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柴田, 幹大 ; Shibata, Mikihiro
概要:
金沢大学ナノ生命科学研究所<br />本研究は、生体分子のナノ動態を撮影できる高速原子間力顕微鏡（高速AFM）と、単粒子解析法やディープラーニングによる画像解析を融合し、タンパク質部位の揺らぎ・構造変化を定量化できる画像解析システムの構築を
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目指した。具体的には、高速AFM動画にMotionCor2を適用し、サブナノメートルの精度で約200枚のAFM画像をドリフト補正することに成功し、その積算画像を得た。積算画像では、タンパク質の動きの少ない部位は空間分解能が向上する一方、揺らぎの大きな部位は分解能が下がり、これを利用してタンパク質内のどの部位が、どの程度の揺らぎを持つのかを定量化することが可能となった。<br />High-speed atomic force microscopy (HS-AFM) is a unique technique to capture a nano-dynamics of biomolecules under the near physiological conditions. The purpose of this study is to build the image analysis which is capable to quantify fluctuation and structural changes of proteins by combining with single-particle analysis and deep learning. Specifically, we applied MotionCor2 to HS-AFM movies of proteins. As a result, we succeeded in drift-correcting about 200 AFM images with a sub-nanometer accuracy and obtained the integrated image. In the integrated image, the spatial resolution is improved in the part where the protein has a little fluctuation, while the resolution is decreased in the part where the fluctuation is large. Thus, this new combined method allows us to quantify a fluctuation of proteins.<br />研究課題/領域番号:18K19287, 研究期間(年度):2018-06-29 – 2020-03-31<br />出典：「高速原子間力顕微鏡と高度画像解析の融合による近原子分解能AFM画像への挑戦」研究成果報告書 課題番号18K19287（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-18K19287/18K19287seika/)を加工して作成
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柴田 , 幹大 ; Shibata, Mikihiro
概要:
金沢大学ナノ生命科学研究所<br />CaMKIIは脳の神経細胞に存在し、記憶の形成に重要な役割を果たす。CaMKIIは12量体を形成し、Ca2+の高頻度刺激を積算（記憶）することができるため、多量体構造の中に“記憶の分子メカニズム”が隠さ
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れていると考えられてきたが、その詳細は不明であった。本研究は、CaMKIIに高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を適用し、CaMKIIのハブドメインが信号を積算するために強力な分子集合能力を持つこと、キナーゼドメインが１２量体構造を制御すること、さらに、２つを繋ぐリンカー部分の柔軟性が、CaMKIIの活性化に重要であることを実験的に示し、記憶の分子メカニズムの一端を明らかにした。<br />CaMKII is enriched in neurons and plays an important role for learning and memory. Because CaMKII forms 12-mer holoenzyme that responds to the frequency of the activating signal of Ca2+, an assembly of CaMKII oligomers could be a key element of a molecular mechanism of learning and memory. However, there is no direct evidence that a formation of CaMKII oligomer relates to a memory mechanism.HS-AFM movies of CaMKII showed solid structures and fluctuated globular structures. By using truncated CaMKII, solid and globular structures were assigned to hub and kinase domains, respectively. Interestingly, 14-mer ring structures were observed in the truncated CaMKII, while 12-mer structures were observed in full-length CaMKII. These results suggest that hub domain has a strong assemble ability, while kinase domain regulates an oligomeric structure of CaMKII. Furthermore, HS-AFM revealed that a flexibility of a linker region is important for the activation of CaMKII.<br />研究課題/領域番号:16K18523, 研究期間(年度):2016-04-01 – 2018-03-31
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荻野, 千秋 ; Ogino, Chiaki
概要:
金沢大学大学院自然科学研究科<br />8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG)はDNAの構成成分である2'-deoxyguanosine (dG)が酸化されることにより生成される物質である。8-OHdGが生
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成するとDNA→RNAが発現する等生体に悪影響を及ぼすため生体は損傷したDNAを修復する機構をもっており、修復過程の結果、8-OHdGは正常なdGに置き換えられ、血中に排出される。8-OHdGは、比較的安定な物質であり、体内で分解されることなく、最終的に尿中に排出される。このように、尿中に存在する8-OHdGは生体内での酸化ストレスと密接に関係している。従って、尿中の8-OHdGの存在量を測定することは、生体がどの程度酸化ストレスにさらされているか、ひいては老化の程度、疾病の有無等を間接的に評価することにつながる。現在、この8-OHdGは免疫学的測定法を用いて測定することが可能である。しかしこの測定素子である抗体は熱、pHに対し不安定な性質を持ち、測定環境には制約がある。そこで本研究室では8-OHdGの測定素子として生体材料であるDNAアプタマーを用いる方法に注目した。DNAアプタマーは特定の分子と結合できる一本鎖のDNAの総称である。一般にDNAは生体内では二本鎖で存在し二重らせん構造を形成するが、一本鎖のDNAは様々な高次構造を形成することが知られており、この高次構造の様々な立体構造が分子との結合に関与していると考えられている。DNAアプタマーは、その分子の性質上、環境変化に安定であり、大量合成も容易である。これらの性質は熱、pHに不安定な抗体や酵素などのタンパク質と比較して有利である。本研究では8-OHdGを認識するDNAアプタマーの選抜とその機能評価、及びバイオセンサーのセンサ素子への応用を目的とし研究を行っている。これまでに我々は8-OHdGを認識するDNAアプタマーの選抜に成功し、その配列を特定した。そこで本研究では特定された配列について、BLACORE、蛍光偏光法及び限外ろ過の原理を用いて機能評価を行った。その結果、Sequence Qと命名した配列に8-OHdGに対して強い親和力を示すデータが得られた。またSequence Qについて8-OHdGと構造が類似したdGに対しては結合を示すデータは得られなかった。このことからSequence Qの8-OHdGに対する親和性は特異的なものであると考えられる。さらにCDスペクトル解析を用いてSequence Qの構造解析を試みたがG-カルテット構造を示すようなスペクトルは得られなかった。<br />研究課題/領域番号:18038016, 研究期間(年度):2006<br />出典：「DNAアプタマーによる生体ストレスマーカー分子検出系の開発」研究成果報告書 課題番号18038016（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18038016/)を加工して作成
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
金沢大学理工研究域物質化学系<br />我々が世界に先駆けて開発した高速原子間力顕微鏡をタンパク質などの生体高分子の機能ナノ動態撮影に実用化する上で障害となる装置上の問題点を発見・解決するとともに、特定の試料対象に対してその基板への固定法な
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どを開発し、高速原子間力顕微鏡をタンパク質の新しい研究手段にすることを本研究は目指している。対象試料をモータータンパク質系に絞って研究を進めてきた。モータータンパク質(ダイニンC、ミオシンV)が単独に在る場合には、マイカ表面を改変せず、また、溶液条件を特別なものにしなくとも、これらの蛋白質は緩やかにマイカ表面に吸着し、分子内のかなりの部分がマイカ表面から自由であった。従って、ATPase反応にともなう構造変化を比較的容易にイメージングできた。ダイニンCでは、ストークとヘッド部はATPの影響が見られないのに対して、ステム部はATP存在下で2つの位置を行ったり来たりする様子が観察された。その頻度はATPターンオーバー時間にほぼ等しく、ステムの運動がATPase反応に共役していることは明らかである。ミオシンVのATPase活性は極めて低いので、構造形態変化を繰り返し捉えることは難しい。そこで、Caged-ATPに紫外線を照射しATPを放出する前後をイメージングする方法でATPase反応にカップルした構造形態変化を捉えた。紫外線照射後素早く頭部が大きく屈曲し、1-2秒の内にもとのまっすぐな形態に戻った。装置の改良により、ATP存在下でアクチンフィラメントとミオシンVが弱く相互作用する系についても、系を乱すことなく、イメージングすることが可能になった。現在この系に集中して、ミオシンVの動的挙動の研究を進めている。ダイニンCとマイクロチュービュルが共存する系については未だ着手していない。<br />研究課題/領域番号:14654071, 研究期間(年度):2002 – 2003<br />出典：「タンパク質の分子機能動態及び場のリアルタイムイメージングを目指して」研究成果報告書 課題番号14654071（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14654071/)を加工して作成
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岡林, 則夫 ; Okabayashi, Norio
概要:
金沢大学理工研究域数物科学系<br />非弾性電子トンネル分光（Inelastic Electron Tunneling Spectroscopy: IETS）を用いた単分子膜におけるトンネル電流の経路解明にむけて、IETSにおける探針先端
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の形状の影響を、走査トンネル顕微鏡と原子間力顕微鏡を組み合わせて調べた。探針先端の原子数が一個の場合、探針先端の原子数が三個の場合に比べて、Cu表面上のCO分子に対するIETSの強度が４倍程度大きくなることを見出した。この結果を、（a）全トンネル電流に対する分子を介したトンネル電流の割合、ならびに（b）分子を介したトンネル電流における非弾性トンネル過程の能率という二つの観点から解釈した。<br />Towards the investigation on the pass of tunneling electrons through the self-assembled monolayer by using inelastic electron tunneling spectroscopy (IETS), the role of a tip apex is investigated by combing scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy. It was found that the tip whose apex consists of a single atom provides the four times larger IETS signal over the tip whose tip apex consists of three atoms. This finding was interpreted in terms of (1) the current ratio of a process through the molecule to that of the total current and (2) efficiency of the inelastic process for the process involving the molecule.<br />研究課題/領域番号:25790055, 研究期間(年度):2013-04-01 - 2015-03-31
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中山, 隆宏 ; Nakayama, Takahiro
概要:
金沢大学新学術創成研究機構, ナノ生命科学研究所<br />コラーゲン分解酵素の反応触媒メカニズムを明らかにすることを目的として、当該酵素が反応中にコラーゲンの高次構造の中でどのような挙動を示すかを観察し、挙動を解析した。本研究では、コラー
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ゲン分解酵素の挙動とコラーゲン高次構造を同時に観察することが極めて有効であるため、高速原子間力顕微鏡を用いて観察した。細菌型コラゲナーゼがコラーゲン特有の高次構造によって活性が制御される様子、コラゲナーゼ分子がコラーゲンのカルボキシル末端からアミノ末端へ一方向に運動する様子を録画することに成功した。この運動がコラーゲン分解活性と固く共役していることを明らかにした。<br />To reveal the mechanism by which collagenases degrade collagen fibrils, we observed and analyzed the collagenase movement on the collagen quaternary structure. High-speed atomic force microscopy, which allows simultaneous observation of the enzyme movement and the substrate structure, is effective for achieving the goal of this study. We observed and analyzed the collagenase behavior Our results clearly visualized that bacterial collagenases bind on and degrade from the lateral edge of collagen fibrils and that hierarchical structure of collagen prevents collagenase molecules from engaging in collagenolytic reactions. In addition, we also demonstrated that the bacterial collagenase molecules move on collagen fibrils from the amino- to the carboxyl terminus of collagen molecules, depending on their activities.<br />研究課題/領域番号:25870262, 研究期間(年度):2013-04-01 - 2015-03-31
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古寺, 哲幸 ; Kodera, Noriyuki
概要:
金沢大学新学術創成研究機構, ナノ生命科学研究所<br />ミオシン6とミオシン10は、アクチンフィラメント上を移動する2つの脚をもつモータータンパク質である。興味深いことに、脚の長さが短いにもかかわらず、大きな歩幅で運動することが分かって
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いる。しかしながら、それらが運動する最中の構造的な情報は一切得られていないため、その運動メカニズムは未解明であった。本研究では、高速原子間力顕微鏡を用いて、運動中のミオシン6とミオシン10の構造形態を高い時間・時間分解能で直接観察することを行った。その結果、各ミオシンが大きな歩幅と小さな歩幅をとりながら、ふらふらと一方向に進む運動を直接観察することに成功し、各ミオシンの運動メカニズムの理解を深めることができた。<br />Myosin 6 and 10 are two-headed molecular motors that move along actin filaments. Intriguingly, it is known that these motors move with a large stride than that expended from their leg length. However, their functional mechanisms have not been elucidated yet, due to the lack of structural evidence. Here, we applied high-speed atomic force microscopy to directly observe their structural dynamics at high spatiotemporal resolution. Net wiggly processive movements with large and small strides performed by these myosins were directly visualized. The large stride was made by a lever-arm extension in their tail domain. The direct evidence obtained here should lead to better understanding the functional mechanism of these myosins.<br />研究課題/領域番号:24770149, 研究期間(年度):2012-04-01 - 2015-03-31
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古寺, 哲幸 ; Kodera, Noriyuki
概要:
ミオシン6は、ミオシンスーパーファミリーの中で唯一アクチンフィラメントのマイナス端に向かって移動するミオシンで、脚が短いにも関わらず大きな歩幅で運動することが分かっている。しかしながら、それらが運動する最中の構造的な情報は一切得られていない
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ため、その運動メカニズムは未解明であった。そこで、本研究では、高速原子間力顕微鏡を用いて、運動中のミオシン6の構造形態変化を直接観察した。その結果、その運動メカニズムの解明につながる構造的証拠を得ることに成功した。<br />Myosin 6 is the only myosin among myosin superfamily that moves to the minus end of actin filament. Interestingly, it is known that myosin 6 walks with larger stride than that expected from their foot length. However, their functional mechanism has not been elucidated yet, due to the lack of structural evidence. Here, we performed high-speed atomic force microscopy to directly observe their structural dynamics of myosin 6 at work. Then, the structural evidence was successively obtained for the first time, leading to better understanding the functional mechanism of myosin 6.
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福間, 剛士 ; Fukuma, Takashi
概要:
金沢大学新学術創成研究機構ナノ生命科学研究所<br />シールド機構を備えた原子間力顕微鏡（AFM）を開発し、それにより液中AFMの安定性および力分解能を改善した。電子顕微鏡観察用の窒化シリコンメンブレンに集束イオンビームにより微小な穴を設
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け、そこを通して探針のみを液中に浸漬することを可能とした。また、カンチレバーとメンブレンとの接触を避けるために、カンチレバーに比較的長いクオーツ探針を接着し、さらにその先端に電子線堆積（EBD）カーボン探針を作製した。これらの工夫により、探針のみを浸漬した状態での原子分解能観察を実現し、力分解能を3倍程度改善した。この技術は、気体発生環境下での安定な計測や、電位分布計測技術の定量性改善に有用であると期待される。<br />We have developed atomic force microscope (AFM) with a shielding mechanism and improved its stability and force resolution. We fabricated a small hole in a silicon nitride membrane that was originally designed for electron microscopy by focused ion beam. By inserting a probe into liquid through this hole, we enabled to immerse only the tip apex into liquid. To avoid the contact between the cantilever and the membrane, we used a thin quartz probe glued on the cantilever and fabricated an electron beam deposited tip on the probe apex. With these efforts, we enabled atomic-resolution imaging in liquid by immersing only the tip apex into liquid and improved the force resolution by ~3 times. The developed mechanism is useful for improving the stability in the measurements of gas-generating samples and the quantitative capability of the potential measurements.<br />研究課題/領域番号:26600095, 研究期間(年度):2014-04-01 - 2017-03-31
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福間, 剛士 ; Fukuma, Takashi
概要:
金沢大学新学術創成研究機構ナノ生命科学研究所<br />3次元走査型力顕微鏡（3D-SFM）は、固液界面で3次元水和・揺動構造をサブナノスケールの分解能で計測できる計測技術であるが、その速度は1分／イメージ程度にとどまっていたため、動的現象
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や複雑な構造の解析は不可能な場合が多かった。本研究では、3D-SFMの動作速度を約10倍高速化し、5秒／イメージ程度の速度での3次元観察を実現した。さらに、開発した技術を用いて、ハードディスク用潤滑剤や、自動車用冷却水の凍結防止剤の形成する複雑で不均一な界面分子吸着構造の3次元サブナノスケール観察を実現し、これらの機能性分子材料の機能の発現メカニズムに関係する重要な知見を得ることに成功した。<br />Three-dimensional scanning force microscopy (3D-SFM) allows us to visualize 3D distributions of hydration structures and flexible surface structures at solid-liquid interfaces with subnanometer-scale resolution. However, its imaging speed was limited to 1 min/image and hence its applications to the investigations on dynamic processes or complicated surface structures were also limited. In this study, we enhanced the imaging speed of 3D-SFM by 10 fold and achieved subnanometer-scale 3D imaging at 5 s/image. In addition, we applied the developed system to investigate 3D molecular adsorption structures of lubricants for hard disks and anti-freezing surfactants for car coolants and obtained important insights into the understanding of the mechanisms of these functional molecules.<br />研究課題/領域番号:25706023, 研究期間(年度):2013-04-01 - 2016-03-31
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淺川, 雅 ; Asakawa, Hitoshi
概要:
金沢大学ナノマテリアル研究所<br />力センサとして用いるカンチレバーの垂直方向とねじり曲げ方向の同時励振を行い、その周波数や振幅などの信号を同時取得することにより、探針の水平方向に存在するナノ構造体を非接触で検出できる原子間力顕微鏡(A
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FM）手法を開発した。今後、カンチレバー形状の最適化や同時計測した信号を用いたフィードバック制御方法の確立によって、新規AFM手法の実用性を高めていくことができる。<br />In this project, I developed an atomic force microscopy (AFM) method that was capable to detect nanostructures existing in the horizontal direction of an AFM probe in non-contact manner. The detection of nanostructures became possible by a simultaneous excitation and monitoring of two vibration modes of cantilevers used as a force sensor. The two vibration modes are the vertical normal bending and the torsional bending vibrations. The practicality of the developed AFM method can be improved by optimizing the cantilever shape and establishing the feedback control conditions.<br />研究課題/領域番号:26600097, 研究期間(年度):2014-04-01 - 2017-03-31
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淺川, 雅 ; Asakawa, Hitoshi
概要:
３次元走査型原子間力顕微鏡（３Ｄ－ＳＦＭ）による生体膜／生体液界面の分子分解能解析を目指して、安定性・再現性の向上のために液体密閉型ＡＦＭセルを設計・開発した。その結果、長時間安定に原子分解能ＡＦＭ観察が行えることを実証した。さらにＤＰＰＣ
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二重膜／水界面の３Ｄ－ＳＦＭ計測により、水和構造に加えて高い構造自由度を有するＰＣ頭部構造の３次元空間分布も可視化できることを明らかにした。これらの結果より、３Ｄ－ＳＦＭ計測が生体膜／生体液界面のナノ計測技術としての有用性を示すことができた。<br />In this project, I have developed a closed fluid cell with liquid-sealing mechanism to improve the stability and the reproducibility of three-dimensional scanning force microscopy (3D-SFM). The results showed the applicability of the developed closed fluid cell to atomic-scale AFM experiments. In addition, I demonstrated the 3D visualization of hydration structures and lipid headgroups at the interface between DPPC bilayer and water by 3D-SFM. The results suggest the applicability of 3D-SFM imaging to molecular-scale studies of biological membrane/biological solution interfaces.<br />研究課題/領域番号:23710142, 研究期間(年度):2011-2013
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淺川, 雅 ; Asakawa, Hitoshi
概要:
蛍光プローブ標識による分子拡散計測の信頼性を原子分解能を有する原子間力顕微鏡(AFM)を用いた直接計測で評価するために、AFM装置および周辺機器の開発を行った。AFM試料ホルダに光学窓や溶液フロー機能を組み込み、周波数変調AFM(FM-AF
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M)により脂質二重層上に存在するサブナノメートルの表面形状を直接観察できることを示した。この試料ホルダは落射型蛍光顕微鏡による観察を考慮した設計となっており、FM-AFM計測との比較により蛍光プローブ分子拡散計測法の信頼性を評価できるようになった。<br />In this project, an atomic force microscopy (AFM) instrument was developed to evaluate the reliability of fluorescence probe methods for molecular diffusion measurements in lipid bilayers. A sample holder developed in this project is usable in both the molecular-resolution AFM imaging and fluorescence measurements under the same condition. As the developed AFM instrument allows us to compare the data of molecular diffusion obtained by both methods, the capability should be useful for the reliability evaluation of fluorescence probe methods for molecular diffusion measurements.
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福間, 剛士
概要:
薄型中空スキャナを用いることで,試料の下方から集光した中赤外光を照射しつつ,試料表面を観察できる周波数変調原子間力顕微鏡(FM-AFM)を開発した。赤外光照射によって生じる微小な変化を検出するために,カンチレバーを小型化してFM-AFMの感
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度を格段に向上させた。さらに,ポリスチレン-PMMAブロックコポリマーの相分離膜を観察し,本装置により分子種識別イメージングが可能であることを示した。<br />We have developed frequency modulation atomic force microscope(FM-AFM) with a capability of irradiating a focused mid-infrared light from the bottom of the sample using a flat-type scanner with a hollow at the center. We have also achieved a significant improvement in the FM-AFM force sensitivity using a small cantilever to detect a subtle change in the surface property caused by the irradiation of an infrared light. We have demonstrated the molecular recognition capability of the developed microscope by imaging a phase-separated polystyrene-PMMA block copolymer thin film.
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福間, 剛士 ; Fukuma, Takeshi
概要:
本研究では、液中で原子スケール(1 nm以下)の構造を観察できる原子間力顕微鏡と呼ばれる計測装置を改良して、観察に使用る液体の温度やそこに含まれるイオンの濃度を精密に制御できるようにした。さらに、生体の基本的なパーツである生体膜の分子ス研究
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へと開発した装置を応用し、生体膜の主たる構成成分である脂質分子とコレステロールの複合体の構造を分子レベルで観察すことに世界で初めて成功した。<br />研究課題/領域番号:19810006, 研究期間(年度):2007–2008<br />出典：「液中原子分解能原子間力顕微鏡の多機能化と生体膜研究への応用」研究成果報告書 課題番号19810006 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)（https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19810006/)を加工して作成
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
ダイナミクスはタンパク質の重要な属性のひとつである。タンパク質分子機械の機能は、ダイナミックな構造変化と他の分子とのダイナミックな相互作用によって生ずる。様々なタンパク質がある中で、力と運動の発生を担うモータタンパク質は、ダイナミクスそのも
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のが機能とも言えるタンパク質であり、ダイナミクスの解明が機能メカニズムに直結する。一方、超えがたい技術的困難により、タンパク質の機能メカニズムの解明において最も不足している重要な情報もダイナミクスである。その技術的困難を打破して、高い空間分解能と有効な時間軸を併せ持つ新しい顕微鏡を開発する必要がある。本研究の目標は、第一に、我々が世界に先駆けて開発した第一世代高速AFMの性能をタンパク質のナノ機能動態を捉えられるレベルに向上させること、第二に、その性能向上により、モータタンパク質を中心にいくつかのタンパク質の機能解明に直結する映像データ得て、この新しい手法の有効性を実証することであった。この5年間にわたる研究により、上記の目標は十分に達成された。当初目指した装置性能の向上を果たすとともに、装置のオペレーションや試料側の工夫により、ミオシンVの歩行運動、GroEL-GroES間の反協同的相互作用といった生理機能動態を捉えることに成功し、それらの分子メカニズム解明に迫ることができた。また、タンパク質の機能動態ばかりでなく、タンパク質2次元結晶中の点欠陥の運動やタンパク質の非構造領域の可視化・同定といった従来の手法では扱えない問題にも適用できることを実証した。<br />Instrumentation: We developed various devices contained in the tapping mode atomic farce microscope (AFM) to attain a high-speed roan capability as well as low invasiveness to the sample. The small cantilevers developed collaborating with Olympus have a resonant frequency of 1.2 MHz in water and a spring constant of 02 N/m. The bandwidth of the z-scanner has reached an unprecedented bandwidth beyond 500 kHz. Active damping techniques for suppressing the scanner's mechanical vibrations, including an electric circuit which could automatically produce an inverse transfer function of a given transfer function, were developed L The bandwidth of a position sensor for detecting the cantilever deflection has reached 20 MHz The dynamic PID controller, whose gain parameters can be automatically changed depending on the cantilever oscillation amplitude, enables the use of an amplitude set point very close to the free oscillation amplitude of a cantilever This capability ensures a very small force loaded onto the sample from the oscillating cantilever tip and can avoid 'parachuting' of the tip even when the sample is scanned very fast A compensator for drift in the cantilever excitation efficiency allows this small force to be maintained for a long time. The high-speed AFM equipped with these devices can capture an image at an imaging rate of 30-60 ma/frame without damaging the fragile samples. 'Mane as mentioned below various dynamic biomolecular processes has successfully been captured on video. In addition, we developed a fast phase detector for phase contrast imaging. This device can detect the phase change in the cantilever oscillation at every oscillation cycle and at an arbitrary timing with in a cycle. This capability allows us to distinguish the energy conservative and dissipative tip-sample interactions. Therefore, it can simultaneously image heterogeneity of material properties and the topography. Bioimaging: (1) Myosin V The nucleotide-dependent association of double-headed myosin V to actin filaments was first anamyzed by high-speed MM imaging In the rigor state and in the presence of ADP only one of the two heads was bound to F-actin. From the arrow-head structure of the bound head, the bound head was identified to the trailing bead. In the presence of a medium concentration of AMP-PNP which mimics ADP-Pi, the both heads were bound to the same actin filament. Therefore, the binding of AMP-PNP changes the leading bead configuration so that its actin binding site can face an actin filament. In the presence of ATP, the wanting myosin V was captured on video; the two lever arms change the leading and trailing positions alternately (ie., hand-overhand movement). Before the trailing head detached from actin, the leading lever arm bent frontward This bending results in the trailing lever arm being pulled frontward, which accelerates the ADP dissociation from the trailing head and facilitates ATP binding to the trailing bead leading to the dissociation of the trailing head from the actin. Thus, these imaging studies elucidated the molecular mechanism for the processive movement of myosin V on actin track. (2) Dynein. Single-headed dynein C was in the presence of ATP. The stem moiety moved periodically between two distinct two positions, while no apparent movement was detected in the stalk and the main body of denein C. The processive of yeast cytoplasmic dynein (two-headed) along microtubules was successfully imaged. (3) Chaperonin switching the GroES bound and unbound states, as expected from the negative cooperativity (regarding the ATPase reaction) between the two rings of GroEL. However, a GroES-GroEL-GroES complex appeared before the switching. This complex formation had been controversial for a long time. High-speed AFM imaging quickly solved this controversial issue instantly. (4)Defect in 2D protein crystal. Moving point defects in streptavidin 2D crystal on biotin containing lipid bilayers was imaged. Its analysis elucidated the mechanism of defect-free protein 2D crystallization.<br />研究課題/領域番号:15101005, 研究期間(年度):2003– 2007, 平成19(2007)年度科学研究費補助金 基盤研究(S) 研究成果報告書の一部(概要)を掲載.<br />出典：「最高速AFMが解き明かす生物分子モーターのナノ構造ダイナミクス」研究成果報告書 課題番号15101005 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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安藤, 敏夫 ; Aodo, Toshio
概要:
Atomic force microscope (AFM) was first invented as an imaging tool for nanometer worlds. However, it can be used also a
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s a high-sensitive force sensor, which allows us to obtain a 2D map of forces exerted between a cantilever probe and sample surface. Adhesive, repulsive, rupture, or non-contact forces between an AFM probe and sample can tell us physicochemical properties of the sample such as hydrophobicity, hydrophilicity and electric charges, depending on the surface property of the probe used. To specify the physicochemical property of sample clearly it is best to scan the sample with probes having different properties. Yet, it is quite difficult to scan the same area of sample after changing cantilevers. This has been a main reason why AFM has not been successfully used for mapping property of protein surface. To detour this problem we developed an alternative method. Instead of changing cantilevers, we change the surface property of a photochromic probe by irradiating near-UV li ght. We synthesized a photochromic dye, vinyl malachite green (VMG) whose structure can change from hydrophobic to charged form on irradiation. This dye was attached to the tip of cantilever probes covalently. We also invented a scanning method to map rupture forces within a time shorter than an ordinary force-curve method. Although it was shorter, it still took 30 min, resulting in suffering from disturbance by mechanical and electrical drifts of the AFM.After confirming the usefulness of the photochromic probe in identifying physicochemical property of sample, we invented an additional scanning method to obtain non-contact force map and topography simultaneously. This method shortened the scan time to 5 min (although it is not short enough yet). The positive charges on a basic protein, lysozyme, was successfully visualized by this method. Parallel to these studies, we have developed a high-speed AFM.It can ultimately solve the problem that the observation of force map requires much longer time than topography. The frame rate for topography observation reached 2.5 frames/sec, about 250-times faster than ordinary AFM apparatus. Although we have not tried to use this new AFM for force mapping, its speed promises a few seconds of force mapping, and therefore in the near future we may be able to obtain much better resolution of force map on protein surfaces.<br />個々の蛋白質分子の疎水・親水・荷電各領域を原子間力顕微鏡(AFM)で可視化するための走査方法や装置の開発を行った。試料表面の異なる物理化学的性質を明確に同定するためには、それぞれの性質に対応するカンチレバープローブを用意しなければならない。カンチレバーを交換せねばならず、同じ試料領域をカンチレバーを交換して再度走査することは不可能である。そこで、光照射により疎水・荷電変換をするフォトクロミック色素をカンチレバーに導入するアイデアを導入した。カンチレバーを交換する必要がなく、異なる性質をもつプローブで同じ試料領域を繰り返し走査できる。カンチレバー探針に共有結合できるフォトクロミック色素(ビニルマラカイトグリーン(VMG))を先ず合成した。探針に導入したVMGでも疎水・荷電変換できることを確認した。走査時間を短縮できる吸着力マップ計測法とこのVMGプローブを用いて、試料表面の性質を明確に同定することに成功した。しかしながら、この走査は時間がかかり(30分)、装置のドリフトの影響を強く受ける。そこで、もっと走査時間を短縮できる(5分)非接触力計測によるマッピング法を開発し、蛋白質の電荷マッピングができることを示した。根本的に走査時間の短縮を図るために、AFM装置そのものの高速化することも行った。その結果通常の凹凸像観察で、250倍の高速化に成功した。この装置でのマッピングはまだ行っていないが、上述の走査手法及びVMGプローブの開発、及びこの高速AFMの開発により、蛋白質表面の物理化学的性質を精度よく高速にマッピングする道を拓いた。<br />研究課題/領域番号:10640384, 研究期間(年度):1998–1999<br />出典：「フォトクロミックカンチレバーによる蛋白質の疎水・親水・荷電領域の可視化」研究成果報告書 課題番号10640384(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
(a) We manufactured an atomic force microscope that was able to be scanned faster and less susceptible to drift than ord
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inary AFM apparatuses. This AFM was attached to an epiluminescence fluorescence microscope. To show the high performance of our AFM apparatus we tried to obtain high resolution images of myosin heads (subfragment-1) in aqueous solution. The images revealed fine structures that was comparable to those in an atomic model of S1 derived from x-ray crystallography of S1. In the AFM images we were able to see the ATP binding site as well as the large cleft at the tip of S1. These results proved that our AFM apparatus was on the level of the greatest in the world. (b) We performed a study preparatory to the development of a high-speed AFM in which one image would be acquired within 30msec. We designed and manufactured a high-speed scanner and attained high-speed imaging where one image was obtained within 150msec. By way of experiment we produced an AFM that employed a displacemant detection system suitable for high-speed imaging. We also examinds methods for preparing cantilevers that were suitable for a high-speed AFM.From these preparative studies we were able to secure a scaffolding for the development of the video-rate AFM. (c) To measure bimolecular interaction force at a truly single molecular level we developed a method to capture a single molecule of protein at the apex of a cantilever tip. Using this method we succeeded in quantifying the force field exerted between a single molecule of heavy meromyosin (HMM) and actin. Using this new technology we also discovered that ATP binding to HMM heads induced vibratile structural changes in HMM heads.<br />1.従来のAFM装置より高速に走査でき、ドリフトの影響を受けにくいAFMを製作し、これを蛍光顕微鏡に組み込んだ。この装置の高い性能を示すために、液中にあるミオシン頭部(S1)の像を高い分解能で得ることを試みた。X線結晶解析で得られているS1の原子モデルと細かい点まで比較できるほどの解像度の高い像を得ることができた。ATP結合部位や頭部先端にあるクレフトまで観察することができ、世界最高レベルのAFMであることを実証した。2.将来AFMをビデオレートにまで高速化するための準備研究を行った。高速走査できるスキャナーを設計・製作し、1画像を150msecで撮れる走査速度を実現した。高速AFMに適した変位検出法を採用したAFMを試作した。また、高速走査に適したカンチレバ-作製法の検討を行った。これらの研究により最終的な高速化を図るための足がかりを掴むことができた。3.真に1分子レベルで分子間相互作用を計測するために、カンチレバ-探針先端に蛋白質1分子を捕捉する方法を開発した。これによって、ミオシンのサブフラグメント(HMM)1分子とアクチン間に働く力の場の諸性質を定量化することに成功した。更に、HMMがATPに結合したあとに振動する構造変化がHMM頭部に起こることを発見した。<br />研究課題/領域番号:06558099, 研究期間(年度):1994–1996<br />出典：「生物研究用走査型プローブ顕微鏡の製作」研究成果報告書 課題番号06558099 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
Atomic force microscopy(AFM)holds great promise for biological science, since it allows us to observe with nanometer res
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olution the native surface structure of protein in an aqueous environment, and further it can quantify force exerted between the surfaces of protein and the tip of an AFM probe(or a second protein attached to the probe tip). Commercially manufactured atomic force microscopes are, however, inadequate for the biological application, since blind scanning has to be made to locate objects of interest randomly distributed on the sample substratum. To overcome this problem, we have developed an atomic force microscope integrated with an inverted fluorescence microscope. The Z-actuator is a short hollow piezo tube, on the top of which a sample is placed. The objective lens is inserted from the bottom into the hollow space. Since this piezo tube is wide (inner diameter 3.5cm), its top cannot deflect much in the XY directions. As XY actuator two piezo plates pointing at right angles to each other are placed horizontally with their tips touching a hollow plate(glued to the bottom of the Z-piezo tube)on the sides. The location of the probe tip as well as individual protein molecules that are stained with fluorescent dye can be visualized under the fluorescence microscope. By the use of an XY-stage to move a sample and another XY-stage to move the AFM head(including the probe tip), the probe tip can pinpoint a specific object of interest. This ensures an obtained AFM image to be of the object, neither of contaminants nor of an undulation of the substratum. Further, it facilitates the capture of single protein molecule at the tip of the probe. Using the developed AFM,we obtained clear images of a single actin filament and two-headed structure of myosin. We succeeded in capturing a single myosin molecule at the tip of the probe, utilizing the strong affinity between avidin and biotin. 原子間力顕微鏡(AFM)によりナノメーターの空間分解能で液中にある蛋白質のありのままの表面構造を観察できる。更に、蛋白質表面と探針先端(もしくは、探針に結合した蛋白質)との間に働く力を定量できる。従って、AFMは今後生物科学の進歩に大きく貢献することが期待されている。我々が本研究を開始した当時の市販のAFMでは、基盤にランダムに点在する試料を観察するためには何回かのめくら走査をしなければならず、生物試料の観察や操作に適したものではなかった。この問題を克服するために、倒立型蛍光顕微鏡と一体となったAFMを本研究で開発した。そのZアクチュエータは短い円筒ピエゾで、その上部がサンプルステージになる。対物レンズは下からその円筒ピエゾの中空部に挿入される。このピエゾは太いので、その上部はXY方向にほとんど変位しない。そこで、XYアクチュエータとして2枚の直交する板ピエゾを、円筒ピエゾの底部に付けた中空円盤に接触するように水平に配置した。蛍光顕微鏡で蛍光染色された生物試料と探針先端を同時に観察できる。サンプルステージとカンチレバ-・光学系のXY位置を独立に決めることができるので、見たい試料に探針をピンポイントアプローチできる。このことは得られたAFM像が基盤の凹凸や混入したごみなどでなく、観察すべき試料のものであることを保証する。更には、探針先端に蛍光染色された蛋白質を捕捉することを容易にする。完成した装置で、アクチンフィラメントやミオシン頭部が液中で鮮明に観察された。また、アビジン-ビオチンの強い結合を利用して、探針先端にミオシン1分子を捕捉することに成功した。<br />原子間力顕微鏡(AFM)によりナノメーターの空間分解能で液中にある蛋白質のありのままの表面構造を観察できる。更に、蛋白質表面と探針先端(もしくは、探針に結合した蛋白質)との間に働く力を定量できる。従って、AFMは今後生物科学の進歩に大きく貢献することが期待されている。我々が本研究を開始した当時の市販のAFMでは、基盤にランダムに点在する試料を観察するためには何回かのめくら走査をしなければならず、生物試料の観察や操作に適したものではなかった。この問題を克服するために、倒立型蛍光顕微鏡と一体となったAFMを本研究で開発した。そのZアクチュエータは短い円筒ピエゾで、その上部がサンプルステージになる。対物レンズは下からその円筒ピエゾの中空部に挿入される。このピエゾは太いので、その上部はXY方向にほとんど変位しない。そこで、XYアクチュエータとして2枚の直交する板ピエゾを、円筒ピエゾの底部に付けた中空円盤に接触するように水平に配置した。蛍光顕微鏡で蛍光染色された生物試料と探針先端を同時に観察できる。サンプルステージとカンチレバ-・光学系のXY位置を独立に決めることができるので、見たい試料に探針をピンポイントアプローチできる。このことは得られたAFM像が基盤の凹凸や混入したごみなどでなく、観察すべき試料のものであることを保証する。更には、探針先端に蛍光染色された蛋白質を捕捉することを容易にする。完成した装置で、アクチンフィラメントやミオシン頭部が液中で鮮明に観察された。また、アビジン-ビオチンの強い結合を利用して、探針先端にミオシン1分子を捕捉することに成功した。<br />研究課題/領域番号:03455011, 研究期間(年度):1991–1993<br />出典：「生物材料の観察に適した原子間力顕微鏡の開発」研究成果報告書 課題番号03455011(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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岡林, 則夫 ; Okabayashi, Norio
概要:
非弾性電子トンネル分光法は単一分子の振動分光を可能にする超感度の分光法である。本研究は、この分光法の有用性を高めるため、原子間力顕微鏡法と走査型トンネル顕微鏡法による非弾性電子トンネル分光を組み合わせ、金属探針が表面上の単一の一酸化炭素分子
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に及ぼす力と、力を及ぼされた分子の振動エネルギーの変化の関係を測定した。更に、古典論をもとにしたモデルにより実験結果の解釈を行い、探針からの摂動場の影響に加えて、探針からの力により分子のボンドがのびるという効果を取り入れることで、実験結果が大変よく再現できることを示した。本内容は、重要な総合学術誌である米国科学アカデミー紀要において報告した。<br />We have investigated the relationship between the force exerted on a single carbon monoxide molecule on a copper surface and the vibrational energy shift of the CO molecule by combining Atomic Force Microscopy and Inelastic Electron Tunneling Spectroscopy based on Scanning Tunneling Microscopy. We have interpreted the vibrational energy shifts of a CO molecule based on the classical pendulum model, where we found that the experimental energy shifts are well reproduced by considering the bond elongation effect in addition to the forced field perturbation. The result was published in Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 115 (2018) 4571-4576.<br />研究課題/領域番号:16K04959, 研究期間(年度):2016-04-01 - 2019-03-31
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長谷部, 徳子 ; Hasebe, Noriko
概要:
金沢大学環日本海域環境研究センター<br />鉱物中のUやThがα壊変する際に，親元素が反跳することによって結晶中に傷が生じる。このαリコイルトラック(ART)を利用した年代測定法の確立を目指し，年代既知試料の原子間力顕微鏡観察とU, Th
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濃度測定を行い，ARTの観察面へのregistration 係数をARTの観察結果から仮定して年代値を計算したところ，概ね期待年代の25%程度の若い年代となった。ARTの認定基準や，年代式の吟味がさらに必要となる結果であった。またジルコン表面の波状構造をARTに起因するものと考えてアニーリング実験を実施したが，1000度1時間の加熱でも波状構造が残っておりアニーリングをうけにくい可能性が示された。<br />A large parent atom recoils when it emits alpha particles and leave a track in a crystal. We observed zircons from age known volcanic rocks by atomic force microscope aiming the establishment of alpha recoil track (ART) dating method. Together with uranium and thorium concentrations measured, the age was calculated with the assumed registration factor to the observed surface, that is estimated from the ART observation. The results showed the younger ages than expected. Further examination on the recognition of ART and the age equation is necessary. The annealing experiment using the wavy structure formed by dense distribution of ART on zircon surface was carried out and the results suggest the high resistivity of ART.<br />研究課題/領域番号:16K12807, 研究期間(年度):2016-04-01 - 2020-03-31<br />出典：「数百年から数万年の試料の年代決定をめざすアルファリコイルトラック年代測定法の開発」研究成果報告書 課題番号16K12807（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-16K12807/16K12807seika/)を加工して作成
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岡林, 則夫 ; Okabayashi, Norio
概要:
金沢大学理工研究域数物科学系<br />ドイツ・Regensburg大のGiessibl教授との国際共同研究として、原子間力顕微鏡と走査型トンネル顕微鏡による振動分光法を組み合わせ、顕微鏡の金属探針と表面上の単一分子や単一原子との相互作用過
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程を調べた。まず、精密な振動分光が可能になるように装置改良を行い、更に、探針表面間の距離が短い領域において二つの手法の同時計測ができるように測定法を改善した。そして、（１）探針との相互作用による分子の構造変化を含む振動エネルギーの変化を、引力から斥力領域にいたるまで、これまでにない精度で理解した。一方で（２）表面上の原子の場合はその振動エネルギーの計測に用いる信号がとても小さい事がわかった。<br />By combining atomic force microscopy and scanning tunneling microscopy with inelastic electron tunneling spectroscopy, the interaction process between the metallic tip of a microscope and a single molecule/a single atom has been investigated by collaborating with Prof. Giessibl in Regensburg University. Firstly, the measurement system had been improved such that (1) the high-resolution vibrational spectroscopy is possible and (2) both of AFM and IETS measurements are possible for a very small tip surface distance. Then, the interaction process between a single molecule and a metallic tip including the molecular configuration change has been deeply understood for the attractive force regime to the repulsive force regime. On the other hand, it was found that the inelastic signal for a single atom on a surface is considerably weaker than the case of a single molecule.<br />研究課題/領域番号:16KK0096, 研究期間(年度):2017-2019<br />出典：「力と振動分光による単一原子の元素識別(国際共同研究強化)」研究成果報告書 課題番号16KK0096（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-16KK0096/16KK0096seika/)を加工して作成
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古寺, 哲幸 ; Kodera, Noriyuki
概要:
金沢大学新学術創成研究機構ナノ生命科学研究所<br />タンパク質や核酸といった生体分子の多くは、それらに内外から働く張力や圧縮力といった力学的な負荷によって、機能発現や反応速度が変調されていることが知られてきている。高速AFMで観察中の生
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体分子に力学的負荷を加えられれば、その変調のメカニズムを詳細に理解できることが期待される。そこで、従来のイメージング用スキャナーと独立で動作するマニピュレーション（外部操作）用スキャナーを追加し、そのスキャナーに取り付けられたキャピラリープローブを用いて観察対象に外力を与えられる新規のスキャナーシステムを開発した。その結果、生体分子を高速AFM観察しながら、その形状の外力応答を調べることができるようになった。<br />It is recently recognized that the functions of biomolecules (proteins and nucleic acids) are modulated by external forces (tension and compressive forces). Direct observation of proteins at work under an external load by high-speed AFM would greatly gain the mechanistic insight of their functional modulation under the load. To realize this observation, the present study have addressed the development of a high-speed AFM scanner with manipulator, in which a manipulation-scanner was additionally installed just adjacent to the imaging-scanner. The base of a manipulator needle was glued on the manipulation-scanner, while the other sharp end was gently placed on the surface of the imaging-scanner. Using the developed system, we succeeded in applying external force to biomolecules during high-AFM observation.<br />研究課題/領域番号:17K19345, 研究期間(年度):2017-04-01 - 2020-03-31<br />出典：「高速AFMによる張力依存的な生体分子の動的振舞いの直接観察」研究成果報告書 課題番号17K19345（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-17K19345/17K19345seika/)を加工して作成
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福間, 剛士 ; Fukuma, Takeshi
概要:
金沢大学新学術創成研究機構ナノ生命科学研究所<br />本研究では、３次元走査型力顕微鏡（3D-SFM）による原子スケール３次元水和構造計測の速度を、従来の１分／像から３秒／像まで格段に高速化させた。さらに、密閉セルや溶液置換機能などの環境
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制御機能を付加した。一方、開発した密閉セルを使って、揮発性のあるメタノール－水混合液中でのグラファイト表面における分子吸着構造計測を実現した。また、溶液置換機能を使って、界面活性剤であるCTAB分子のサファイア上における吸着構造の溶液濃度依存性を明らかにした。以上の通り、本研究により、3D-SFMによる分子吸着解析技術の実用性・有用性を大幅に改善することができた。<br />In this study, we have improved the speed of three-dimensional scanning force microscopy (3D-SFM) imaging of an atomic-scale 3D hydration structure from 1 min/image to 3 s/image. In addition, we added closed cell and fluid-exchange function to the 3D-SFM system. With this improved setup, we performed imaging of various molecular adsorption structures. For example, we imaged methanol adsorption structures on a graphite surface in a volatile methanol-water mixture. We also imaged adsorption structures of surfactants (CTAB) and their concentration dependence was investigated by the fluid exchange system. These results demonstrate that usability and effectiveness of the developed 3D-SFM system for 3D molecular adsorption structure analysis.<br />研究課題/領域番号:16H02111, 研究期間(年度):2016-04-01 - 2020-03-31<br />出典：「環境制御型高速3次元力顕微鏡による界面分子吸着構造の分子スケール解析」研究成果報告書 課題番号16H02111（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-16H02111/16H02111seika/)を加工して作成
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淺川, 雅 ; Asakawa, Hitoshi
概要:
金沢大学ナノマテリアル研究所<br />固体と液体が接する界面に存在する鎖状分子構造は、機能性材料や医薬品など幅広い分野で重要な役割を果たしていると考えられている。しかし、極めて微小な領域に僅かに存在する鎖状分子構造を観察することはあらゆる
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分析手法を用いても困難であり、その役割は十分に理解が進んでいない。そこで本研究では、原子間力顕微鏡（AFM）と呼ばれる顕微鏡技術を発展させた3次元走査型AFMを駆使し、鎖長分子構造の立体構造や動的特性を可視化する手法を確立した。<br />Nanoscale molecular chain structures at the interfaces between solids and liquids are considered to have important roles in a wide range of fields such as functional materials and pharmaceuticals. However, the almost roles remain unclear because of the difficulty of direct observation of such molecular chain structures that exist only in quite small nanospace at the interfaces. In this study, we have established a method to visualize the spatial distribution of molecular chain structures and their dynamics by using a three-dimensional scanning atomic force microscopy (3D-AFM) technique.<br />研究課題/領域番号:17K17760, 研究期間(年度):2017-04-01 - 2020-03-31<br />出典：「3次元走査型AFMによる界面分子鎖の立体構造・ダイナミクス実空間計測」研究成果報告書 課題番号17K17760（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-17K17760/17K17760seika/）を加工して作成
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中山, 隆宏 ; Nakayama, Takahiro
概要:
金沢大学ナノ生命科学研究所<br />酵母Hsp104は唯一、不溶性のアミロイド線維を脱凝集が可能な酵素で、構造の異なるアミロイド線維に対して幅広く脱凝集活性を示すが、幅広い基質特異性を示す仕組みの詳細は不明であった。この解明のため、本研究
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は、高速原子間力顕微鏡（高速AFM）を用いて、脱凝集反応における線維及びHsp104の構造動態の撮影を試みた。結果、Hsp104の脱凝集活性を高速AFM観察で特定はできなかったが、基質として調製したアミロイドタンパクXの凝集過程における構造動態の観察に成功した。<br />Yeast Hsp104 has been known to be the disaggregase which disaggregates various insoluble amyloid fibrils with different fibril structures. The mechanism of this diverse substrate specificity, however, has been unclarified. In this study, we tried to observe structural dynamics of individual Hsp104 and amyloid fibrils on amyloid disaggregase reaction, using high-speed atomic force microscopy (HS-AFM). We observed structural dynamics of amyloidogenic protein X aggregation into fibrils while we have not been able to characterize the disaggregation events on HS-AFM movies.<br />研究課題/領域番号:16K18524, 研究期間(年度):2016-04-01 – 2019-03-31
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角野, 歩 ; Sumino, Ayumi
概要:
金沢大学新学術創成研究機構 / 福井大学医学部<br />pH依存性カリウムチャネルKcsAの構造は、大きく分けて膜貫通ドメインと細胞質ドメインに分けられる。膜貫通ドメインの高分解構造は結晶構造により明らかになっているが、細胞質ドメインの高
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分解構造は不明である。本研究では、水中・非結晶化状態におけるKcsAチャネルの細胞質ドメインの構造および構造変化の端緒をつかむことを目的とした。原子間力顕微鏡観察により、水中においてはKcsAチャネルの細胞質ドメインは高速に揺らいでおり、硬い特定の構造をとらないことを明らかにした。蛍光色素を用いた実験により、閉状態から開状態へ変化する際に、細胞質ドメイン末端同士の距離が離れることが示唆された。<br />Structure of pH-dependent potassium channel KcsA is roughly divided into transmembrane and cytoplasmic domains. The high resolution structure of the transmembrane domains have been revealed by the crystal structure, but the high resolution structure of the cytoplasmic domain is unknown. In this study, we aimed to elucidate the structure of the cytoplasmic domain of KcsA channel in water and non-crystalline state. Atomic force microscopy revealed that, the cytoplasmic domain of KcsA channel were fluctuating at a high speed. The result indicates that the cytoplasmic domain of KcsA does not take a hard specific structure in water.<br />研究課題/領域番号:26870233, 研究期間(年度):2014-04-01 – 2016-03-31
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
金沢大学理工研究域<br />シャペロニンは基質ペプチドの折りたたみを支援する大きく構造を変化させる分子モーターである。その構造変化のダイナミクスはATPase反応の進行、基質ペプチドとの結合と連携している。その連携の仕方・仕組みを理解する
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ことが本研究の最終目標である。本研究では、研究代表者が開発した高速原子間力顕微鏡(AFM)を活用し、GroEL(+GroES+基質)の構造変化の動態を、ナノメーターの解像度で且つ映像として捉えることを目指した。初めて経験する試料系であり、且つ、比較的小さいタンパク質であることなどの理由により、本年度においてはまずは像を撮り、そこで見出された問題点を解決していくことから着手した。孤立した小さいタンパク質のAFM観察では、探針・試料間にかかる力によって起こる試料の動きが無視できなくなることと、探針先端の曲率半径の大きさが像に与える影響が大きくなるという問題点が一般にある。実際、GroELでも同様であった。以下に、行った改良、得られた成果をまとめる。1)探針・試料間にかかる力を軽減化する様々な工夫を行った。その結果、フィードバック制御に動的特性を持たせることにより、力の軽減化に成功した。2)探針は電子線を1点に当てるEBD法により作成するが、その先端曲率半径はベストの条件でもせいぜい8nm程度である。そこで、アルゴンガス存在下でのプラズマエッチングを行ったところ、4nmにまで細くすることに成功した。3)上記の工夫により、マイカ表面上に一様に立ったGroELの像をきれいに撮ることができるようになった。中心の穴やサブユニットまで解像することができた。GroELの濃度と像との関係を調べたところ、薄い場合には単層リングが多く、濃くすると2重リングになることを見出した。4)ATP存在下、非存在下で像ととり、単層GroELの形状変化を、高さ及び幅の変化として測定した。非存在下で高さは7.6nm、存在下では6.7nmになり、ATPの添加で約1nm低くなることが見出された。この変化は予想された方向と逆であった。幅も若干小さくなる傾向にあった。<br />研究課題/領域番号:14037220, 研究期間(年度):2002<br />出典：「シャペロニン機能動態のナノイメージング」研究成果報告書 課題番号14037220（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14037220/)を加工して作成
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
金沢大学理工研究域<br />(1)アクトミオシンモーターの化学・力学カップリング基板に固定されたへビーメロミオシン(HMM)上をアクチンフィラメントは滑り運動をする。HMMのATPase反応で獲得された化学エネルギーが力学エネルギーに変換
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されて、この運動が起こる。滑り速度、滑り運動中にHMMが発生している力が、このATPase反応とどのようにカップルしているかを現象論的に調べた。数種類のMgNTP、種々の二価金属イオンと結合したATPを基質とした場合、イオン強度を変えた場合について、同一条件下でNTPase反応のキネティクス、滑り速度、力を測定した。その結果、滑り速度は√<V_<max>K^A_m>に比例し、力は√<V_<max>/K^A_m>に比例するという実験結果を得た。アクトミオシンATPase反応では、アクチン・ミオシンは多くの時間弱い結合状態にあり、弱い結合状態から強い結合状態への遷移で力発生が起こると考えられる。弱い結合状態では負荷を発生し、この負荷と力が釣り合うことで滑り速度が決まるというモデルを基礎として理論的解析を行った。その結果上記実験結果をきれいに説明できた。過去の多くの実験結果もこの関係を満たすことが確認された。(2)ミオシンVのプロセッシブ運動の直接観察ミオシンVはその生化学的性質、細胞内での機能から、プロセッシブモーターであることが示唆されているが、実験的直接証明はなされていない。カルモジュリンを蛍光性カルモジュリンで置換することで、ミオシンV1分子の可視化に成功した。また、アクチンフィラメントの基板への固定方法に工夫を加えた。その結果、個々のミオシンVがアクチンフィラメント上をプロセッシブに運動し、B端まで達する様子が多数観察された。B端でもミオシンVは離れにくく、その結果、B端は時間とともに明るくなっていった。最大滑り速度は2μm/sec、最大ATPase活性は2/secであった。1ATPaseサイクルで500nmも滑ることになる。<br />研究課題/領域番号:11156211, 研究期間(年度):1999<br />出典：「生物分子モーターの構造・機能の1分子動態解析研究」研究成果報告書 課題番号11156211（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11156211/)を加工して作成
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論文 |
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
金沢大学理工研究域<br />アクトミオシンモーターのエネルギーはATPの加水分解で供給される。この化学エネルギーがどのようにして力学的エネルギーに変換されるのか、また、ATPase反応のどのステップが力学的現象を生むのか、更には、力学的性
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質(発生する力の大きさや滑り速度)が何によって決定されているのか、など多くの興味ある問題が未解決のままである。本研究では先ず、ミオシン頭部がATPを結合・分解するときにミオシン頭部にどのような力学的応答が生ずるかを、原子間力顕微鏡を用いて1分子レベルで調べた。カンチレバー探針先端に捕捉されたHMM1分子が基板に固定されたATPと結合した直後のカンチレバーの応答を計測した。驚いたことに、カンチレバーが振動する現象が観察された。カンチレバーを動かしているものはHMM以外には無いので、HMM分子自身が振動していると判断せざるを得ないが、他の可能性も残されている。この振動がATP加水分解のエネルギーによってもたらされているかどうかを調べるために、ATPをADPで置き換えた。ADPの場合には振動は全く観察されなかった。HMMがATPと結合・解離を繰り返すために振動が現れる可能性もあり得るが、ATP基板を下げていっても振動が続くことからこの可能性は否定された。HMMの2つの頭部が交互にATPと結合・解離をするために振動が現れる可能性が残されているが、単頭のHMMで振動が現れるかどうかを今後調べる。アクトミオシン系の滑り速度・力が何によって決定されているかを次に調べた。様々な基質(7種類のMg-NTP、4種類のMe-ATP)とイオン強度を変えて、NTP加水分解反応と滑り運動を同じ条件で観察した。その結果、滑り速度はNTPase反応のアクチン濃度に対するKmに、すべての条件下で比例することを発見した。最大活性は滑り速度と無関係であった。力については、滑り運動中の力はすべての条件でほぼ一定であり、滑り速度ゼロのときに発生している力は条件に依存した。その依存性にはNTPase反応のKmや最大活性とのシステマティックな関係が見出されなかった。これらを説明できるモデルを構築・分析して、弱い結合中間体におけるミオシン頭部とアクチンとの間で生ずる内部負荷が滑り速度を決定していることを解明した。<br />研究課題/領域番号:10175211, 研究期間(年度):1998<br />出典：「生物分子モーターの構造・機能の1分子動態解析研究」研究成果報告書 課題番号10175211（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10175211/)を加工して作成
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論文 |
論文
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小野, 賢二郎 ; Ono, Kenjiro
概要:
金沢大学附属病院<br />α-シヌクレイン蛋白(αS)の凝集は、パーキンソン病やび漫性レビー小体型認知症といったレビー小体病(LBD)や多系統萎縮症(MSA)において、病態形成上重要な役割を果たしていると考えられている。これまで我々はワイ
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ン関連ポリフェノールやクルクミンをはじめとする抗酸化物質がアルツハイマー病(AD)βアミロイド線維(fAβ)形成を抑制するだけでなく、既存のfAβを不安定化することを明らかにしてきた(J Neurochem, 2002 ; Biol Psychiatry, 2002 ; J Neurochem, 2003 ; J Neurosci Res, 2004 ; Biochim Biophys Acta, 2004 ; Exp Neurol, 2004 : Neurochem Int, 2006)。今回、我々は蛍光色素チオフラビンS(ThS)法、電子顕微鏡、原子間顕微鏡等を主に用いて試験管内α-シヌクレイン線維(fαS)形成・分解機構解明のための基本モデルを開発・確立し、このモデルを用いてfαS形成・不安定化過程に及ぼす様々な有機化合物の影響を解析した。その結果、ワイン関連ポリフェノールやクルクミン、ローズマリー酸(J Neurochem,2006)、ビタミンA類(Neurobiol Dis,2007)、セレギリンをはじめとする抗パーキンソン病薬(J Neurosci Res, in press)がfAβに対する作用と同様にfαS形成を抑制し、さらに既存のfαSも不安定化させることを明らかにし、これらの分子がLBDやMSAの予防薬や治療薬開発に向けて有力な基本分子になる可能性があることを提案した。さらに、外来で得られたLBD患者等の生体試料を用いてLBD患者の脳脊髄液はnon-CNS disease患者に比較してfαS形成を促進するが、AD患者の脳脊髄液も同様に促進傾向を示し、ADとLBDの間では有意な差はないことを明らかにした(Exp Neurol,2007)。<br />研究課題/領域番号:18790589, 研究期間(年度):2006 – 2007<br />出典：「生体分子及び有機化合物のαーシヌクレイン凝集に及ぼす影響の解析」研究成果報告書 課題番号18790589（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18790589/)を加工して作成
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論文 |
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内橋, 貴之 ; Uchihashi, Takayuki
概要:
金沢大学理工研究域<br />前年度に製作した高速フォースマッピング測定システムを用いてマイカ/純水界面での高速フォースカーブ計測を行った結果、高速でAFM画像撮影中に、任意のポイントで10ms程度のスピードでフォースカーブ計測が可能である
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ことを確認できた。一方、AFM走査中にアモルファスカーボンで製作された探針先端の状態が容易に変化するために、水和殻に起因する振動力の検出を安定に行うことが困難であることが分かった。探針先端強化のために種々の検討を行った結果、電子ビーム照射によるカーボン探針製作のためのソースガスとしてナフタレンと真空ポンプオイルの混合物が有効であることが分かった。また、CVD法によるカーボンナノチューブ探針の成長も行い、高速AFM用カンチレバー先端へのカーボンナノチューブ探針の成長に成功した。前年度までに高速位相検出法を開発し高感度な力検出が可能になったが、位相検出ではタンパク質を含む試料系で安定な高速AFM測定を行うことが困難であることが分かった。そこで、カンチレバー振幅の高感度検出法の開発を新たに行った。これまで用いてきた高速振幅計測は半周期毎に振幅値を更新できるが、カンチレバー振動信号をピークホールドする手法であるため、ノイズが大きく高感度な力検出は困難であった。1周期毎にしか更新できないが、ノイズに強いフーリエ法で振幅値を求める方法を開発した。この方法では、振動周期に同期した成分のみ高速で検出できるために、カンチレバーの熱ゆらぎの影響を抑え振幅検出のS/N比の向上が期待できる。実際に溶液中条件で試験を行った結果、振幅検出の低周波揺らぎを抑えることに成功した。今後、これら新しく開発した探針及び高感度力検出法により安定な水和力マッピングを目指していく。<br />研究課題/領域番号:17710095, 研究期間(年度):2005 – 2007<br />出典：「生体分子近傍における水和構造のナノスケール探索」研究成果報告書 課題番号17710095（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17710095/)を加工して作成
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論文 |
論文
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淺川, 雅 ; Asakawa, Hitoshi
概要:
金沢大学ナノマテリアル研究所<br />材料・分子機能に関わる界面分子鎖の構造や物性を分子スケールで理解するために、種々の計測・計算手法を組み合わせる課題に取り組んだ。特に原子間力顕微鏡(AFM)と蛍光デフォーカスイメージングで共通使用でき
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る界面ナノ分子鎖モデルを分子設計し、その調製条件を検討した。その結果、ヒュスゲン環化によるカップリング反応により界面分子鎖モデルを導入し、その構造変化をAFMで可視化できた。さらにその配向やダイナミクスを蛍光デフォーカスパターンから評価できた。同じ試料をAFMと蛍光デフォーカスイメージングで計測できるようになり、それぞれの情報を相補的に組み合わせることで、ナノ分子鎖の分子スケール理解が進展した。<br />In this project, we combined various measurement and computational methods to understand the structures and properties of interfacial chains at the molecular scale, which are related to materials and molecular functions. In particular, we designed a structural model of interfacial chains that can be applied for both atomic force microscopy (AFM) and defocus imaging using super-resolution fluorescence microscopy. As a result, we were able to introduce the interfacial chains by coupling reaction at the interface using Huisgen cycloaddition and visualize its structural changes by AFM. In addition, the orientation and dynamics of the interfacial chain model were evaluated by the defocused patterns obtained by fluorescence defocus imaging. The same sample can be measured by AFM and fluorescence defocus imaging, and the complementary combination of the information obtained by each method has advanced our understanding of the interfacial chains at a molecular scale.<br />研究課題/領域番号:17KK0112, 研究期間(年度):2017-2019<br />出典：「多角的計測・計算の連携による界面分子鎖の構造・物性に関する分子論的理解」研究成果報告書 課題番号17KK0112（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-17KK0112/17KK0112seika/）を加工して作成
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