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論文 |
論文
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三枝, 理博 ; Mieda, Michihiro
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />不安定な概日振動能を持つ多数のニューロンの集団発振機構である視交叉上核（SCN）の中枢概日時計が、極めて安定した概日リズムを発振するメカニズムを解明することを目指している。本年度は、AVPニューロン特
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異的にVgatを欠損したマウスについて、概日行動リズムの解析を終了した。AAVベクターによってVgatの発現を当該マウスのSCN・AVPニューロンにレスキューすることで、概日行動リズムが正常になることも確認した。当該マウスのSCNスライスにおいて、PER2-LUCの発現リズムの発光イメージングを行い、概日行動リズムの異常に反し、時計遺伝子発現リズムには大きな異常が見られないことが分かった。SCNスライスの電気生理学的解析で、AVPニューロンにおけるIPSCの振幅に日内変動があること、この変動がAVPニューロン特異的Vgat欠損マウスで消失することが明らかになった。さらに２，３の実験を追加して、AVPニューロン特異的Vgat欠損マウスについて論文発表する予定である。GABAに対する応答性を変化させるために、細胞内Cl-濃度を操作したマウスも作成した。AVPニューロン特異的NKCC1欠損マウス、VIPニューロン特異的NKCC1欠損マウスは共に、概日行動リズムに大きな異常は示さなかった。また、KCC2のドミナントポジティブ、ドミナントネガティブ型をAAVベクターによりSCNのAVPニューロン、VIPニューロンに特異的に発現させる実験も遂行中である。<br />研究課題/領域番号:16H01608, 研究期間(年度):2016-04-01 – 2018-03-31
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三枝, 理博 ; Mieda, Michihiro
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />本研究では、食欲･食物探索活動と食物摂取のタイミングを合わせ、限られた食餌機会を有効に利用するための第2の概日ペースメーカー「食餌同調性概日ペースメーカー」の神経基盤の解明を進めるとともに、食餌同調性
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概日ペースメーカーによる末梢臓器機能の調節様式を明らかにすることを目的した。食餌同調性概日ペースメーカー存在部位の絞り込みでは、SCNを除いた視床下部で特異的にBmal1（概日分子時計に必須の因子）を欠損したマウスを作製し、その食餌同調性概日行動リズムを検討した。しかし、用いたCreドライバーマウス自体で食餌同調性の食物探索行動が顕著に減弱してしまい、視床下部特異的Bmal1欠損の影響を調べることができなかった。また、以前我々は、視床下部背内側核緻密部を食餌同調性概日ペースメーカーの座と提唱したが、当該領域に特異的にCreを発現するトランスジェニックマウスを見出した。SCN以外の脳領域でBmal1を欠損したマウスでは給餌時刻に合わせた食物探索活動や摂食が著しく減少する。この「脳内食餌同調性概日ペースメーカーを特異的に欠損したモデルマウス」を用いて、諸臓器に内在する末梢概日時計を脳内食餌同調性概日ペースメーカーが調節する可能性について検討し、胃内在性概日時計の食餌への同調を促進することを明らかにした。しかしながらこのモデルマウスにおいて、グレリン血中濃度の食餌性同調性概日リズムについては異常が観察されなかった。脳内の食餌同調性概日ペースメーカーは餌探索活動や食欲などの脳機能を制御する一方で、末梢臓器機能の調節には大きな役割は果たさない可能性が考えられた。<br />研究課題/領域番号:25126708, 研究期間(年度):2013-04-01 – 2015-03-31
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程, 肇 ; Tei, Hajime
概要:
金沢大学理工学域自然システム学系<br />SCN由来細胞内mRNAレベルが示す振動性及び動的反応性をトランスクリプトーム解析により包括的に解析した。明期性の振動を示す二つのクラスターに含まれる遺伝子のプロモータ構造にはCRE及びE box
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が高い頻度で存在した。この結果は明期性の振動の維持と迅速な位相シフトにはこの二つのシスエレメントが機能していることを示す。さらに、リズムのロバストネスに寄与する新たな暗期性の転写フィードバックループを予測した。実際このループに含まれる2つの遺伝子の変異体を用いた行動解析を行ったところ、行動リズム異常という表現型が得られた。次に位相後退時に特異的に誘導される遺伝子群の中でSNARE複合体に含まれる-因子を支配するSnap25に着目した。この遺伝子の変異体について調べたところ、細胞の振動体間同調異常に起因すると考えられる行動リズムの異常を示した。さらに哺乳類概日時計中枢細胞におけるリズムのロバストネスに寄与する新たな暗期性の転写フィードバックループと、細胞間同調に関する経路を含む概日転写リズム形成のネットワークをそれぞれモデル化した。現在このモデルに含まれる、それぞれの細胞内パラメータ(mRNA、タンパク質濃度、それぞれの合成及び分解速度)を測定して用いた詳細なシミュレーションを実施した。そして、予測された概日リズム形成の中心的役割を担う遺伝子の機能欠損型変異体を作製した。これらの変異体について、電気生理学的解析や行動などの生理学的解析を行い、実際に暗期転写フィードバックに必要な新たな経路を見出した。<br />研究課題/領域番号:20016030, 研究期間(年度):2008 – 2009
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安藤, 仁 ; Ando, Hitoshi
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />体内時計は糖・脂質代謝など様々な生理機能の恒常性維持に重要な役割を果たしていることが、臓器特異的時計遺伝子欠損マウスの解析などにより示唆されている。しかし、正常に機能する体内時計が障害された場合の影響
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、特に肝や脂肪組織などの末梢時計障害の影響は、十分に解明されていない。本研究では、正常マウスを用い、照明条件あるいは給餌時刻を変更することにより、全身性および末梢特異的体内時計障害モデルをそれぞれ開発した。両モデルとも摂餌量は低下するにもかかわらず体重への影響は認めず、前者では耐糖能の悪化も認めた。このことより、中枢時計と末梢時計はどちらも代謝の調節に重要な役割を果たしていることが示された。<br />The results of studies using tissue-specific clock gene knock out mice etc. suggest that circadian clocks play a significant role in maintaining homeostasis of various physiological functions including glucose and lipid metabolisms. However, it remains to be seen what happens if circadian clocks (in particular, peripheral clocks) are disrupted in bodies with innately intact clocks. In this study, we've developed the models of systemic and peripheral tissues-specific disruption of circadian clocks by changing the light/dark cycle or feeding time, respectively, using normal mice. Consequently, decreased food intake without change in body weight was found in both the models, and impaired glucose tolerance was seen in the systemic model. These results suggest that both central and peripheral clocks play an important role in regulating metabolisms.<br />研究課題/領域番号:15K08594, 研究期間(年度):2015-04-01 - 2018-03-31
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安藤, 仁 ; Ando, Hitoshi
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系 / 自治医科大学<br />肝や脂肪組織などの末梢組織における体内時計（末梢時計）の障害は、2型糖尿病を初めとする生活習慣病の一因であることが示唆されている。そこで、末梢時計を標的とした生活習慣病の予防・治療法
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を開発するために、末梢時計の制御が可能な薬物をマウスモデルを用いて探索し、2型糖尿病治療薬であるエキセナチドには摂餌刺激よりも強力な末梢時計制御作用があることを見出した。また、空腹時血糖の日内リズムは直接的には肝の体内時計により制御されていることを明らかにし、糖代謝制御機構における末梢時計の関与を明確にした。<br />Recent studies have indicated that disrupted circadian clocks in peripheral tissues (peripheral clocks) are associated with the pathophysiology of lifestyle-related metabolic diseases including type 2 diabetes. To develop a strategy targeting peripheral clocks for treatment/prevention of metabolic diseases, whether exenatide could affect the rhythms of peripheral clocks was investigated in mice, and we found that exenatide modulates peripheral clocks more strongly than feeding. In addition, we evaluated the impact of peripheral clock in the liver and revealed that hepatic clock directly regulates the daily fasting blood glucose rhythm.<br />研究課題/領域番号:24590666, 研究期間(年度):2012-04-01 - 2015-03-31
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程, 肇 ; Tei, Hajime
概要:
金沢大学理工研究域生命理工学系<br />一般にmRNA のポリA 鎖長は不均一な分布をもち、その長さを簡便にかつ厳密に決定できる方法は現在ない。そこで従来のAnchored RT-PCR 法を改良して、PACHINCO (Poly(A)
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Capture by Hairpin Chimeric Oligonucleotide)-RT-PCR 法を構築した。この方法は遺伝子特異的5’PCR プライマーをゲノム全遺伝子のmRNA 3’UTR に対応させるだけで、全mRNA ポリA 鎖長をハイスループットに決定できる。実際、全自動型DNA 分析用マイクロチップ電気泳動装置を用いて、Per1 mRNA のポリA 鎖伸長を確認することができた。<br />In general, the length of poly (A) in eukaryotic mRNA shows a wide distribution, and at present, there is no precise and simple method to determine it. A novel method for its determination was developed with the improvement of conventional anchored RT-PCR, and designated as PACHINCO (Poly (A) Capture by Hairpin Chimeric Oligonucleotide)-RT-PCR. The new method can be applied for the comprehensive determination of poly (A) in whole cellular mRNAs with simply replacing 5' primers used for PACHINCO-RT-PR with sequences involved in the corresponding 3'UTRs of mRNA. Indeed, the method was optimized for an automatic microchip DNA electrophoresis apparatus, and the elongation of poly (A) of Per1 mRNA was identified using this system.<br />研究課題/領域番号:25640100, 研究期間(年度):2013-04-01 - 2015-03-31
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程, 肇 ; Tei, Hajime
概要:
mRNAのポリA鎖長を決定する、PACHINCO(Poly(A) Capture by Hairpin ChimericOligonucleotide)-RT-PCR法を構築した。本年度は本方法を全自動型DNA分析用マイクロチップ電気泳動装
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置(Shimadzu社)に適用するための条件の最適化を実施した。その結果、poly(A-T)鎖を効率的に検出する泳動条件を決定し、さらに、自動電気泳動装置からの出力データを用いたpoly(A)鎖長分布解析プログラムを開発した。<br />We have developed a novel method to determine the length of poly(A) in eukaryotic mRNA, and designated as PACHINCO(Poly(A) Capture by Hairpin Chimeric Oligonucleotide)-RT-PCR. In this year, we optimized the application of the method to an automated microchip electrophoresis system(MultiNA, SHIMADZU), including the development of the distribution analysis algorithm of a variety of poly(A) length.<br />研究課題/領域番号:23651184, 研究期間(年度):2011
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論文 |
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程, 肇 ; Tei, Hajime
概要:
本研究では概日リズム位相シフト及び細胞間同調機構に着目する。そこで、細胞の位相シフトに及び細胞間同調機構を司る分子を明らかにするために、主にメタボローム解析にプロテオーム解析を組み合わせた包括的データベースを構築した。その結果、細胞の位相シ
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フトには、細胞のエネルギー状態、脂質代謝系、アミノ酸生合成系に含まれる分子が、さらに、細胞間同調には薬物代謝系酵素群による代謝物中間体、核酸生合成代謝物が関与している可能性を明らかにした。<br />This study is focused on the phase shift and inter-cellular entrainment of the cellular circadian rhythms. To clarify the molecule(s) these phenomena, I have constructed a database assembling the results of metabolomic and proteomic analyses. Metabolites involved in the determination of cellular energy states, lipid metabolism, and amino acid biosynthesis worked for the cellular phase shift ; and those involved in xenobiotics and nucleic acid metabolism functioned for cellular entrainment.
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三枝, 理博
概要:
毎日固定した一定時間帯でのみ餌が得られる環境下では、動物は給餌前数時間にわたり食物探索行動を示し、給餌時間内に十分量摂食するように順応する。この食餌同期性概日行動リズムは、哺乳類の概日リズム制御中枢・視交叉上核(SCN)とは別の生物時計(食
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餌同期性クロック)によって制御されるが、その詳しいメカニズムは分かっていなかった。本研究で、食餌同期性クロックが機能するためには、脳内の視交叉上核以外の場所における時計遺伝子Bmal1の働きが必要であることが明らかになった。<br />When food availability is temporally restricted to a fixed time of the day(restricted feeding), animals adapt to this condition within a few days by feeding during the period of food availability and increasing food-seeking activity in the preceding hours. These changes in biological rhythms have been postulated to be brought about by a food-entrainable oscillator(FEO) that is independent of the mammalian master clock in the suprachiasmatic nucleus(SCN), although little is known of the physical and molecular substrates of the FEO. In this study, we demonstrated that an SCN-independent FEO in the nervous system requires a clock gene, Bmal1, and plays a critical role in adaptation of circadian locomotor activity and food intake to restricted feeding.<br />研究課題/領域番号:20390056, 研究期間(年度):2008–2011
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論文 |
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程, 肇 ; Tei, Hajime
概要:
新規な真核生物のmRNAポリA鎖決定法であるPACHINCO RT-PCR 法を構築した。そして、本方法を全自動型DNA分析用マイクロチップ電気泳動装置に適用するための条件の最適化を実施した。その結果、実際にLarkによる哺乳類時計遺伝子P
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er1 mRNA のポリA鎖伸長を、明快に確認することができた。さらにスループット性と、ポリA鎖長の分析精度を飛躍的に高めることを目的に、この方法を大規模シークエンサへ適用することを試みた。その結果、ラット視交叉上核由来細胞とマウス視交叉上核細胞において、多数のポリA 鎖長に概日リズムが見られるmRNAを集積することができた。<br />I have constructed a novel method for the determination of poly(A) in eukaryotic mRNA, and designated as PACHINCO RT-PCR. The method was optimized for the application of automatic microchip DNA sequencers, and the elongation of the poly(A) of Per1 clock gene transcripts was clearly determined. Subsequently, the method was applied for NGS sequencers for the improvement of the throughput and analytical precision for poly(A) determination. Accordingly, I have collected mRNAs with the circadian oscillation of poly(A) length in both a rat suprachiasmatic nucleus derived cell line and mouse suprachiasmatic cells.<br />研究課題/領域番号:24651212, 研究期間(年度):2012-04-01 - 2013-03-31
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