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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />薬物間相互作用(DDI)は薬物療法のリスクになるため、その回避が求められる。従来、DDI機構として薬物代謝酵素やトランスポーターが指摘されている。しかし、従来のDDIは血漿中濃度変動に基づいており、実
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際に薬物が作用する組織・細胞内濃度に対する評価は欠如していた。本研究では組織局所でのDDIとしてLocal DDIという概念を仮定し、汎用される医薬品ドネペジルならびにシロスタゾール間でのトランスポーター上でのDDIによる心毒性リスクの増大を示した。組織中濃度測定は容易ではないが、従来のDDIのリスク回避を一歩進めるために、様々な事象よりLocal DDIリスクを評価・予測する必要を提唱できた。<br />Clinical reports indicate that cardiotoxicity due to donepezil occurs after co-administration with cilostazol. We speculated that the concentration of donepezil in heart tissue might be increased by interaction with cilostazol at efflux transporter BCRP in heart. In this study, donepezil was found as a substrate of BCRP. Cilostazol inhibited BCRP with IC50 of 130 nM, which is less than clinically achievable unbound plasma cilostazol (about 200 nM). In in vivo rat study, we found that cilostazol significantly increased the donepezil concentrations in heart and brain, where BCRP functions as the blood-tissue barrier, whereas the plasma concentration of donepezil was unaffected. In addition, in vitro accumulation of donepezil in heart tissue slices of rats was significantly increased by cilostazol. Accordingly, donepezil-cilostazol interaction at BCRP may be clinically relevant in heart and brain without any apparent change in plasma concentration, resulting in side effect of donepezil.<br />研究課題/領域番号:26670075, 研究期間(年度):2014-04-01 – 2016-03-31
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />本研究では肝細胞取り込み能動輸送、細胞内結合、及び肝細胞内生成代謝物の影響を含む薬物間相互作用予測手法の提案を行った。サンドイッチ培養した肝細胞が形成した胆管腔内へのABC輸送体MRP2蛍光プローブ化
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合物CDFの移行性をたQTLI法により定量化した。その結果CDFの移行性は阻害薬添加時、ならびに生成代謝物が阻害する場合も再現できた。したがって、本手法は、胆管腔側膜輸送体上での、相互作用予測法として有用である。<br />Interplay of transporters and enzymes is essential to understand drug disposition in tissues such as liver and intestine. When we consider drug-drug interaction (DDI) on liver bile canalicular transporters,metabolites formed in the hepatocytes must be considered, since many of conjugated metabolites show higher affinity to those transporters like MRP2. We established a quantitative time-lapse imaging-based analysis (QTLI) to assess Mrp2-mediated DDIs in sandwich-cultured hepatocytes (SCHs), utilizing fluorescent probe substrate of MRP2, (5,6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein (CDF). When estradiol (E2) was chosen as affecting compound, its metabolite estradiol-17β-glucuronide (E17G) but not E2 itself was confirmed to inhibit Mrp2-mediated CDF transport. When SCRHs were preincubated with E2, fluorescence accumulated in bile canaliculi formed in SCRH was decreased depending upon both length of preincubation period and concentration of E2 given in extracellular medium. The decrease in accumulated fluorescence agreed with an increase in intracellular concentration of E17G generated in hepatocytes, suggesting that the phase II biotransformation is mirrored in MRP2-mediated transport by QTLI. Since SCHs well maintain hepatic uptake transport activity, intracellular binding and drug metabolizing activity as in vitro system, QTLI in SCHs provides a convenient platform to develop an evaluation system for transporter-based DDIs without identifying metabolites of drug candidates.<br />研究課題/領域番号:23659076, 研究期間(年度):2011-2012
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学薬学部<br />本研究では、血液脳関門に存在するトランスポーターの分子的・機能的探索と新規評価系の確立を試みた。二年間の研究を通じて、血液中から脳内への栄養物輸送に働く種々のトランスポーターの同定に成功した。まず、乳酸やピルビン酸
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輸送に働くモノカルボン酸トランスポーターMCT1である。二番目はアミノ酸輸送に働くLAT1、LAT2およびその補助因子4F2hcであり、三番目はカルニチントランスポーターとして働くOCTN2である。いずれのトランスポーターも脳内への物質取り込みに働くタイプであり、これらが安息香酸、L-DOPAやアセチルカルニチンなどの薬物の脳内移行にも働くことを示した。また、薬物の中枢移行についてはH1アンタゴニストのエバスチンおよび代謝産物カレバスチン、さらにキノロン系抗菌薬のグレパフロキサンに着目した。その結果、いずれの薬物もP-糖タンパク質による排出により脳内移行性が低く保たれており、中枢性副作用が低いものと推定された。さらにグレパフロキサシンについてはP-糖タンパク以外の排出輸送機構の存在が示唆され、複数の排出輸送系により脳内の恒常性が維持されているものと考えられた。本研究を通じて、新たな評価系として脳毛細血管内皮の不死化細胞RBEC1の樹立を行い、研究成果を得る上で有用な実験系となった。さらに、より生理的機能を維持できると考えられるin viro血液脳関門評価系として、脳毛細血管内皮細胞とアストロサイトの共培養系の導入を行った。共培養により血液脳関門マーカーや密着結合性の向上が見られたが、さらなる改善の必要性を示す結果となった。以上、本研究成果として新たな血液脳関門機能を分子・機構論的に見いだすことに成功するとともに、マススクリーニングに適した評価系の確立を試みた。評価系についてはさらなる改善が必要であるが、見いだされた新規血液脳関門機能は今後の脳内への薬物デリバリーに有用な情報を与えるものとなった。<br />In the present study, we studied membrane transporters equippecd, in the brain capillary endothelial cells that are functional as the blood-brain barrier. Through this study, we found three new transporters that are expressed at the blood-brain barrier.One of those transporters are monocarboxylic acid transporter MGT1, which tworks for uptake and/or efflux organic weak acids such as lactic acid, pyruvic acid and benzoic acid. The second transporter is neutral amino acid transporters LAT1 and LAT2. These two amino acid transporters work for the uptake of amino acids that are relatively hydrdphpbic and large molecules, including leucine, tyrosine and phenylalanine. These are also important for the brain livery of L-DOPA that is effective for perkinsonism. The third transporter is OCTN2that is callsified as the carnitine/organic cation transporter. OCTN2 is a Na^+-dependent carnitine transporter and works for the brain uptake of acetyl-L-carhitirie that is expected to be useful for Aitzhe imer's disease. On the other hand, brain efflux transporters that protect brain from the toxic xenobiotics. As the model drugs, H1-antagonist, ebastine and carebasitine and fluoroquinolone, grepafloxacine, was used in the present study. Generally, fluoroquinolonesand H1 antagonists exhibit adverse effects such as epilepsy and sedative effects, while the drugs studied in the present study do not show such adverse effects. We expected that these drugs might not have enough permeability across the blood-brain barrier, resulting in the insufficient delivery to the brain to cause unfavorable adverse effects. Varipus Kinds of studies on the BBB transport of these drugs demonstrated that there are at least two types of brain efflux transporters, including p-glycoproteih and anion exchange transporter, of which molecular identification remains to be succeeded.All of these studies were performed by using various BBB-transport techniques. Especially, newly developed cell line RBEC1 that were derived from rat brain capillary endothelial cells was useful for the success of the present study. Furthermore, we challenged of the coculture of the endothelial cells and astrocytes in order to mimic the in vivo BBB. Although we partly succeeded to prepare the in vitro BBB model, further improvement will be essential for the efficient and complete model for the evaluation of blood-brain barrier transport.<br />研究課題/領域番号:12557229, 研究期間(年度):2000-2001<br />出典：「血液脳関門の機能的実体解明に基づいた薬物中枢移行性評価法の確立」研究成果報告書 課題番号12557229 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学大学院自然科学研究科<br />カルニチン欠乏症は、最終的には心機能異常など致死的症状を示す病態であるが、主に遺伝性の全身性カルニチン欠乏症と、また臨床的な薬物投与や食事等栄養状態による二次性カルニチン欠乏症に分けられる。本研究では
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二次性カルニチン欠乏症の中で、薬物誘導型カルニチン欠乏症におけるOCTN2の寄与の可能性について、腎を中心とした臓器におけるOCTN2の有機カチオン輸送や薬物によるカルニチン輸送活性変動について解析を行うことにより、OCTNトランスポーターの生理的・薬物動態的役割ならびにカルニチン欠乏症との関連について解析を行った。ヒトならびにマウスOCTN2は、カルニチンをNa^+依存的に、有機カチオンの一種であるテトラエチルアンモニウム(TEA)をNa^+非依存的に輸送した。また、TEA以外にもメピラミンやベラパミル及びキニジンなどのカチオン性薬物を輸送した。一方、これらカチオン性化合物に加え、中性ならびにアニオン性化合物によってもカルニチン輸送活性は機能阻害を受けた。OCTN2が存在する腎臓においては、カルニチンはNa^+を駆動力とした再吸収に働くが、このような臨床的に使われる医薬品によって機能阻害を受けるということは、薬物誘導型の二次性のカルニチン欠乏症発症原因の一つとしてOCTN2が関与することを示すものであることが明らかになった。一方、他のOCTNメンバーOCTN1ならびにマウスOCTN3についても解析を行った結果、OCTN3精巣特異的な発現であり、またOCTN1は低いカルニチン輸送活性しか有せず、全身性カルニチン欠乏症としてはOCTN2が最も重要であることが示唆された。<br />In the present study, novel Na^+-dependent carnitine/organic cation transporter family, OCTNs from human and mouse were identified and functionally characterized. We isolated two and three members of OCTN family from human and mouse, respectively. OCTNs are present in various tissues, including kidney, heart, skeletal muscle and placenta strongly, and in several human-derived cancer cell lines. By immunohistochemical analysis in kidney, mouse OCTNs localized commonly in luminal membrane of tubular epithelial cells. Most of human and mouse OCTNs exhibited multifunctionality by transporting both of carnitine and organic cation, tetraethylammonium (TEA). Furthermore, sodium ions were essential for carnitine transport by human and mouse OCTN1 and 2. In systemic carnitine deficiency (SCD) phenotype mouse model, juvenile visceral steotosis (jvs) mouse, mutation in OCTN2 gene was found. Furthermore, several kinds of mutation in human SCD patients were found, demonstrating that OCTN2 is a physiologically important carnitine transporter. Interestingly, TEA transport was sodium independent. In addition, OCTNs transporterd various cationic drugs such as quinidine, verapamil, and actinomycin D.Furthermore, since one mutation of human OCTN2 lost carnitine transport activity but retained TEA transport activity, it was suggested that OCTN2 have differential functional sites for carnitine and organic cations. So, OCTNs are thought to be multifunctional transporters by transporting carnitine and organic cations by sodium ion dependent and independent manner, respectively, and would be important for disposition of organic cationic drugs as well as carnitine. Furthermore, since carnitine transport via OCTN2 is inhibited various compounds, including organic cations, organic anions such as valproic acid and neutral compound such as cortisole, it is anticipated that drug-induced secondary carnitine deficiency could be caused by interaction on OCTN2.<br />研究課題/領域番号:11672212, 研究期間(年度):1999-2000<br />出典：「高親和性カルニチントランスポーターの機能特性と薬物誘導型毒性発症機構との関連」研究成果報告書 課題番号11672212(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学大学院自然科学研究科<br />本研究では、薬物や生理的物質の体内動態に関わるトランスポーターの同定・機能解析を目的とした。得られた第一の成果は、新規に遺伝子クローニングに成功したOCTNトランスポーターファミリーの薬物ならびに生理
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的基質としてのカルニチン輸送解析である。本研究では、特にヒト及びマウスOCTN2の遺伝子クローニングを行い、その組織分布性や機能特性から生理的役割として脂肪酸代謝に重要なカルニチントランスポーターであることを実証した。すなわち、カルニチン欠乏症状を示すjvsマウスならびに臨床医の協力を得て得られた患者におけるOCTN2遺伝子解析によって、OCTN2遺伝子変異が直接的にカルニチン欠乏症と関連していることを示すことに成功した。さらに、OCTNはカルニチンとともに有機カチオンも輸送することが示された。しかも、カルニチンはナトリウムイオン依存的に、有機カチオン輸送はナトリウムイオン非依存的に輸送する多機能的トランスポーターであることが示された。本研究成果は、全身性カルニチン欠乏症の原因遺伝子の同定という、生理的・医学的に極めて意義のある研究成果となった。特にカルニチン欠乏症は小児においては致死的あるため、その遺伝子診断など臨床的に極めて有用な情報を提供する基礎研究成果となった。その他には、血液脳関門で働くモノカルボン酸トランスポーターMCT1の機能発現の実証、元来リン酸トランスポーターとしてクローニングされたNpt1がアニオン性薬物を輸送しその腎・肝排泄に関わること、キノロン系抗菌薬の臓器移行・排泄にはMRP2やP-糖蛋白質を含む複数のトランスポーターが関与していること等の結果が得られた。これら薬物輸送に働くトランスポーターの同定、機能解析、発現部位の同定、および薬物速度論的なトランスポーターの役割の解析研究は、トランスポーターを利用した薬物動態制御法の可能性を強く示すものである。<br />Various transporters that mediate membrane transport of drugs as well as physiological compounds were clarified by molecular cloning of the genes and their functional analysis by gene expression systems. The obtained results are as follows :1. Novel transporter family OCTNs were molecularly cloned and their transport functions were analyzed by transfection of the gene to HEK293 cells. Human and mouse OCTN2 transported physiologically important carnitine in a sodium dependent manner. JVS mice that show systemic carnitine deficiency(SCD) syndrome had a mutation in OCTN2 gene with loss of carnitine transport function. Furthermore, various mutations in OCTN2 gene were identified in patients who show the SCD syndrome. From these results, it was clarified that OCTN2 is a physiologically important camitine transporter and its mutation leads to the SCD. Interestingly, OCTN2 and its isoform OCTN1 transported organic cations in a sodium independent manner. Accordingly, OCTNs are unique transporters which have are multifunctionality by transporting carnitine and organic cations in the distinct mechanisms.2. Molecular characterization of the transporter for monocarboxylic acids at the blood-brain barrier (BBB) was performed. Monocarboxylic acid transporter MCT-1 gene was expressed at the BBB and was found to play important role in the transport of organic weak acids by the in vitro cultured cells and in vivo studies.3. Multiple efflux mechanisms for new quinolone antibacterial agent were found to be expressed at the BBB. They are P-glycoprotein and unknown transporters sensitive to anionic compounds. These multiple efflux transporters seem to restrict the brain distribution of quinolones and other drugs, resulting in a low distribution into the central nervous system.These lines of studies provide new insight of the siginificance of membrane transporters and new strategy to control disposition of drugs by focusing on the transporters function present in various tissues.<br />研究課題/領域番号:10470510, 研究期間(年度):1997-1998<br />出典：「薬物のトランスポーター介在輸送に基づいた臓器移行性の制御」研究成果報告書 課題番号10470510 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学薬学部<br />薬物動態特性は薬効に著しい影響を及ぼすため、未然の薬物間相互作用予測や副作用防止のためには、薬物動態制御機構の解明が必要である。薬物動態に影響する生体側因子の一つはトランスポータータンパク質である。薬物のような生体
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異物輸送に働く分子の中には幅広い基質選択性を有する場合が多い。そのような基質多選択性(multispecificity)に関する検討が行われてきているが、未だ不明である。本研究では、薬物輸送に働く有機アニオントランスポーターOATPならびに有機カチオン/カルニチントランスポーターOCTN2に焦点を当て、その基質多選択性発現機構に関する検討を行った。OCTN2は生理的基質としてカルニチンを、異物としてTEAのような有機カチオン輸送に働く。カルニチン輸送における駆動力はNa^+であるが、TEA輸送にはNa^+が関与しない。OCTN2上にはカルニチンに特異的なCOO^-基を認識する部位が存在し、その活性化にNa^+の関与が示唆された。一方、TEAにはCOO^-基がなく、Na^+の影響を受けないと考えられた。カルニチンとTEAは相互阻害を示すが,完全な競合阻害形式ではなく、両者はOCTN2タンパク質上の活性部位を一部共有しており、完全には一致しないものと推定された。Na^+はカルニチン輸送の駆動力となるが、TEAはそれ以外のエネルギーを利用していると考えられる。従って、同一のトランスポーター上で基質により膜輸送機構が異なるトランスポーターの多機能性(multifunctionality)が、トランスポーターの示す基質多選択性の一メカニズムとして関与していることが示された。このようなトランスポーター分子のmultifunctioniltyに基づくmultispecificityの解析は例がなく、薬物トランスポーターの基質選択性の解明に新たなアプローチを提示する成果を得ることができた。<br />Pharmacokinetic characteristics are important for the adequate drug therapy and they are affected by many factors, including binding proteins, drug metabolizing enzymes and membrane transporters. Among them, drug transporter are important for the intestinal absorption, tissue distribution, and hepatic and renal excretion of drugs. Accordingly, it will be important what kinds of drugs are accepted as substrates for each transporter. However, some drug transporters accept various compounds as substrates and it has not been clarified the mechanism for such multispecificity of drug transporterOrganic cation/carnitine transporter OCTN and organic anion transporting polypeptide OATP-C also accept various physiological and drug compounds as substrates. In the present study, we studied the mechanism for the multispecificity in the substrate recognition of those transporters by focusing on the multifunctionality of themOCTN transports carnitine as physiological substrates and cationic compounds as xenobiotics. When OCTN transports carnitine, it exclusively shows Na^+-dependence, while the transport of organic cation such as tetraethylammonium (TEA) is Na^+-independent. The study using mutant protein of OCTN exhibited that carnitne and TEA partially shares the substrate recognition sites on OCTN2, while they are not identical. Na^+ largely affect the affinity of carnitine to OCTN2, while TEA did not show any change in the affinity to OCTN2 by Na^+. However, carnitine and TEA exhibited mutual inhibitory effect, while they are not explained by complete competitive inhibition kinetics. The difference in the transporting mechanism between carnitine and TEA could be explained by the presence of the carboxylmoiety that is specific for carnitine and the Na^+ affect the interaction between carboxylmoiety of carnitine and OCTN2 protein. These observations suggested that multispecificity of OCTN is due to the multifunctionality of OCTN by changing the transport mechanisms depending on the substrates, regarding the driving force, Na^+. Accordingly, clarification of the driving force of the transporter for each substrate is important to clarify the mechanism of multispecificity of transporters. In the case of OATP, at present no driving force has been clearly demonstrated, while OATP accept various compounds as substrates. To clarify the mechanism for the multispecificity of OATP, it will be essential to identify the driving force for each substrate in future<br />研究課題/領域番号:13470513, 研究期間(年度):2001 – 2002<br />出典：「薬物トランスポーター群のmultispecificity発現機構に関する研究」研究成果報告書 課題番号13470513（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-13470513/134705132002kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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