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松永, 司 ; Matsunaga, Tsukasa
概要:
年月日：2004年8月28日（土）午後1時～2時30分, 場所：金沢大学サテライト・プラザ：寺井町立図書館
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松永, 司 ; Matsunaga, Tsukasa
概要:
金沢大学薬学部<br />当研究室では、これまで、紫外線誘発DNA損傷を特異的に認識するモノクロ-ナル抗体の樹立を行ない、チミン二量体(TDMー1,2,3)、(6ー4)光産物(64Mー1,2,3,4,5)、Dewar型光産物(DEMー1)の
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各損傷に対する9種のモノクロ-ナル抗体の樹立に成功した(Mori et al.,1988;Mizuno et al.,1991;Mori et al.,1991;Matsunaga et al.,投稿中)。本研究では、これらの抗体の損傷特異性を利用して、ヒトDNA修復機構における損傷認識ステップの解析を行なった。1)まず、DNA修復過程をより分子的に解析するために、Woodら(1988)により樹立された試験管内修復系を導入し、上記の抗体を併用することにより、修復合成に加えて損傷除去も追跡できる系を確立した。この系において、チミン二量体の除去に伴う修復合成のパッチサイズは、約20塩基程度であることが明らかとなった。2)抗DNA損傷モノクロ-ナル抗体と細胞内DNA損傷結合因子は、DNA損傷結合能という共通の性質を持つことから、以下の解析を行なった。a)抗DNA損傷抗体と紫外線照射DNAとの結合は、HeLa細胞の粗抽出液により濃度依存的に阻害された。b)試験管内修復系に、抗DNA損傷抗体を添加すると、修復反応が阻害された。c)ゲルシフト法において、抗DNA損傷抗体ならびに細胞粗抽出液とも、バンドのシフトが観察されたが、その移動度は異なっていた。以上の結果より、抗DNA損傷モノクロ-ナル抗体競合法は、細胞内DNA損傷結合因子の解析、ならびにその分離・精製に有用であることが示された。3)抗体のパラト-プに対する抗イディオタイプ抗体は、元の抗原と類似した構造をとることが知られており、抗DNA損傷モノクロ-ナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体を樹立するプロジェクトに着手した。現在、64Mー2抗体と紫外線照射DNAとの結合を阻害する抗体を産生するハイブリド-マ2種を得ており、クロ-ニングを行なっている。最終的に、アフィニテイ-クロマトグラフイ-法を駆使して、細胞内DNA損傷結合因子の分離を目指したい。<br />研究課題/領域番号:03152048, 研究期間(年度):1991<br />出典：「抗DNA損傷モノクロ-ナル抗体競合法を用いたヒトDNA損傷結合因子の解析」研究成果報告書 課題番号03152048（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-03152048/）を加工して作成
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松永, 司 ; Matsunaga, Tsukasa
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />我々は、紫外線誘発DNA損傷であるシクロブタン型ピリミジン二量体や(6-4)光産物を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製し、1J/m^2という正常ヒト細胞の生存率に影響を与えない紫外線線量域におけ
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るDNA損傷修復能を測定できる超高感度定量系を開発した。その結果、従来の線量域(10-40J/m^2)では全く修復能が見られなかった色素性乾皮症A群(XP-A)患者由来細胞XP12BE、およびXP-G患者由来細胞XP2BIにおいて、(6-4)光産物が24時間で約40-50%修復されるという現象を見出した。本研究では、この現象がヌクレオチド除去修復が完全に破壊されたときのバックアップシステムによるものか否かさらに検証した。そこで、臨床症状と修復欠損がより重篤なXPEMB-1(XP-A)細胞、およびXPCS2LV(コケイン症候群併発型XP-G)細胞について1J/m^2照射後の(6-4)光産物の修復動態を解析したところ、これらの細胞ではウェスタンブロッティングで各欠損タンパク質が全く検出できなかったが、やはり24時問で20-40%程度の修復が観察された。また、検出限界以下の変異型タンパク質の存在とそれによる残存活性を否定するため、XPAあるいはXPGのノックアウトマウス由来細胞の供与を受けて同様の解析を行った結果、色素性乾皮症患者由来細胞で見られるよりも程度は低いものの(6-4)光産物の修復傾向が確認された。以上の結果より、1J/m^2照射時に見られるヌクレオチド除去修復欠損細胞における(6-4)光産物の修復能は、ヌクレオチド除去修復以外のバックアップシステムによる可能性が示唆された。<br />研究課題/領域番号:14658159, 研究期間(年度):2002<br />出典：「ヌクレオチド除去修復のバックアップ機構に関する研究」研究成果報告書 課題番号14658159（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14658159/）を加工して作成
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松永, 司 ; Matsunaga, Tsukasa
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />ヌクレオチド除去修復(NER)において、XPGとXPF-ERCC1はそれぞれ損傷の3′側と5′側の切断酵素として働くが、XPGやERCC1をノックアウトしたマウスはいづれも成長阻害、離乳前死亡というN
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ER欠損だけでは説明できない重篤な症状を示す。また、XPGはXPF-ERCC1による5′側切断にも関与している可能性が示唆されており、本研究ではXPGの除去修復エンドヌクレアーゼとしての機能以外の役割に注目した。1. Two-hybridシステムを用いた解析より、XPGとERCC1の相互作用が示唆された。プルダウンアッセイを用いて試験管内で確認したところ、バキュロウィルス高発現系から精製されたリコンビナントタンパクや試験管内転写/翻訳反応により合成されたタンパクで両者の相互作用が確認できた。また、その相互作用ドメインのマッピングを行い、XPGはN末とC末の2箇所(主にN末)にERCC1はN末の領域に特定できた。本研究で示されたXPGとERCC1との相互作用は、XPF-ERCC1の損傷部位へのリクルートに関与しているのかもしれない。2. XPGタンパクはNERとは別の修復機構である塩基除去修復(BER)にも関与する可能性が示唆されており、この点について検討した。まず、ウラシルを1個のみ含むDNA基質を用いて塩基除去修復の試験管内切断反応系を確立した。これを用いて各種細胞粗抽出液の切断活性を比較したところ、XP-G患者由来細胞や放医研の塩見らによって樹立されたxpgノックアウトマウス由来細胞の抽出液は、正常細胞に比べて常に低い切断活性(50-80%)を示すことがわかった。また、この低切断活性はウラシルDNAグリコシラーゼの反応効率の低下に起因していた。しかし、リコンビナントXPGを反応系に添加しても相補されず、XPGの塩基除去修復への関与は間接的なものであることが示唆された。<br />研究課題/領域番号:10165206, 研究期間(年度):1998<br />出典：「除去修復エンドヌクレアーゼの機能とその欠損による分子病態に関する研究」研究成果報告書 課題番号10165206（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10165206/)を加工して作成
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松永, 司 ; Matsunaga, Tsukasa
概要:
金沢大学薬保健研究域薬学系<br />我々は、哺乳類細胞における紫外線誘発DNA 損傷に対する修復機構として、ヌクレオチド除去修復以外の反応が存在する可能性を見出し、本研究ではその反応メカニズムを詳細に解析した。その結果、この反応にはヌクレ
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オチド除去修復の初期過程で働く損傷認識因子XPCが必須であり、別の損傷認識因子であるDDBは必要ないことがわかった。一方、DDBが正常に存在する場合は、プロテアソーム活性もこの反応に必要であるが、DDB2ノックダウン下では必要ないことから、DNA損傷がDDBによって認識されたときはCul4-DDB1 E3リガーゼによるユビキチン化と分解反応が必要と推測された。<br />We recently showed that mammalian cells slowly remove UV-induced 6-4 photoproducts from their genome under the nucleotide excision repair (NER)-defective condition. In this study, we have tried to uncover the mechanism of the NER-independent reaction in human cells. We have found that the non-canonical repair reaction requires XPC, but not DDB, both of which are well-known NER factors involved in a damage recognition step. We further found that a proteasomal activity is also required for this reaction only when NER-deficient cells have functional DDB, suggesting the implication of proteasomal degradation mediated by Cul4-DDB1 E3 ligase.<br />研究課題/領域番号:16K15118, 研究期間(年度):2016-04-01 - 2018-03-31
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松永, 司 ; Matsunaga, Tsukasa
概要:
金沢大学薬保健研究域薬学系<br />我々が見出したヌクレオチド除去修復阻害化合物（NERi）が、シスプラチンの抗腫瘍作用増強剤となりうるか検討を行った。まず、胃癌由来KKLS細胞および卵巣癌由来A2780細胞を用いたコロニーアッセイで、N
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ERiは２～３倍の増強を示すことがわかった。また、シスプラチンで誘発される1,2-GpG架橋損傷の修復が、NERiの前処理により阻害されることを確認した。そこで、マウス肺癌由来LLC細胞をC57BL/6マウスに移植し、シスプラチンとNERiとの併用効果を調べたところ、シスプラチン単独処理に比べて有意に高い抗腫瘍作用が観察された。<br />In this study, we have analyzed whether a small-molecule inhibitor of nucleotide excision repair (NERi) we recently found can potentiate the cytotoxic effects of cisplatin in cancer cells. The clonogenic survival assay revealed that NERi treatment increases the cisplatin-sensitivity of KKLS stomach cancer cell lines and A2780 ovarian cancer cell lines 2-3 fold. Using an immunoassay with damage-specific antibody, we showed that the removal of cisplatin-induced DNA intrastrand crosslinks is markedly attenuated by NERi treatment. Furthermore, in vivo experiments using murine Lewis lung carcinoma and C57BL/6 mice revealed that a combination of cisplatin and NERi significantly suppresses tumor growth, compared with cisplatin alone.<br />研究課題/領域番号:25640089, 研究期間(年度):2013-04-01 - 2015-03-31
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松永, 司 ; Matsunaga, Tsukasa
概要:
金沢大学薬保健研究域薬学系<br />我々は、これまでにヒト細胞のヌクレオチド除去修復反応を阻害する低分子化合物を発見し、ERCC1-XPFのプロテアソーム依存的分解誘導が原因であることを明らかにしている。本研究では、この分解誘導の詳細なメ
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カニズムを明らかにすべく、この反応に関わる因子の同定を試み、２種のポリユビキチン化関連因子を同定した。また、100種以上の構造類縁体を用いて活性を比較し、構造活性相関を明らかにした。一方、新たな化合物ライブラリーを用いたスクリーニングも実施したが、上記化合物と同レベルの高い阻害活性を示す化合物は得られなかった。<br />We recently identified a small-molecule inhibitor (NERi) of nucleotide excision repair in human cells, which induces proteasomal degradation of one of core NER factors, ERCC1-XPF. In this study, we have tried to uncover the detailed mechanism underlying the loss of ERCC1-XPF heterodimer after NERi treatment. We have finally identified two cellular proteins possibly involved in the proteosomal degradation of ERCC1-XPF. We have also determined a structure-activity relationship of NERi by comparing the activity of more than 100 derivatives. On the other hand, we could find no further compounds showing comparably high NER-inhibition activity with NERi after screening of another public chemical library.<br />研究課題/領域番号:25281017, 研究期間(年度):2013-04-01 - 2016-03-31
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松永, 司 ; Matsunaga, Tsukasa
概要:
我々は近年、紫外線誘発DNA損傷のシクロブタン型ピリミジンダイマーや(6-4)光産物を超高感度に検出定量する系を開発し、(6-4)光産物に対するヌクレオチド除去修復欠損をバックアップする機構の存在を示唆してきた。本研究では、その実体を明らか
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にすることを目的として以下の解析を行った。1)完全欠損型ノックアウトマウス由来細胞を用いて1J/m^2の紫外線照射後の(6-4)光産物の修復動態を調べたところ、24時間後に30-50%の(6-4)光産物が消失し、CPDについても程度は低いものの有意な消失が認められた(48時間で20-30%)。2)日本人XP-A患者に多い変異であるAlwNI型変異をもつXPA cDNAをHeLa細胞に導入して安定発現する形質転換細胞を得たところ、ベクターのみを導入したコントロール細胞と同じ修復能を示したことから、この変異型XPAタンパク質はドミナントネガティブ効果がないことがわかった。3)シクロブタン型ピリミジンダイマーの検出感度をさらに10倍上昇させることに成功し、健常人由来細胞で100%、XP-A細胞でも90%程度が生存できる0.1J/m^2という紫外線照射後の修復動態をXP2BI細胞(XP-G)で調べたところ、シクロブタン型ピリミジンダイマーの時間依存的な消失がより顕著になり、新規のDNA修復機構が(6-4)光産物と同様にシクロブタン型ピリミジンダイマーに対しても働きうることが示唆された。4)適応応答についても検討を行ったが、前日に極低線量(0.2J/m^2)を照射しておくことで1J/m^2照射後の修復効率にわずかな亢進が見られたものの、適応応答の存在を確信するには至らなかった。以上の結果より、(1)この修復活性はヌクレオチド除去修復の残存活性ではなく別の機構によること、(2)この機構はヒトのみならずマウスにも存在すること、(3)修復効率はヌクレオチド除去修復と同様にシクロブタン型ピリミジンダイマーより(6-4)光産物の方が効率的であること、(4)この経路には少なくともXPAおよびXPGは関与しないことが明らかとなった。<br />We have established a super-sensitive detection method for measuring cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) and (6-4)photoproducts (6-4PPs) induced by biological doses of ultraviolet (UV) light and suggested that human cells might have a novel repair system mainly for 6-4PPs other than nucleotide excision repair which has been thought to be only repair system for those lesions in humans so far. In this study, we have obtained the following findings.1.The removal of 6-4PPs was observed even in the embryonic fibroblasts derived from xpa(-/-) or xpg(-/-) knock-out mice (30-50% after 24 hr). In addition, the removal of CPDs was also detected in those cells with a less efficiency (20-30% after 48 hr).2.HeLa cells stably expressing AlwNI-type mutant XPA did not show any impairment of nucleotide excision repair activity, suggesting that this mutant XPA protein does not have a dominant-negative effect.3.We have further sensitized the detection method for CPDs, enabling us to determine the repair kinetics of CPDs in cells exposed to non-killing doses of Was low as 0.1 J/m^2. Under this condition, we have found that xeroderma pimentosum cells significantly remove CPDs (〜40% after 48hr).4.We could observe some weak enhancement of repair efficiency after UV irradiation of 1 J/m^2 when the human cells had been pie-exposed to 0.2 J/m^2. However, we need more extensive experiments to conclude whether the back-up repair system is under the control of adaptive responses.Taken together with those results, we concluded that mammalian cells have a certain back-up repair system, independent of XPA and XPG, which removes mainly 6-4PP but also CPDs with a less efficiency.<br />研究課題/領域番号:15310036, 研究期間(年度):2003-2004<br />出典：「ヒト細胞におけるヌクレオチド除去修復のバックアップ機構に関する研究」研究成果報告書 課題番号15310036 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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松永, 司 ; Matunaga, Tukasa
概要:
本研究では、ヌクレオチド除去修復（nucleotide excision repair; NER）の必須因子ERCC1またはXPBを分解誘導する２種類の低分子化合物の作用機序を詳細に解析し、両反応に関わるユビキチンE3リガーゼ（SCF複合体
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）を各々同定した後、プロテインキナーゼの関与も明らかにした。また、NER阻害化合物を癌治療に応用する試みとして、シスプラチンの抗腫瘍効果に対する増強作用を示すこと、またオラパリブ（PARP阻害剤）との併用により相乗的な細胞障害性が得られることを示した。一方、新たな化合物ライブラリースクリーニングを行い、新規のNER阻害化合物を２種類同定することに成功した。<br />In this study, we have tried to uncover the detailed mechanisms underlying the protein degradation of nucleotide excision repair (NER) factors, ERCC1 or XPB, induced by two kinds of small-molecule compound. We have identified two different SCF complexes responsible for each reaction and also suggested the involvement of protein kinases. Futhermore, we have found that the ERCC1 degrader potentiates the cytotoxicity of cisplatin or olaparib to cancer cells. On the other hand, we have newly identified two natural compounds inhibiting NER with different mechanisms after another chemical library screening.<br />研究課題/領域番号:16H02952, 研究期間(年度):2016-04-01 - 2019-03-31<br />出典：研究課題「新規DNA修復阻害剤を活用したメカニズム解析と癌治療への応用」課題番号16H02952（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-16H02952/16H02952seika/)を加工して作成
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