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論文 |
論文
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榎並, 正芳 ; Enami, Masayoshi
概要:
インフルエンザウィルスの遺伝子はマイナス鎖RNAと3種類のウイルスポリメラーゼ蛋白質、NP蛋白質が結合したRNP構成を形成し、感染細胞の核内で複製する。感染後期にRNPは細胞質へ移行し、ウイルス構造蛋白質と共に細胞表面で集合しウイルス粒子に
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取り込まれる。本研究では、ウイルスの粒子形成機構(ウイルス集合機構)を解明する事を目的とする。昨年度はウイルスM1蛋白質と膜蛋白質の相互作用と集合における機能に焦点を絞り解析を行った。本年度は、ウイルスRNPの核外輸送におけるウイルスNS1蛋白質の役割と機能構造の解析に焦点を絞った。ウイルス感染細胞内ではNS1蛋白質は核内でRNPに結合し細胞質内では遊離の状態で存在していた。NS1蛋白質はウイルス蛋白質中感染細胞内で最も強くリン酸化を受ける蛋白質である。種々のリン酸化酵素阻害剤6種類による、NS1蛋白質リン酸化の阻害を解析したところ、cGMP依存性蛋白質リン酸化酵素阻害剤H8による特異的阻害が確認された。またリン酸化阻害による、NS1蛋白質のRNPへの結合も阻害された。種々の部位特異的変異を持つウイルスを作成し解析する事は有力な手段である。これまでは限られた遺伝子にのみ変異の導入が可能であった。ウイルス粒子から単離したRNPを任意の遺伝子に対するcDNAとRNaseHで処理し、cDNAから試験管内で再構成したRNPと共に細胞に導入することにより様々な変異ウイルスを作成する技術を開発した。NS1蛋白質への変異導入により、これまで報告されていたNLS2(核移行シグナル2)及びeffectorドメインを含むC端側半分を削除してもウイルスは増殖し、必須ではない事が明らかとなった。<br />1) Influenza virus genome presents in RNP (ribonucleoprotein) complexes consists of eight spicies of negative-strand RNAs and PB1, PB2 PA and NP proteins. The genome replicates in the nucleus of the infected cells, which was exported to the cytoplasm and incorpolated to the virion together with structural proteins in the late phase of infection. In the present study, mechanism of virus assembly was investigated.2) The M1 protein was involved in the nuclear-export of the RNP.3) Interaction of the cytoplasmic tail of the HA and NA with the M1 was shown and it was important for the virus assembly.4) Inhibitor for cGMP-dependent protein kinase specifically inhibited the phosphorylation of the NS1 prtein as well as it's RNP-binding in vivo.5) We have developed a novel protocol to isolate influenza transfectant containing mutationsin the NS genome. The RNP,which was isolated from influenza virion, was treated with RNase H in the presence of NS cDNA.This was co-transfected to the cells together with in vitro-reconstituted NS RNPs. We have successfully isolated several NS mutants.<br />研究課題/領域番号:07670339, 研究期間(年度):1995-1996<br />出典：「インフルエンザウィルスの粒子形成機構」研究成果報告書 課題番号07670339 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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榎並, 正芳 ; Enami, Masayoshi
概要:
1)インフルエンザウイルスNA分節に、IRESを介在配列として約100-1800bpの種々の外来遺伝子を導入したウイルスの回収を試みた。短い遺伝子は安定に導入されたが、発現は極めて低かった。最も長い遺伝子として麻疹HA遺伝子を導入したウイル
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スを回収したが、HA遺伝子の約70%を欠失していた。既存の技術を用いたインフルエンザベクター系には発現レベルと安定性に問題のあることが判明した。2)そこで、インフルエンザゲノム中最もサイズが小さく遺伝子発現レベルの高いNSゲノムを当面の標的とし、新たな遺伝子組換え技術の開発を行った。ウイルス粒子から単離したRNPをNSのcDNA存在下RNaseHで処理し、NSのcDNAから試験管内で再構成したRNPと共に細胞に導入することにより様々な変異ウイルスを回収した。NLS2(核移行シグナル2)及びエフェクタードメインを含むC端側半分を削除すると、ウイルスは弱毒化した。N端側半分に12残基の欠失を持つウイルスは温度感受性となった。ウイルス弱毒化のプロトコールが得られた。次に、CAT遺伝子をNSゲノムへ2Aプロテアーゼ配列を介在配列として導入し、ウイルスを回収した。3)サブジェノミックRNAの非コード領域に、ゲノム特異的認識シグナルの存在が確認された。今後サブジェノミック型ベクター開発にはこの領域への変異導入が必要である。4)インフルエンザウイルスRNA転写・複製を促進する宿主因子RAFを同定した。今後、大量発現のヘルパー細胞としてRAFの過剰発現が利用可能と思われる。<br />1) We have isolated and analyzed viruses containing foreign genes (100-1800bp) in the NA genome. Short inserts were stable but the expression was low. Insertion of the measles virus H gene lead to 70% deletion of the insert. Therefore, previously described protocol was shown to be insufficient for practical use.2) Then we have developed a novel protocol to isolate influenza transfectant containing mutations in the NS genome. The RNP,which was isolated from influenza virion, was treated with RNase H in the presence of NS cDNA.This was co-transfected to the cells together with in vitro-reconstituted NS RNPs. We successfully isolated several mutants in which deletion of the C-terminal half of the NS1 protein attenuated the virus. The deletion of 12 residues in the N-terminal half read to the temperature-sensitive phenotype. This would be good protocol to generate live attenuate vaccine.3) It was shown that noncoding region of the genome may contain segment-specific regulatory signals.4) A host factor was isolated which stimulates influenza virus RNA transcription and replication. This factor may be useful for efficient expression of proteins from the virus genome in the future.<br />研究課題/領域番号:07557215, 研究期間(年度):1995-1996<br />出典：「インフルエンザウイルスを用いた多目的ベクターの開発と実用化」研究成果報告書 課題番号07557215 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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