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論文 |
論文
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熊野, 智康
概要:
金沢大学大学院医学系研究科循環医科学専攻経血管診療学<br />ニワトリDT40細胞を用いたチェックポイント関連遺伝子Rad9の放射線感受性に関して検討した.方法は,ニワトリのBリンパ球由来の細胞株のDT40細胞を用い,Rad9のノックアウ
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ト細胞(Rad9-/-細胞)を作成した.放射線感受性を調べるため,コロニー形成法を用いて各線量での生存率を求めた.Rad9-/-細胞は野生型に比し,いずれの線量でも生存率が低く高感受性を示したが,X線高感受性のATMのノックアウト細胞に比べると低かった.紫外線やヒドロキシ尿素に対してRad9-/-細胞は著明な高感受性を示した.細胞周期チェックポイントへの関与では,X線照射後の分裂係数の測定でRad9-/-細胞はATM-/-細胞と同様に細胞周期遅延の異常を認めた.Rad9は高等動物細胞においても,DNA損傷やDNA複製阻害に対する感受性および細胞周期チェックポイント機構に重要な役割を果たしていると考えられた<br />原著論文
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論文 |
論文
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木村, 浩明 ; Kimura, Hiroaki
概要:
名古屋市立大学 / 金沢大学附属病院<br />細胞周期をリアルタイムで観察できる蛍光蛋白”Fucci”を導入したヒト骨肉腫細胞株143Bにin vitroでシスプラチン・ドキソルビシンを作用させリアルタイムイメージングを行った。その結果、
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細胞周期による抗がん剤の感受性の違い、抗がん剤の種類によるアポトーシスの起こり方の違いや細胞周期停止の様子を明らかにできた。<br />we utilized the fluorescence ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) imaging system to investigate the correlation between cell-cycle behavior and apoptosis after treatment of osteosarcoma cells with chemotherapeutic drugs.Osteosarcoma cell line 143B expressing FUCCI were treated with doxorubicin or cisplatinum, and we revealed that apoptosis behavior, cell cycle arrest, and chemotherapy sensitivity depending on cell cycle differs in each chemotherapy drugs.<br />研究課題/領域番号:25861301, 研究期間(年度):2013-04-01 – 2016-03-31
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論文 |
論文
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内田, 早苗 ; Uchida, Sanae
概要:
金沢大学イノベーション創成センター<br />私達は,ゲノムを第一標的としない非ゲノム損傷ストレスが細胞周期進行を担うCdc25AやCdc25Bの分解を介して,細胞周期停止を引き起こす現象を発見し,その制御機構を解析している。本研究では,C
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dc25Bの分解が,ストレス応答性MAPキナーゼによるSer101/103のリン酸化と,このリン酸化によって誘導されるSCF^<βTrCP>によるユビキチン化に依存している事を明らかにした。<br />We previously found that non-genotoxic stress, whose primary target is not genomic DNA, induced cell cycle arrest through the degradation of Cdc25A and Cdc25B. In this study, we discovered that Cdc25B was degraded through the ubiquitylation by SCF^<βTrCP> induced by the phosphorylation of Ser101/103 by stress-activated MAP kinases.<br />研究課題/領域番号:20570126, 研究期間(年度):2008 – 2010
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論文 |
論文
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浅野, 雅秀 ; Asano, Masahide
概要:
金沢大学 学際科学実験センター<br />(1)HP1γ変異マウスの始原生殖細胞(PGC)の解析HP1γはメチル化ヒストン(H3K9me)に結合するエピジェネティック制御因子の一つである。22年度はHP1γ変異マウスにおいてPGCの数が少な
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い原因をさらに追及した。PGCの運命決定や生殖隆起への移動,細胞死,ヒストン修飾に異常はなく,PGCの増殖に問題があることを明らかにした。E12.5の増殖期のHP1γ変異PGCはBrdUの取込みが有意に低下しており,フローサイトメトリーの解析からもHP1γ変異PGCはG1期に集積しており,S期への移行が抑制されていた。様々な細胞周期制御因子を解析したところ,HP1γ変異胚ではサイクリン依存性キナーゼ阻害活性を持つp21(Cip)を発現するPGCの割合が増加し,p21の集積がG1/S期移行の遅延を引き起こしている可能性が示唆された。しかしながらE11.5の野生型PGCとHP1γ変異PGCとのマイクロアレイ解析では,他の細胞周期制御遺伝子の発現に有意な違いは見られなかった。以上の結果をまとめて論文を投稿したところ,いくつかの追加実験を求められた。特にPGCの数の減少が最初に認められるE7.25のHP1γ変異PGCでもBrdUの取込みが低下していること,PGCのin vitro培養系でもHP1γ変異PGCの増殖が低下していることを明らかにして再投稿を行った。(2)ヒストン脱メチル化酵素の欠損マウスの作製ヒストンのメチル化はエピジェネティックな制御の中心的な役割を果たしているが,脱メチル化酵素はまだ不明な点が多い。二つの脱メチル化酵素遺伝子についていわゆるfloxマウスを作製し,TNAPCreマウスと交配することにより,生殖細胞特異的に欠損したマウスを作製している。これらの生殖細胞の解析は,次の2年間の本特定領域の研究テーマとして解析を進める予定である。<br />研究課題/領域番号:21028007, 研究期間(年度):2009 – 2010
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論文 |
論文
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小出, 寛 ; Koide, Hiroshi
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />本年度は、LRH1による下流分子の発現制御機構に関する解析を進めるとともに、LRH1が他の転写因子とネットワークを形成している可能性を見い出した。LRH1による細胞周期関連分子Cdk2およびサイクリン
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Eの発現制御機構に関しては、Cdk2およびサイクリンEの発現制御領域と思われる領域を単離し、Luciferaseをレポーター遺伝子として用いた実験を行った。その結果、発現制御領域にはLRH1の結合配列が見い出されず、これらの分子がLRH-1によって直接制御されているわけではないことが示唆された。これとは別に、LRH1が転写制御因子Dax1の発現を正に制御していることも見出した。興味深いことに、ある種の細胞においてはDax1はLRH1の負の制御因子として働くことが報告されている。これらのことから、ES細胞においてLRH1とDax1が互いに制御ループを形成している可能性が考えられた。さらにDax1が自己複製に必須な転写因子であるOct3/4に結合して、そのDNA結合能を阻害することを見い出した。一方で、Oct3/4はDax1の発現制御領域に直接結合し、その発現を正に制御していることも明らかにした。これらのことからES細胞においてDax1とOct3/4も互いに制御ループを形成していると思われる。以上の知見を総合すると、ES細胞において増殖を制御しているLRH1が、自己複製を制御しているOct3/4と、Dax1を介したクロストークを行っている可能性が考えられた。<br />研究課題/領域番号:20058011, 研究期間(年度):2008 – 2009
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論文
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中村, 暢宏 ; Nakamura, Nobuhiro
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />FinGER3,FinGER4はcis-Golgiに局在し複合体を形成する5回膜貫通タンパク質である。これまでに、RNAi法を用いて、FinGER3,FinGER4の発現抑制を行ったところ、FinGE
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R3,FinG直R4ともにRNAi処理後3日で顕著にタンパク質量の低下を認めたこと、またFinGER3,FinGER4のタンパク質量低下と共にゴルジ体が断片化し、細胞質に分散することを報告している。本年度はFinGER3,FinGER4の機能のさらに詳細な解析を行った。まず、FinGER3のタンパク質量低下に伴って若干のFinGER4タンパク質量の低下が起こる事を発見した。また逆に、FinGER4タンパク質量の低下によって顕著なFinGER3のタンパク質量低下が観察された。興味深いことに、FinGER3のタンパク質量低下に伴って細胞の増殖阻害が引き起こされる事が明らかとなった。FinGER3,FinGER4が複合体を形成することから、FinGER3のタンパク質量低下に伴って複合体を形成しないFinGER4量が増加し、このことが細胞の増殖阻害を導いている可能性が考えられた。一方、本年度は、以前に酵母Yip1のほ乳類での相同タンパク質としてER exit sitesに局在することが報告されていたFinGER5とYif1p相同タンパク質であるFingER7の機能解析を行った。FinGER5,FingER7に対する抗体を作成し、免疫蛍光染色法と細胞分画法によって詳細に解析を行ったところ、FinGER5,FingER7が小胞体とゴルジ体の中間区画(ERGIC)に局在すること、またFinGER5とFinGER7が複合体を形成することが明らかとなった。RNAi法を用いて、FinGER5,FinGER7の発現抑制を行ったところ、FinGER5,FinGER7ともにRNAi処理後3日で顕著なタンパク質量の低下を認めた。また、FinGER3,FinGER4のタンパク質量低下時と同様にFinGER5,FinGER7のタンパク質量低下と共にゴルジ体が断片化し、細胞質に分散することが明らかとなった。さらに、FinGER7のタンパク質量低下に伴って若干のFinGER5タンパク質量の低下が観察された。逆に、FinGER5タンパク質量の低下によって顕著なFinGER7のタンパク質量低下が観察された。興味深いことに、FinGER7のタンパク質量低下に伴って細胞の増殖阻害が引き起こされる事が明らかとなった。FinGER5,FinGER7が複合体を形成することから、FinGER3,FinGER4の場合と同様にFinGER7のタンパク質量低下に伴って複合体を形成しないFinGER5量が増加し、このことが細胞の増殖阻害を導いている可能性が考えられた。<br />研究課題/領域番号:17028016, 研究期間(年度):2005 – 2006<br />出典：「ゴルジ体の機能・構造情報のモニター機構の解明」研究成果報告書 課題番号17028016（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17028016/)を加工して作成
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論文 |
論文
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浅野, 雅秀 ; Asano, Masahide
概要:
金沢大学学際科学実験センター<br />昨年までにOrigin Recognition Complex (ORC)を構成するサブユニットの1つであるOrc4変異マウスが胎生4.5日目以降にアポトーシスを起こして致死となることを明らかにしたが
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、今年度はホモ変異胚をレスキューするためにloxP配列で挟んだOrc4遺伝子を導入したトランスジェニック(Tg)マウスの作出を行った。Orc4 cDNAをloxP配列で挟み、マーカー遺伝子としてInternal Ribosomal Entry Siteの制御下にGFPが発現するようにしたOrc4-GFPベクターを作製した。プロモーターにはCAGプロモーターとPGKプロモーターを用いた。まず、HeLa細胞およびNIH3T3細胞に導入して、GFPが発現することを確認した。次に、PGKプロモーター制御下にOrc4が発現するベクターを用いてTgマウスの作出を試みた結果、現在のところ2系統のTgマウスの作出に成功したが、内在性Orc4遺伝子のホモ変異マウスをレスキューするものは得られなかった。導入遺伝子由来のOrc4の発現を成体の臓器別に調べた結果、脳、小腸、筋肉、胸腺、脾臓、精巣では強い発現が確認できたが、心臓、肺、肝臓では弱い発現しか認められず、腎臓ではほとんど発現が認められなかった。内在性のOrc4はこれらの臓器においてほぼ同じレベルで発現していることから、ホモ変異マウスが生存できないのは導入遺伝子の発現が弱いためと考えられた。そこで、さらにTgマウスを作成すると共に、初期胚では導入遺伝子由来のOrc4の発現が十分であり、胚性幹細胞が樹立できる可能性があるので、ホモ変異胚の内部細胞塊培養を試みているところである。Orc4ホモ変異胚性幹細胞が樹立できれば、Creの発現によりOrc4を人為的に欠損させて、細胞周期やDNA複製におけるOrc4の役割を詳細に解析することができる。<br />研究課題/領域番号:15657045, 研究期間(年度):2003 – 2004<br />出典：「ORC4変異マウスを用いた個体レベルでの細胞周期研究」研究成果報告書 課題番号15657045（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-15657045/)を加工して作成
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論文
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伊藤, 正樹 ; Ito, Masaki
概要:
金沢大学理工研究域生命理工学系 / 名古屋大学<br />植物の発生において細胞分裂を時空間的に制御するためには、細胞周期に関わる遺伝子の発現を適切にコントロールする必要がある。このような細胞周期遺伝子を制御する主要な転写因子として、G1/
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S期制御に関わるE2FとG2/M期制御に重要なMYB3Rが知られている。本研究では、植物のMYB3RとE2Fが同一のタンパク質複合体に存在していることを初めて明らかにし、それが動物において知られるDREAM complexと進化的に関連している可能性を示した。またシロイヌナズナには、このような複合体が複数種類存在することなど、この複合体が示す植物特有の性質を明らかにした。<br />Proliferation of plant cells should be regulated spatially and temporally during plant organ growth. This regulation largely relies on the proper transcriptional regulation of the cohort of genes with cell cycle-related functions. Among them, two main classes of genes, G1/S- and G2/M-specific genes, are known to be regulated by families of transcription factors, called E2F and MYB3R, respectively. In this study, we first showed that MYB3R and E2F family proteins are present together in the same multi-protein complex in plants, which may be evolutionarily related to the protein complex, known as DREAM complex in animals such as human, fly, and worm. Unlike other organisms, plants specifically express multiple DREAM-like protein complexes that contain different members from E2F and MYB3R families and probably have distinct functions in the cell cycle.<br />研究課題/領域番号:26660290, 研究期間(年度):2014-04-01 - 2016-03-31
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論文 |
論文
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伊藤, 正樹 ; Ito, Masaki
概要:
金沢大学理工研究域生命理工学系 / 名古屋大学<br />植物の器官発生や環境ストレスに応じた成長の調節には、器官を構成する細胞の細胞周期、とりわけG2/M期の進行を適切に制御することが重要である。シロイヌナズナにおけるG2/M期制御因子の
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タンパク質分解に関する研究から、植物には核内RNA代謝異常により駆動する新奇な細胞周期チェックポイントが存在している可能性が示唆された。また、G2/M期制御因子の遺伝子発現制御に中心的な働きをするMYB3R転写因子が、塩ストレス下での成長抑制に積極的な役割を担っていること、さらにMYB3Rが植物の成長ホルモンとして知られるジベレリンの作用を、信号伝達因子DELLAとの相互作用を通じて媒介している可能性が示唆された。<br />For controlling plant organ growth in changing environment, it is important to properly regulate proliferation of component cells in growing organs. It has been believed that regulation at G2/M in the cell cycle is particularly important for plants that show endoreplication in their organ growth. In our genetic studies using Arabidopsis mutant with deregulated activity of mitotic regulator APC/C that acts as E3 ubiquitin ligase, we showed the possibility that a novel mechanism of cell cycle checkpoint may exist and may inhibit G2/M progression when nuclear mRNA metabolism is occasionally impaired. We also showed that MYB3R transcription factors, known as central regulators of G2/M-specific genes, play an important role in growth inhibition under salt stress, partially through its roles in gibberellin signal transduction where MYB3Rs physically interact with DELLA proteins and mediate the growth inhibition caused by the action of DELLA.<br />研究課題/領域番号:26291058, 研究期間(年度):2014-04-01 - 2017-03-31
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論文 |
論文
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伊藤, 正樹 ; Ito, Masaki
概要:
DNA倍加は細胞分裂を経ずにDNA複製を繰り返す特殊な細胞周期と見なされており、多くの植物の発生過程において、細胞の大きさ、代謝活性、細胞の分化などに関連した重要な現象であると考えられているが、その制御機構には未知な部分が多い。本研究ではD
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NA倍加の開始に関連する2つの因子、GIG1とSCLに着目し研究を行った。GIG1はM期の進行に必要なタンパク質分解系の負の制御因子であることを示した。また、SCLの機能はM期にDNA複製関連遺伝子の転写を抑制することではないかと考えられた。<br />Plant cells often increase their cellular DNA content (ploidy) during plant development, through the modified cell cycle where DNA replication occurs repeatedly without intervening cell division. Although it has been generally believed that increased cellular ploidy may be important for the control of cell size, metabolic activity, and cell differentiation, little is known about the regulatory mechanisms of this processes. In this study, we have focused on the two factors, GIG1 and SCL, that may have important roles in increasing cellular ploidy. We showed that GIG1 may negatively regulate ploidy increase by inhibiting a specific protein degradation system acing during G2 and mitosis. On the other hand, SCL may accelerate increasing ploidy by transcriptional repression of genes involved in DNA replication, possibly during M phase in the cell cycle.<br />研究課題/領域番号:22570040, 研究期間(年度):2010-2012
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論文 |
論文
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伊藤, 正樹 ; Ito, Masaki
概要:
植物のG2/M期特異的遺伝子群の発現はR1R2R3型のMyb転写因子により制御されていることをすでに明らかにいしている。本研究では、G2/M 期遺伝子の転写制御に関わる新奇因子を同定するため、シロイヌナズナのR1R2R3-Myb遺伝子破壊株
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に見られる細胞質分裂の異常が促進される変異体の単離およびその原因遺伝子の同定を行った。現在までに同定することができた原因遺伝子の一つは、細胞質分裂を制御するMAPキナーゼカスケードを構成するMAPKKキナーゼであった。また、他の複数の変異体についても同様に解析を進めており、原因遺伝子の同定を行う予定である。<br />研究課題/領域番号:19570034, 研究期間(年度):2007-2008<br />出典：「植物のG2/M期遺伝子の転写制御に関わる未知因子群の探索」研究成果報告書 課題番号19570034 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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論文 |
論文
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井上, 啓 ; Inoue, Hiroshi
概要:
Cyclin D1は、細胞周期調節のみならず、様々な転写因子の活性を制御している。肝臓Cyclin D1の遺伝子および蛋白発現は、絶食に伴い減少し、食事摂取後に増加した。培養肝細胞を用いた糖新生酵素プロモーター解析では、Cyclin D1の
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遺伝子導入により肝糖新生酵素遺伝子発現プロモーター活性が、減少した。これらの結果は、肝臓Cyclin D1が糖代謝制御に何らかの役割を果たす可能性を示している。<br />Cyclin D1 is known to regulate not only cell-cycle but also activity of various transcription factors. Through this investigation, we have uncoverd an alteration in hepatic cyclin D1 expression by fasting and refeeding. Fasting reduced the expression of cyclin D1 gene and protein and refeeding increased. We have also clarified that cyclin D1 suppressed the promoter activity of gluconeogenic gene in H42E hepatoma cell. These results suggest that hepatic cyclin D1 would plays a certain role in the regulation of glucose metabolism.
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論文 |
論文
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Wong, Wung Chuen Richard ; Wong, W. R.
概要:
金沢大学ナノ生命科学研究所<br />細胞核膜上に多数ある核膜孔は核膜孔複合体から成り立っており、その複合体は約30 種類の核膜孔複合体因子（ヌクレオポリン）から構成されている。本研究課題では、NPCタンパク質の詳細な細胞内動態を解析すると
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共に、ナノポアの再構成を試みることを目的としている。これら見出した結果について、Cell Cycle誌の表紙を含む７つの論文を発表した (図１)（インパクトファクターは平均～５）本研究課題で本研究室に在籍した4人の大学院生は、全員に受賞実績がある。<br />The nuclear pore complex (NPC) is the major gatekeeper of macromolecular traffic between the nucleus and cytoplasm. It is composed of multiple subunits comprising ≈30 proteins called nucleoporins. During cell division, transmembrane nucleoporins and nuclear envelope membrane fragments move to the endoplasmic reticulum, while other nucleoporins are disassembled into subcomplexes that are distributed throughout the mitotic cytoplasm to kinetochore, spindle and centrosome regions. In this project, we are investigating the association of NPC proteins assembly and disassembly during cell division. We constantly published peer-reviewed papers with impact factor 5 and our graduate students all received awards in the society or conferences.<br />研究課題/領域番号:23310151, 研究期間(年度):2011-04-01 – 2015-03-31
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論文 |
論文
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Wong, Wung Chuen Richard ; Wong, W. R.
概要:
金沢大学新学術創成研究機構<br />細胞核膜上に多数ある核膜孔は核膜孔複合体から成り立っており、その複合体は約30種類の核膜孔複合体タンパク質（ヌクレオポリン）から構成されている。ヌクレオポリンは核膜を介する物質輸送だけではなく様々な働き
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を持つ。我々はその中でもヌクレオポリンの細胞有糸分裂期における役割を研究している。本研究課題は有糸分裂期における集合・脱集合時に、ある種のヌクレオポリンが動原体、紡錘体、中心体に局在していることを明らかにした中で、中心体に局在するヌクレオポリンの役割について４報の論文を発表したこれらの論文はすべてインパクトファクターは平均５である。<br />Nuclear pore complexes (NPC) are large protein channels that act as the sole mediators of molecular exchange between the nucleus and the cytoplasm of eukaryotic cells. Besides its function in controlling nucleocytoplasmic transport, the NPC and its components have been found to exert many transport independent functions. One of the most studied ones are the mitotic roles of nucleoporins. We and others discovered that NPCs disassemble during mitotic nuclear envelope breakdown, many soluble nucleoporins have been found to relocate to kinetochores, mitotic spindles and centrosomes. In this project, we are investigating the NPC proteins at the centrosomes. We have published 4 papers (IF5) or above.
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論文 |
論文
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山本, 健一 ; Yamamoto, Ken-ichi
概要:
我々は,c-Ablファミリーの一員で機能が明らかではないArg(Abl related gene)について,そのノックアウト細胞がATMノックアウト細胞と同じように,Rad51 focus形成,放射線感受性,DNA組み換えや修復,等の異常を
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示し,さらに,ATM依存的に活性化されたArgがRad51と結合して燐酸化することから,ATMのDNA修復機能にArgが関与していることを明らかにした.今後,ATMがどのようにArgを活性化し,Argが燐酸化したRad51がどのように機能するのか,共同研究により生化学的解析を進める.また,ATM/ATRによって燐酸化されると同時に,DNA損傷のセンサーとして機能しているPCNA様のRad9およびRFC様のRad17のノックアウト細胞を作成し,その解析を行った.その結果,その機能は予想されるATRの機能と一致し,ATMの機能とは異なると考えられた.さらに,Rad9がTopBP1とは結合できるが,polymeraseδ,ε,ηとは結合していない予備的結果を得ている(東大分生研鶴尾教授および阪大花岡教授との共同研究,未発表).TopBP1に相当する酵母のDpb11はpolymeraseεと相互作用することから,Rad17-9はTopBP1を介して損傷部位にpolymeraseを動員している可能性が考えられる.我々は今後この重要な仮説を検証するため,TopBP1のノックアウト細胞を作成して解析するとともに,様々なノックアウト細胞におけるpolymeraseδ,ε,ηの動態を,BrdU, Rad9, TopBP1 focusとともに,抗体(現在作成中)を用いて解析する.<br />c-Abl tyrosine kinase is activated by DNA damage in an ataxia telangiectasia mutated (ATM)-dependent manner, and plays important roles in growth arrest and apoptosis. Arg (abl-related gene) is an only known homologue of c-Abl, and shares considerable structural and sequence homology with c-Abl in the N-terminal SH3, SH2 and tyrosine kinase domains. However, Arg roles in cellular response to DNA damage are unknown. To study possible roles for Arg in cellular response to ionizing radiation (IR), we generated Arg-/- cells from a chicken B cell line (DT40) by targeted disruption. We found that, unlike c-Abl-/-DT40 cells (1) but similar to ATM-/-DT40 cells (2), ionizing radiation (IR)-induced Rad51 focus formation is reduced in Arg-/-DT40 cells. This is consistent with the findings that Arg-/-DT40 cells display hypersensitivity to IR, elevated frequencies of IR-induced chromosomal aberrations, and reduced targeted integration frequencies. All of these abnormalities in DNA damage repair are also observed in ATM-/- but not in c-Abl-/-DT40 cells (1, 2). Finally, we found that Arg interacts with and phosphorylates Rad51 in 293T cells. These results suggest that Arg plays a role in homologous recombinational DNA repair by phosphorylating Rad51.<br />研究課題/領域番号:13680776, 研究期間(年度):2001-2002<br />出典：「高等動物ATMファミリーの細胞周期制御における機能とその活性化」研究成果報告書 課題番号13680776 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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論文 |
論文
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横田, 崇 ; Yokota, Takashi
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />胚性幹細胞(ES細胞)は、白血病阻害因子(LIF)の存在下においては、未分化状態を維持して増殖する。この時のES細胞の憎殖速度は他の細胞に比べて非常に速く、そのdoubling timeは約8時間であ
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る。一方、培地からLIFを除去すると、ES細胞の増殖速度が低下し、それとともに分化が誘導される。LIFの存在、非存在下でのES細胞の細胞周期を調べたところ、LIF存在下では全周期の30%程度の長さであったG1期が、LIF非存在下では50%ぐらいにまで伸びていた。このことから、ES細胞においては、LIFのシグナル伝達系の下流にES細胞の細胞周期を制御する因子が存在する可能性が考えられた。そこで、本研究ではそのような細胞周期制御因子の同定を試みた。まずマイクロアレイやRT-PCR法を用いることによって、LIF除去の際にその発現量が変動する細胞周期関連分子を探索した。その結果、LIF除去によって発現量が減少するものとして、cyclin E1やcyclin D1,Chk1を見い出した。一方、逆に発現レベルが上昇するものとしては、Cip1,14-3-3σ,cyclin G1,cyclin G2を見い出した。さらにCip1に関しては、強制発現させることによってLIF存在下でもES細胞のG1期を伸ばすごとが可能であることも見い出した。このことはLIFがCip1の発現を抑制することによってES細胞のG1期を短くしている可能性を示唆する。また興味深いことにLIF除去によって発現が上昇する4つの分子のうち、3つの分子がp53の標的分子である。そのためLIFがp53の発現量を制御してこれらの分子の発現を制御している可能性が考えられたが、LIF除去に伴うp53 mRNAの増加は観察されなかった。このことから、LIFが転写ではなく、翻訳後修飾を誘導することによってp53タンパク質の活性制御を行っている可能性が考えられた。<br />研究課題/領域番号:14033216, 研究期間(年度):2002 – 2003<br />出典：「幹細胞の未分化状態維持機構の解析」研究成果報告書 課題番号14033216（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14033216/)を加工して作成
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論文 |
論文
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山下, 克美 ; Yamashita, Katumi
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />Cdc25Bの安定性がN-末端側の85番めから103番めまでの領域のリン酸化状態に依存することを発表した。本研究では、Cdc25Bの安定化に働くPPaseの同定を目指した。Cdc25Bの安定性の検定は
…
、GFP融合Cdc25Bを発現させ蛍光強度をモニターすることで行なう。GFP融合Cdc25B発現を指標に単離したクローンは、継代によりGFPシグナルが減弱するため現在まで求める細胞株は得られていない。オカダ酸処理による予備的な結果をもとに、当該PPaseの第一候補としてPP2Aを選択している。このサブユニットタンンパク発現ベクターを樹立しており、細胞株を樹立次第予定の研究を開始できる状態にある。<br />We have reported that stability of Cdc25B is depending on the phosphorylation state of its N-terminus region; unstable in high phosphorylation level and stable in low situation.In this project, we aimed to identify PPase that stabilize Cdc25B, preliminary results being strongly indicating PP2A is a primary candidate. We planned to monitor Cdc25B expression with green fluorescence (GF) of GFP-fused Cdc25B. We isolated several positive clone but gradual decrease of GF signal was observed in all cloned isolated. The reasons of which have not yet verified but high level Cdc25B expression would be toxic to cells. We have been trying to isolate suitable clone for detecting Cdc25B expression whose protein level would be low but detectable, and healthy for established cells.Along with the clone isolation, we have established plasmids, by using which we can inducibly express PP2A subunit protein. As soon as cell lines will be isolated, we start the project to clarify responsible PPase.<br />研究課題/領域番号:15K06993, 研究期間(年度):2015-04-01 - 2018-03-31
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論文 |
論文
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本多, 政夫 ; Honda, Masao
概要:
金沢大学附属病院<br />C型肝炎ウイルス(以下HCV)は一本鎖のプラス鎖RNAウイルスであり、その5'末端非翻訳領域(5'NTR)にはウイルス蛋白翻訳機能を有するInternal ribosomal entry site(IRES)が存
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在する。このIRES依存性蛋白翻訳機能を生理的条件下で検討するため、我々はまず、真核生物の発現プロモーターとして汎用されているサイトメガロウイルス(CMV)のプロモーターの下流にRenilla luciferase(R-luci),HCVの5'NTR,Firefly lucifersase(F-luci)の順で遺伝子を組み込んだベクターを作成し、この遺伝子をHuh-7細胞に導入し、安定に発現している細胞(RCF-1、RCF-26)を樹立した。この樹立細胞を用いて、通常の真核生物の蛋白翻訳機能(キャップ依存性)とHCVのIRESによる蛋白翻訳機能(IRES依存性)を比較した。サイクロヘキサミド処理では、それぞれの蛋白翻訳機能は同様に低下した。ポリオウイスル感染では、キャップ依存性の蛋白翻訳能は低下し、IRES非依存性の蛋白翻訳の上昇が認められた。細胞周期を同期させ蛋白翻訳能を検討すると、HCVのIRES非依存性蛋白翻訳能は細胞の分裂期(M)で高く、休止期で(G0)低く制御され、細胞周期依存性の変化が認められた。以上よりHCVの蛋白翻訳能は細胞周期と密接に関わっており、ウイルス複製と肝炎における細胞死、再生との関連が示唆された。<br />研究課題/領域番号:10770226, 研究期間(年度):1998 – 1999<br />出典：「C型肝炎ウイルスの蛋白翻訳開始機構に関する検討」研究成果報告書 課題番号10770226（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10770226/)を加工して作成
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論文 |
論文
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山本, 健一 ; Yamamoto, Kenichi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />我々は,ATMの重要な標的因子の一つのc-Ablは,そのノックアウト細胞の角蜥から,ATMのDNA修復機能には関与していないことを明らかにしたが,最近c-Ablファミリーの一員で機能が明らかではないAr
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g(Abl related gene)について,そのノックアウト細胞がATMノックアウト細胞と同じように,Rad51focus形成,放射線感受性,DNA組み換えや修復,等の異常を示し,さらに,ATM依存的に活性化されたArgがRad51と結合してチロシン燐酸化することから,ATMのDNA修復機能にArgが関与していることを明らかにした(論文準備中).DT40でのノックアウトが致死的であったATMファミリーのATRのノックアウトついては,Cre-loxP系を使ったノックアウトとATRの涯渡変異体のノックインの共同研究を進めている.さらに,最近Cambridge大Jackson教授のグループが出芽酵母Mec1にDNAとともに結合している因子として生化学的に同定したlcd1について,DT40細胞での遺伝子ノックアウトによる機能解析を共同研究で進めている.従来,放射線等のDNA損傷によるJNK活性化には,ATMおよびc-Ablが重要であると考えられていた.しかし,ATM, c-Abl、及びArgのDT40ノックアウト細胞での解析では,放射線等によるJNK活性化は正常あるいは亢進していた.一方,DNA-PKおよびKu70ノックアウト細胞(京大武田教授・放医研阿部博士)では,放射線等によるJNK活性化が認められず,また放射線によるアポトーシスも極度に低下していた.従ってDT40等のB細胞系の細胞では,放射線等によるJNK活性化やアポトーシスにはDNA-PK/Ku70が重要であると考えられ,BTKを含め,DNA-PKの下流のシグナル因子の同定を現在進めている.<br />研究課題/領域番号:13214038, 研究期間(年度):2001<br />出典：「ゲノム維持機構におけるATMファミリーの機能とその異常による発がん機構の解析」研究成果報告書 課題番号13214038（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13214038/)を加工して作成
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論文 |
論文
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仲, 一仁 ; Naka, Kazuhito
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />C型肝炎ウイルス(HCV)の持続感染におけるTLR3シグナル経路の活性化機構,及び慢性肝炎発症から肝細胞癌発症に至るメカニズムは明らかではない.そこで.ヒト非癌不死化肝細胞株を用いてHCV蛋白質の細胞周
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期進行に及ぼす影響を解析した.ヒト非癌不死化肝細胞株PH5CH8,並びにNKNT-3細胞を用いてHCV構造蛋白質コアと非構造蛋白質NS3,NS4A,NS4B,NS5A,及びNS5Bの発現系を構築して細胞周期の進行を解析した結果,NS5B発現細胞においてS期の進行が遅延していることが明らかになった.このS期進行阻害はNS5B発現細胞におけるIFN-βの発現誘導に起因していた.IFN-βの誘導やS期の進行阻害は,NS5B発現細胞にTLR3に対するsiRNAを処理してTLR3の発現を抑制すると解消されることから,TLR3依存的にIRF-3シグナル経路を活性化され,IFN-βの産生が誘導されたと考えられる.ゲノムDNAの損傷時におけるDNA修復は遺伝情報を正確に伝達する上で極めて重要であり,その異常は発がんの原因になると考えられている.そこでNS5B発現による細胞周期の進行阻害がDNA修復異常を引き起こす可能性を検証した.NS5B発現細胞をDNAアルキル化剤(MMS),過酸化水素,DNA一本鎖切断を引き起こすUV-B,DNA二本鎖切断を引き起こすAdriamycinやNeocarzinostatinで処理し,その後のDNA修復能をコロニー形成を解析した結果,DNA二本鎖切断を引き起こす処理をした場合NS5B発現細胞のコロニー形成数が著しく減少することが明らかになった.以上の結果,NS5B発現細胞において細胞周期のS期の進行が遅延してDNA損傷に対する感受性が増強することが明らかとなり,NS5B蛋白質が肝発がんに関与する可能性が示唆された.<br />研究課題/領域番号:16790273, 研究期間(年度):2004 – 2005<br />出典：「C型肝炎ウイルス蛋白質NS5BによるIRF3活性化機構の解析」研究成果報告書 課題番号16790273（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16790273/)を加工して作成
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| 21.
論文 |
論文
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中村, 暢宏 ; Nakamura, Nobuhiro
概要:
金沢大学理工研究域<br />細胞分裂期のゴルジ体の分散とpS277の増加は細胞分裂開始時に同じタイミングで起こるが、細胞分裂終了時のゴルジ体の再形成とpS277の脱リン酸化は同時ではなく、再形成し始めたゴルジ体上にpS77が残っていた。し
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たがってGRASP65の脱リン酸化は、ある程度小胞が融合した後に起こるものと考えられた。細胞質型GRASP65タンパク質を微細注入すると、ヒストンH3のリン酸化が抑制された。AuroraBがヒストンH3をリン酸化することから、GRASP65がAuroraBの活性の制御に関わる可能性が示唆された。中心体の分離機構に影響はみられなかった。中心体の分離機構にはリン酸化酵素であるNek2がはたらいている。Nek2をはじめとする中心体分離機構にはGRASP65は影響しないことが示唆された。Plk1は細胞分裂期にCdk1-cyclinBとともにGRASP65をリン酸化することが報告されている。本研究では分裂期細胞質でS277がリン酸化されたGRASP65タンパク質がPlk1FLやPBDに結合することが明らかとなった。S277のリン酸化を認識して結合したPlk1はGRASP65をさらにリン酸化することや、その周囲にあるゴルジ体局在タンパク質のリン酸化にはたらくことが予想される。GRASP65をはじめとするゴルジ体局在タンパク質のリン酸化が細胞分裂の進行を制御するシグナルとしてはたらいているとすれば、細胞分裂期に起こるゴルジ体の分散はゴルジ体の成分を娘細胞に均等に分配するための受動的な役割だけでなく、リン酸化シグナルを細胞全体に広げ細胞分裂を制御するための能動的な役割を持つと推測される。<br />GRASP65 is phosphorylated at S277 by cdc2/cyclin B and may participate in the regulation of mitotic entry. The role of GRASP65 S277 phosphorylation in cell cycle regulation was analyzed by two approaches. (1) Injection of recombinant GRASP65 G2A mutant, which cannot localize to the Golgi apparatus and accumulate in the cytoplasm, into the cells inhibited the phosphorylation of histone H3 in early prophase but not the centrosome separation. This result suggested that phosphorylation of histone H3 and centrosome separation are independently regulated at the onset of mitosis and S277 phosphorylation of GRASP65 may have some role in the regulation of those events. (2) Biochemical analyses revealed that Plk 1 binds to GRASP65 phosphorylated by mitotic e and this was dependent on the phosphorylation of S277. The binding is mediated by polo-box domain of Plk1. This result suggested that GRASP65 phosphorylated at S277 recruit Plk1 and function as a signaling scaffold at the onset of mitosis.<br />研究課題/領域番号:18570173, 研究期間(年度):2006 – 2007<br />出典：「細胞増殖の調節におけるゴルジ体の役割の解明」研究成果報告書 課題番号18570173（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-18570173/185701732007kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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| 22.
論文 |
論文
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広瀬, 豊 ; Hirose, Yutaka
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />RNAポリメラーゼII(Pol II)最大サブユニットのカルボキシル末端領域(CTD)には、特徴的な7アミノ酸配列(Y-S-P-T-S-P-S)の繰り返しが存在している。CTDはリン酸化を受けることによ
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ってmRNAプロセシング因子と特異的に結合し、転写過程のみならず転写後のmRNA成熟過程にも重要な役割を担っていることが近年明らかになってきている。私は、転写過程とmRNAプロセシング過程を協調させている分子メカニズムの解明にアプローチするために、リン酸化CTDに結合する新規蛋白質の同定と機能検索を行っている。これまでにヒト新規蛋白質PCIF1および細胞周期調節関連蛋白質Pin1が、これらの蛋白質中に共通して存在しているWWドメインを介してリン酸化CTDと特異的に結合することを見出している。本研究において、これらの蛋白質の構造と機能を更に解析し以下のような知見を得た。(1)免疫組織学的観察およびヒト培養細胞抽出物に対する免疫沈降法による解析は、PCIF1とリン酸化Pol IIとの細胞内における会合を示唆した。(2)検査した全てのヒト組織においてPCIF1 mRNAの様な発現を検出した。(3)PCIF1およびPin1のヒト培養細胞に於ける過剰発現は、レポーター遺伝子発現のトランス活性化をそれらの発現量に依存して強く抑制した。(4)PCF1及びPin1の細胞内ターゲットを、酵母two-hybrid法及びGST-pull down法によって検索し、遺伝子発現に関わる数種の核内因子を候補として得た。リン酸化基質特異抗体を用いたスクリーニングから、PCIF1がPin1と同様にリン酸化蛋白質を標的にしていることが示唆された。(5)リン酸化CTDペプチドを用いた結合実験に於いて、PCIF1のWWドメインはCTD7アミノ酸配列中5番目のセリンのみがリン酸化したCTDペプチドに対し2番目のセリンのみがリン酸化したものに比べより強いアフィニティーを示したが、Pin1のWWドメインは両者を区別しなかった。<br />The carboxy-terminal domain (CTD) of RNA pqlymerase n (Pol II) largest subunit is consist of multiple repeats of 7 amino acids peptide (Y-S-P-T-S-P-S). Phosphorylation of the CTD has been suggested as an important signal for recruitment of pre-mRNA processing factors to transcription sites to coordinate each step of mRNA synthesis. To approach to the molecular mechanism in which transcription couples with pre-mRNA processing, I have identified and characterized novel human factors that can directly bind to the phosphorylated CTD (P-CTD). One such protein is novel and named as PCIF1. The other is Pin1, which has been implicated in cell cycle regulation. The WW domain in PCIF1 and Pin1 was responsible for the specific interaction with P-CTD. In this research, I got following findings. (1) PCIF1 mRNA was ubiquitously expressed among various human tissues. (2) Transiently expressed recombinant PCIF1 was co-immunoprecipitated with endogenous hyperphosphorylated Pol II (Pol IIO) from human cell extracts. Confocal microscopic analysis showed association of PCIF1 with Pol IIO. (3) Overexpression of PCIF1 or Pin1 in human cultured cells could strongly repress trans-activation of the reporter gene expression driven by various transcription activation domains. (4) Several nuclear factors involving in gene expression were identified as targets of PCIF1 and Pin1 in yeast two-hybrid screening and GST pull-down experiments from human cell extracts. PCIF1 WW domain could bind several human proteins recognized by a phosphorylated substrate specific antibody. (5) PCIF1 WW domain could preferentially bind to a CTD peptide phosphorylated at only Ser 5 position against a CTD peptide phosphorylated at only Ser 2 position. In contrast, Pin1 WW exhibited same affinity to botji CTD peptides.<br />研究課題/領域番号:12680672, 研究期間(年度):2000 – 2001<br />出典：「RNAポリメラーゼIIのリン酸化CTDに結合する新規蛋白質の機能解析」研究成果報告書 課題番号12680672（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12680672/ ）を加工して作成
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