点を明ら
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かにするため、ATMの遺伝子ノックアウトB細胞株をトリB細胞株DT-40で作成した。これらのノックアウト細胞株を用い、抗体リセプターのシグナル伝達系、免疫グロブリンL鎖遺伝子の再編成、さらにDNA損傷や組み換えの修復、等におけるATMファミリーの役割について検討した。その結果、ATMノックアウト細胞は放射線に対する細胞応答において、G_2/M期でのチェックポイント機構の異常、染色体断裂数の著しい増加、著しい放射線感受性、等の様々な異常を示した。さらに、ATノックアウト細胞では、geneconversionによるL鎖遺伝子再編成はほぼ正常であると判断されたが、外来性の遺伝子のhomologousあるいはrandam integrationは著しく低下していた。一方、以前の報告とは異なり、ATノックアウト細胞では抗体リセプターからのシグナル伝達によるCaのinfluxは正常に起こり(関西医大黒崎教授との共同研究)、ATでの免疫不全の原因としては、抗体リセプターからのシグナル伝達系における異常ではなく、DNA組み換え機構における異常が重要であろうと考えられた。現在さらに、この過程におけるATMの機能を解析中である。<br />研究課題/領域番号:10167208, 研究期間(年度):1998<br />出典：「ATMファミリーの異常による免疫不全の分子病態」研究成果報告書 課題番号10167208（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10167208/)を加工して作成
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山本, 健一 ; Yamamoto, Kenichi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />発ガン剤や抗ガン剤を含む多様なDNA損傷ストレスにたいする細胞の応答機構における細胞内プロテアーゼの役割について明らかにするため、これらストレスによって活性化されてストレス応答に重要な役割を果たしている
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と考えられているNF-κBおよびp53転写因子の活性化のシグナル伝達機構におけるプロテアーゼの役割について研究し、現在までに次のような成果を上げた。(1)NF-κBの活性化には、そのインヒビターであるIκBαのN末部のセリン残基の燐酸化に存在した蛋白分解が必須であると考えられている。我々はFK506のような非定型的なNF-κBの活性化刺激では、IL-1/TNF-αの場合と異なり、N末部のユビキチン化部位に非依存性にプロテアソームによる分解が起こり、またN末部のセリン残基の変異によって分解はブロックされるが、燐酸化したN末部のセリン残基に対する抗体や、in vitro kinase assayによって燐酸化が検出されないという興味ある結果が得られた。(2)細胞の増殖制御、特にアポトーシスに重要な役割を果たしているp53について、我々は、先天性小脳失調生毛細血管拡張症の原因遺伝子(ATM)ファミリーがp53に結合し、p53蛋白の安定化に関与することを明らかにした。さらに、現在p53のさまざまな変異体(Ser-15,Ser-315,Ser-376,Ser-378の変異体をふくむ)での解析を進めており、p53のどの部位がATMによるp53蛋白の安定化に関与しているのか、またその過程にMDM2が関与しているのか、等について検討していく。<br />研究課題/領域番号:10163215, 研究期間(年度):1998<br />出典：「細胞ストレス応答におけるプロテアーゼの役割とその制御」研究成果報告書 課題番号10163215（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10163215/)を加工して作成
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論文
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山本, 健一 ; Yamamoto, Kenichi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />我々は,ATMの重要な標的因子の一つのc-Ablは,そのノックアウト細胞の角蜥から,ATMのDNA修復機能には関与していないことを明らかにしたが,最近c-Ablファミリーの一員で機能が明らかではないAr
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g(Abl related gene)について,そのノックアウト細胞がATMノックアウト細胞と同じように,Rad51focus形成,放射線感受性,DNA組み換えや修復,等の異常を示し,さらに,ATM依存的に活性化されたArgがRad51と結合してチロシン燐酸化することから,ATMのDNA修復機能にArgが関与していることを明らかにした(論文準備中).DT40でのノックアウトが致死的であったATMファミリーのATRのノックアウトついては,Cre-loxP系を使ったノックアウトとATRの涯渡変異体のノックインの共同研究を進めている.さらに,最近Cambridge大Jackson教授のグループが出芽酵母Mec1にDNAとともに結合している因子として生化学的に同定したlcd1について,DT40細胞での遺伝子ノックアウトによる機能解析を共同研究で進めている.従来,放射線等のDNA損傷によるJNK活性化には,ATMおよびc-Ablが重要であると考えられていた.しかし,ATM, c-Abl、及びArgのDT40ノックアウト細胞での解析では,放射線等によるJNK活性化は正常あるいは亢進していた.一方,DNA-PKおよびKu70ノックアウト細胞(京大武田教授・放医研阿部博士)では,放射線等によるJNK活性化が認められず,また放射線によるアポトーシスも極度に低下していた.従ってDT40等のB細胞系の細胞では,放射線等によるJNK活性化やアポトーシスにはDNA-PK/Ku70が重要であると考えられ,BTKを含め,DNA-PKの下流のシグナル因子の同定を現在進めている.<br />研究課題/領域番号:13214038, 研究期間(年度):2001<br />出典：「ゲノム維持機構におけるATMファミリーの機能とその異常による発がん機構の解析」研究成果報告書 課題番号13214038（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13214038/)を加工して作成
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