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論文 |
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Shimizu, Atsushi ; Sasaki, Takashi ; Kwon, Jung Hee ; Odaka, Akito ; Satoh, Takanori ; Sakurai, Nobuhiko ; Sakurai, Takeshi ; Yamaguchi, Shotaro ; Samejima, Tatsuya
概要:
金沢大学理工研究域物質化学系<br />In our previous paper, we reported a mutant of recombinant Myrothecium verrucaria bilirubin oxidase,
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in which the Met467 residue was replaced by Gly. This mutant displayed a remarkable reduction in enzymatic activity and an evident decrease in the intensity of the absorption band around 600 nm (type 1 charge transfer transition). In this study, we report the preparation of three Met467 mutants (Met467Gln, Met467His, and Met467Arg) and characterize their enzymatic activities, midpoint potentials, and absorption and ESR spectra. Met467His and Met467Arg show no enzymatic activity and a great reduction in the intensity of the absorption band around 600 nm. Furthermore, their ESR spectra show no type 1 copper signal, but only a type 2 copper signal; however, oxidation by ferricyanide caused the type 1 copper signal to appear. On the other hand, Met467Gln as expressed shows both type 1 and type 2 copper signals in its ESR spectrum, the type 1 copper atom parameters being very different from usual blue copper proteins but very similar to those of stellacyanin. The enzymatic activity of the Met467Gln mutant for bilirubin is quite low (0.3%), but the activity for potassium ferrocyanide is similar (130%) to that of the wild type enzyme. These results indicate that Met467 is important for characterizing the features of the type 1 copper of bilirubin oxidase.
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論文 |
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友田, 燁夫 ; 米山, 良昌 ; 馬渡, 一浩 ; 長井, 雅子 ; Tomoda, Akio ; Yoneyama, Yoshimasa ; Mawatari, Kazuhiro ; Nagai, Masako
概要:
ヘモグロビン(Hb)分子において(F8)、および遠位(E7)ヒスチジン(His)はヘムの酸化を防ぐためにも、協同的リガンド結合のためにも重要である。HbMはこれらのHisの1つがチロシン(Tyr)におきかわった異常血色素で、そのヘムは通常酸
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化した状態にある。HbMを有する人は、明瞭はチアノーゼを呈するが、HbM Saskatoon(Sas)(βE7His→Tyr)を有する人は、他のHbM症(HbM Iwate,αF8His→Tyr;HbM Boston,αE7His→Tyr;HbM Hyde Park,βF8His→Tyr)に較べてチアノーゼが弱い。何故このようにHbMの種類によって症状が異なるかを明らかにするため、まず異常鎖の赤血球のメトHb還元酵素による還元性を調べ、次に異常鎖の構造を共鳴ラマン(RR)、電子スピン共鳴(ESR)分光法で調べた。 嫌気条件では、HbM Sasの異常鎖はヒト赤血球から精製したNADH-メトHb還元酵素によって、正常Hbのメト型とほぼ同速度で還元されたが、他のHbMの異常鎖は還元されなかった。事実、最近我々はHbM Sas症患者新鮮血においては、異常鎖の半分以上は還元型で存在することをみつけた。 共鳴ラマンスペクトルでは、4種のTyr置換型HbMは、いずれもFe-tyrosinate蛋白としての指紋バンド(1600、1500、1270cm^<-1>)を示し、Fe-tyrの結合は、HbM Sasで一番弱かった。Fe-ポリフィリンの振動モードでみると、HbM Sasの異常鎖のみが6配位型(ヘム鉄はF8HisとE7Tyrの両方が結合)で、他のHbMでは5配位型(置換Tyrとのみ強く結合)の軸配位をとっていることが判明した。この相違が還元性の違いの原因となっているのであろう。 一方、異常鎖を還元してやると、一酸化炭素(CO)と結合できるようになる。そこで、異常鎖のリガンド結合性を共鳴ラマン、赤外、^<13>C-NMR分光法で調べ、改めて正常Hbにおける近位および遠位Hisの役割について検討した。<br />In the hemoglobin (Hb) molecule, the proximal and distal histidines are the most important for preventing the ferrous heme from oxidation and for the cooperative ligand binding. Hbs M are mutant hemoglobins, one of these histidines of which is replaced with tyrosine, and their hemes are stabilized usually in ferric state. Although patients of Hbs M show obvious cyanosis, only individuals with Hb M Saskatoon (beta E7 His-Tyr) have less cyanosis than those of the other Hbs M (Hb M Iwate, alpha F8 His-Tyr; Hb M Boston, alpha E7 His-Tyr; Hb M Hyde Park, beta F8 His-Tyr). In order to know why such symptoms for indivisuals with Hb M differ from each other, we have investigated the reducibility of abnormal chains of Hbs M by erythrocyte methemoglobin reductases and the structure of abnormal chains by using resonance Raman (RR), and electron spin resonance (ESR) spectrometry.Under anaerobic conditions, abnormal chains of Hb M Saskatoon was reduced by methemoglobin reductases purified from huma n erythrocytes at almost the same rate as was metHb A. However, abnormal chains of the other Hbs M were scarcely reduced by these enzymes. In fact, we have found recently that more than half of the abnormal chains remained in ferrous state in the fresh bloods of individuals with Hb M Sastakoon.In the RR spectra, all of four Hbs M exhibited the fingerprint bands for the Fe-tyrosinate proteins (1600, 1500 and 1270 cm^<-1>) and Fe-tyrosinate proteins (1600, 1500 and 1270 cm^<-1>) and Fe-tyrosinate stretching frequency in abnormal chain of Hb M Saskatoon was the lowest among them. However, only Hb M Saskatoon displayed the Raman spectral pattern of a six-coordinate heme for the abnormal subunit while others displayed that of a five-cooordinate heme. From these observations, it is concluded that the heme in abnormal chains of Hb M Iwate, Hb M Boston and Hb M Hyde Park, bind only with the substituted tyrosine, whereas that of Hb M Saskatoon binds weakly both the proximal histidine and the substituted tyrosine.As abnormal chains of Hbs M can bind with carbonmonooxide (CO) after reduction by dithionite, we examined their unusual lignad binding properties by RR, infrared, and ^<13>C-NMR spectroscopy and discussed the role of the proximal and distal His on ligand binding properties in normal hemoglobin.<br />研究課題/領域番号:62480132, 研究期間(年度):1987–1988<br />出典：「ヘモグロビンMの分子病理学」研究成果報告書 課題番号62480132 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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渡邊, 一郎 ; Watanabe, Ichiro
概要:
金沢大学工学部<br />The synthesis of diamond films with defects as low as possible was performed using a capacitively coupled r
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f (13.56MHz) plasma CVD apparatus and an infrared-radiation heater. The films were prepared at various conditions keeping the total-flow rate of ethyl alcohol and hydrogen at 100 sccm and discharge power at 500 W and varying total-gas pressure, ethyl alcohol concentration, heating temperature and flow rate of added gas. Defects in the films were evaluated by nondiamond components in Raman spectrum and spin density in ESR,and the following results were obtained.(1) When a 0.5% carbon tetrafluoride is added keeping the concentration of ethyl alcohol at 0.5%, a high-quality film without nondiamond components grows even at a low temperature of 350ﾟC.The spin density of this film is 1.6*10^<18> cm^<-3>.(2) The temerature is increased in the above case. The highest-quality film grows at 550ﾟC.The spin density of this film is 5.2*10^<17>cm^<-3>, which is lowest in the present project.(3) When the concentration of ethyl alcohol and the temperature are kept at 1.0% and 350ﾟC,respectively, the highesr-quality film is obtained if a 0.2% carbon tetrafluoride is added. This film has a spin density of 7.3*10^<17>cm^<-3>. In contrast with the above case, the film degrades when the temperature is increased.(4) In the measurement of optical emission spectrescopy for the plasma formed by adding carbon tetrafluoride, an increase in the amount of C_2 and CH radicals is observed when the concentration of ethyl alcohol is 0.5 and 1.0%, respectively.(5) When nitrogen is added into the source gas, reduction in the spin density and the nondiamond component is observed in some cases. For improvement in film quality, nitrogen is not so effective as the carbon tetrafluoride.<br />出来る限り、低欠陥のダイヤモンド薄膜を合成することを目的として、容量結合型の高周波(13.56MHz)プラズマCVD装置に赤外線加熱を併用して、ダイヤモンド薄膜の合成を行った。エチルアルコールと水素の総ガス流量を100sccm、放電電力を500MWにして、総ガス圧力、エチルアルコール濃度、加熱温度、添加ガス流量を変化させ、種々条件での製膜を試みた。欠陥の評価としてはラマン分光による非ダイヤモンド成分、ESRによるスピン密度を用いた。このようにして、以下の結果が得られた。(1)エチルアルコール濃度を0.5%に保ち、4弗化炭素を0.5%添加すると、350℃の低温でも非ダイヤモンド成分の無い良質の膜が成長する。この膜のスピン密度は1.6×10^<18>cm^<-3>である。(2)上の場合、加熱温度を増加させてゆくと、550℃で最良の膜が成長する。この膜のスピン密度は5.2×10^<17>cm^<-3>で、この研究では最も少なくなっている。(3)エチルアルコール濃度が1.0%加熱温度が350℃の場合、4弗化炭素の量が0.2%のとき最も良質膜になり、このときの膜のスピン密度は7.3×10^<17>cm^<-3>である。加熱温度を高くすると、(2)の場合とは違って、膜質は悪くなる。(4)4弗化炭素を添加したときのプラズマの発光分析によれば、エチルアルコール濃度が0.5%のときにはC_2ラジカルの増加が、エチルアルコール濃度が1.0%のときにはCHラジカルの増加が観測される。(5)窒素を原料ガスに添加すると、ある場合には膜中のスピン密度と非ダイヤモンド成分の減少が観測される。膜質の改善に対して、窒素は4弗化炭素ほどは効果的でない。<br />研究課題/領域番号:06650011, 研究期間(年度):1994-1995<br />出典：「低欠陥ダイヤモンド薄膜の合成」研究成果報告書 課題番号06650011 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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論文 |
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櫻井, 武 ; Sakurai, Takeshi
概要:
金沢大学理学部<br />ウルシラッカーゼの酸素による酸化反応過程を検討し、酸素の3電子還元体を捕捉することに成功した。分光学的および磁気的にこの種をキャラクタリゼーションすることによって、この中間体がヒドロキシルラジカルであることを明らか
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にした。また、この中間体の消失過程の動力学を検討した。さらに、中間体の生成過程についても検討し、酸素の拡散速度や酵素内の銅中心間の電子移動過程が酸素の還元速度を支配していることを明らかにした。さらに、関与する種の拡散速度と電子移動速度のかねあいによって3電子還元体以前の中間体は捕捉不可能であることがわかった。そこで、酸素に対して不活性なタイプ2銅の選択的除去体に、嫌気下において、化学量論的な量の塩化第一銅を作用させることにより、タイプ1銅が2価、タイプ2、3銅が1価である混合原子価ラッカーゼを作成した。この1電子欠損状態にある誘導体においては、タイプ2銅から酸素還元中間体に対する電子移動速度が遅いために、通常の酵素反応中では捕捉することの出来ない酸素の2電子還元種を捕捉することに成功した。これらの結果を総合して、ラッカーゼによる酸素の4電子還元反応の全貌を明らかにすることが出来た。一方、ビリルビンオキシダーゼについても、3電子還元体を捕捉することに成功し、マルチ銅オキシダーゼによる酸素の電子還元反応は共通したプロセスをたどることがわかった。<br />The reactions of the reduced laccase and bilirubin oxidase with dioxygen were studied using mainly absorption and EPR spectra at a cryogenic temperature and also using stopped flow spectroscopy and SQUID magnetic measurement. The hydroxyl or oxyl radical bound to the trinuclear Cu site was detected as a reaction intermediate, three-electron reduced form of dioxygen, . Decays of this radical species were highly pH dependent on pH, indicating that the process was gated by the protonation to be water finally. A peroxide intermediate corresponding to the three electron reduced form of dioxygen could not be detected because diffusion of dioxygen to the trinuclear Cu site was rate-determining step and the electron transfer from type 1 Cu to the putative peroxide intermediate was very rapid. However, the peroxide intermediate could be detected by reaction dioxygen to the CuCl-acted type 2 Cu-depleted laccase under a strict anaerobic condition. Based on the successful detection and characterization of the two reaction intermediates the general reaction mechanism how dioxygen is four-electron reduced by multicopper oxidases was proposed.<br />研究課題/領域番号:11640558, 研究期間(年度):1999 – 2000<br />出典：「マルチ銅オキシダーゼの三核銅クラスターにおける酸素の4電子還元反応」研究成果報告書 課題番号11640558（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （ https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-11640558/116405582000kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作成
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