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研究代表者 須田貴司
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須田, 貴司 ; 今村, 龍 ; 木下, 健 ; 茂谷, 康 ; 王, 強 ; 串山, 裕子
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坂井, 宣彦 ; 遠山, 直志 ; 岩田, 恭宣 ; 清水, 美保 ; 古市, 賢吾 ; 今村, 龍 ; 須田, 貴司 ; 金子, 周一 ; 和田, 隆志
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />Mortality from infections has been reported to be higher in hemodialysis (HD) patients. Although dys
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function of neutrophils against bacterial infection was reported in HD patients, the precise mechanism remains to be clarified. We therefore examined the impacts of neutrophil inflammatory signaling on bactericidal activity in HD patients. Comprehensive analyses of intracellular signalings were performed in whole blood of HD patients and control using a microarray system. To confirm the contribution of the signaling to bactericidal activity in neutrophils, we examined the phosphorylation, bacterial killing function, reactive oxygen species (ROS) production, and myeloperoxidase (MPO) release in neutrophils against Staphylococcus aureus. RNA microarray analysis showed the suppression of p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) signaling in HD patients. Neutrophils in HD patients showed the impairment of bactericidal activity against S. aureus compared to healthy subjects. Phosphorylation rate of p38MAPK of neutrophils in response to S. aureus was lower in HD patients than healthy subjects. The levels of ROS produced by neutrophils after co-culture with S. aureus were lower in HD patients, on the other hand, there was no difference of MPO release between HD patients and healthy subjects. A selective pharmacological inhibitor of p38MAPK suppressed bacterial killing function as well as ROS production in neutrophils of healthy subjects. Impairment of p38MAPK signaling pathway might contribute to the suppression of neutrophil bactericidal activity in HD patients through less production of ROS. © 2018 International Society for Apheresis, Japanese Society for Apheresis, and Japanese Society for Dialysis Therapy.<br />Embargo Period 12 months
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須田, 貴司 ; Suda, Takashi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />本研究では当初、カスパーゼ1誘導プログラム細胞死であるパイロトーシスの分子機構と役割の解明を目指した。最近、パイロトーシス実行蛋白GSDMDが同定されたが、GSDMD欠損細胞でもカスパーゼ1依存性細胞死
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が誘導される。この細胞死の分子機構を解析し、GSDMD欠損細胞や、元々GSDMDの発現が低い神経細胞やマスト細胞ではカスパーゼ1がBid依存性アポトーシスを誘導することを示した（Nat Commun, 2019）。また、がん治療モデルを用い、がん細胞にパイロトーシスを誘導するとアポトーシスを誘導した場合よりも強い抗腫瘍免疫を誘導しうることを示した。<br />This study aimed to clarify molecular mechanisms and roles of caspase-1-meidated cell death. Recent studies identified gasdermin D (GSDMD) as the effector molecule of pyroptosis, a caspase-1-dependent inflammatory cell death. However, GSDMD-deficient macrophages are still susceptible to caspase-1 activation. Thus, we investigated the molecular mechanism of caspase-1-dependent GSDMD-independent cell death. We found that GSDMD-deficient cells exhibits Bid-dependent apoptosis in response to caspase-1 activation. We found the same for inherently GSDMD-null/low cells such as neuronal cells and mast cells. These findings may contribute to understanding of the mechanism of caspase-1-related diseases such as neurodegenerative diseases. In addition, we demonstrated that pyroptotic cell death of tumor cells induces stronger anti-tumor immune responses than apoptotic cell death in an animal tumor therapy model. The latter finding may help to develop novel strategy of cancer therapy.<br />研究課題/領域番号:26110002, 研究期間(年度):2014-07-10 – 2019-03-31
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須田, 貴司 ; Suda, Takashi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />ASCを標的とした細胞死を誘導する薬剤を探索する目的で、昨年度に引き続き対照細胞株(HEK293細胞)と比較してASC遺伝子導入細胞株MAIL8細胞を選択的に傷害する天然物や化合物の探索を行った。本特定
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領域の化学療法基盤情報支援班より約300種類の化合物の提供を受け、スクリーニングを行ったところ、2種類の化合物が比較的選択的にMAIL8細胞に細胞死を誘導した。一方、昨年度海洋微生物抽出液の分画中にMAIL8に比較的選択的に細胞死を誘導する活性を見出し、HPLCによる精製を試みた。MAIL8細胞に対する細胞死誘導活性を有する物質を精製し、NMRで構造決定したところ、malforminの一種であることが判明した。しかしこの物質の細胞死誘導活性はMAIL8細胞に選択性を示さなかった。MAIL8選択的な細胞死を誘導する活性のピークは微量で構造決定に至っていない。また、昨年度作成したASC遺伝子とその上流5kbを含むヒトゲノム領域のASCコード領域の3'端にGFP cDNAを挿入したコンストラクトをASC陽性メラノーマ細胞株G361とASC陰性メラノーマ細胞株C32TGに導入したところ、前者でのみASC-GFP融合蛋白の発現が検出された。後者の細胞株をインジケーター細胞として、ASCの発現を誘導しうる化合物、天然物の探索を行ったが、ASCの発現を有意に誘導できる物質は発見できなかった。我々はこれまで、種々のがん細胞のASCを活性化するとアポトーシスが誘導されることを示してきたが、本研究の過程で、ヒト大腸腺癌細胞株COLO205ではASCの活性化によりネクローシスが誘導されることを発見した。この細胞死はカテプシンBやV-ATPaseに対する阻害剤で抑制されることから、リソゾームが関与することが示唆された。<br />研究課題/領域番号:20013015, 研究期間(年度):2008 – 2009
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須田, 貴司 ; Suda, Takashi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />ASCはCARD12等と結合してアポトーシスと炎症のシグナルを伝達する細胞質アダプター蛋白である。我々は、CARD12とmuramy1 dipeptide(MDP)刺激で活性化するNod2の融合蛋白(C
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12N2)を用い、MDPでASCを特異的に活性化する実験系を開発し、ASCはがん細胞にアポトーシスとIL-8産生を誘導すること、後者の応答にNF-KBとAP-1の活性化が寄与していることを示してきた。昨年度はAP-1活性化の分子機構を解明し、ヒト胃癌細胞株NUGC4にC12N2とASCを安定導入した細胞株(NUC12N2)の腫瘍をヌードマウスに形成させ、MDPを投与すると腫瘍が完全に退縮することを示した。,本年度は、以下の点を明らかにした。1)ASCの活性化により転写因子 STAT1,ISGF3,STAT3,NFATの内STAT3のみが活性化されること、STAT3の活性化はAP-1とNF-kBに依存した2次的な応答であることを示した。2)DNAマイクロアレー解析でASCの活性化により誘導される遺伝子を網羅的に解析し、転写関連(24%)、炎症関連(21%)、細胞死関連(16%)を含む75種類の遺伝子が有意に誘導されることを示した。3)NUC12N2またはNUGC4の腫瘍を形成させたヌードマウスにMDPを投与し、24時間後の腫瘍組織のアポトーシス細胞をTUNEL法で染色したところ、NUC12N2腫瘍組織でのみ、著しいアポトーシスが検出された。また、NUC12N2にNUGC4を5%以上混入させた場合には、MDP投与で腫瘍が拒絶されなかったことから、このがん治療モデルにおける腫瘍退縮はがん細胞のアポトーシスによるもので、炎症反応による周囲のがん細胞の巻き込み排除はほとんど寄与していないことが示された。<br />研究課題/領域番号:18013022, 研究期間(年度):2006 – 2007<br />出典：「ASC依存性AP-1活性化機構の解明とASCのがん分子標的としての可能性の検討」研究成果報告書 課題番号18013022（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18013022/)を加工して作成
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須田, 貴司 ; Suda, Takashi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />ASCはCARD12等と結合してアポトーシス等を誘導する細胞質蛋白質で、その遺伝子は様々ながん組織で発現が抑制されている。しかし、ASCのアポトーシス誘導機構は明確になっていない。我々は、CARD12と
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Nod2の融合蛋白(C12N2)を発現させ、MDP(Nod2のリガンド)でASC依存性アポトーシスを誘導する実験系を開発した。本研究では、この実験系を用いASC依存性アポトーシスの分子機構を検討した。さらに、我々が最近発見した新規ASC阻害蛋白PYNODについて、がん細胞における発現とASC誘導アポトーシスに対する効果を検討した。結果は以下の通りである。1)種々のがん細胞にC12N2とASCを発現させ、MDPで刺激したところ、調べた全ての細胞株でアポトーシスが誘導された。2)種々のドミナントネガティブ(DN)変異体やsiRNA、カスパーゼ阻害剤などを用いた検討から、ASCはFADD非依存性にカスパーゼ8を介してアポトーシスを誘導し、さらにタイプ2細胞においてはカスパーゼ8で切断されるBid依存性に、ミトコンドリア経路のアポトーシスを誘導することが判明した。3)ASCとカスパーゼ8は細胞内でスペックと呼ばれる凝集塊に共局在した。一方、FADD, Bax, Nod2などとの共局在は認められなかった。4)組替ヒトPYNOD蛋白を特異的に検出する単クローン抗体の樹立に成功した。5)この抗体を用い、PYNOD mRNAの発現が確認された10種類のヒトがん細胞株についてPYNOD蛋白の検出を試みたが、検出できなかった。内在性PYNODの検出にはより高親和性の抗体が必要と思われる。6)PYNODを細胞に一過性に発現させるとASC依存性アポトーシスを阻害した。以上、ASCは種々のがん細胞にカスパーゼ8依存性のアポトーシスを誘導し、PYNODはこのアポトーシスを抑制しうることが判明した。<br />研究課題/領域番号:17014035, 研究期間(年度):2005<br />出典：「ASC依存性アポトーシスの分子機構とPYNODの抑制効果の検討」研究成果報告書 課題番号17014035（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17014035/)を加工して作成
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須田, 貴司 ; Suda, Takashi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />PYPAF1/Cryopyrinは寒冷刺激で皮膚炎や関節炎など全身性に炎症を起こす遺伝性疾患FCASの原因遺伝子である。また、アダプター分子ASCを介して、NF-κB活性化およびcaspase-1依存性
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IL-1β活性化を誘導する分子である。我々はPYPAF1によるNF-κBの活性化を阻害する分子IPN-2を見いだし、その機能を検討した。IPN-2は構造的特徴からPYNODと改名した。PYNODはPYPAF1やCARD12をASCと共発現させた場合やASCを過剰発現させた場合に誘導されるNF-κBの活性化を阻害したが、MEKK1やMyD88の発現やTNFα刺激によるNF-κBの活性化は阻害しなかった。また、PYNODはASCの過剰発現によるアポトーシスも抑制したが、BidやFasの発現によるアポトーシスは抑制しなかった。このことからPYNODはASCを介したNF-κB活性化やアポトーシスを選択的に阻害する分子であることが示唆された。一方、PYNODはPYPAF1とASCを介したcaspase-1依存性のIL-1β分泌を阻害した。さらに、caspase-1の過剰発現によるIL-1βの活性型への転換と分泌も阻害したことから、PYNODはcaspase-1によるIL-1βの切断(による活性化)を阻害するものと考えられる。PYNODの蛋白間相互作用を検討したところ、PYNOD自身、ASC, caspase-1, IL-1βと結合し、RIP、TRADD、IKKγ、Bidとは結合しなかった。以上の結果から、PYNODのPYPAF1に対する阻害作用は、ASCやcaspase-1の活性を阻害することにより発揮されることが示唆された。<br />研究課題/領域番号:16659081, 研究期間(年度):2004<br />出典：「PYPAF1/CryopyrinによるNF-κB活性化の制御機構の解明」研究成果報告書 課題番号16659081（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16659081/)を加工して作成
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須田, 貴司 ; Suda, Takashi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />ビタミンB6類のうち、ピリドキサル(PL)とピリドキサルリン酸(PLP)がマクロファージなどのIL-1β産生を抑制することを見出した。また、その分子機構としてPLやPLPが①トル様受容体シグナルによるT
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ak1の活性化を阻害し、前駆体型IL-1βの発現を抑制すること、②NLRP3依存性のカスパーゼ1活性化を抑制し、IL-1βの前駆体型から成熟型への転換を抑制することを示した。さらに、マウスにPLやPLPを投与することで、リポポリサッカライド投与によるエンドトキシンショックが緩和されることを示した。以上より、ビタミンB6はIL-1βの産生を抑制し、炎症性疾患の予防に有効である可能性が示唆された。<br />In this study, we found that among B6 vitamers, pyridoxal (PL) and pyridoxal phosphate (PLP) inhibits IL-1β secretion from macrophages. Analyses of molecular mechanisms indicated that PL and PLP inhibits both Tak1 phosphorylation mediated by Toll-like receptors and following proIL-1β expression, and NLRP3-dependent caspase-1 activation and following proIL-1β processing into its mature form. Furthermore, administration of PL or PLP ameliorated lipopolysaccharide-induced endotoxin shock in mice. These results suggested that vitamin B6 is useful to prevent inflammatory diseases.<br />研究課題/領域番号:15K15078, 研究期間(年度):2015-04-01 - 2016-03-31
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須田, 貴司 ; Suda, Takashi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />PYNOD (NLR ファミリーに属する細胞質蛋白)の欠損マウスを作成し、主に免疫系におけるPYNODの役割を検討した。PYNOD欠損マウスの自然免疫応答に明確な異常は認められず、獲得免疫応答である遅延
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型過敏症応答に異常が認められた。しかし、皮膚経路で免疫したマウスの所属リンパ節は正常な抗原特異的インターフェロンγ産生能を示し、末梢組織に投与した抗原が所属リンパ節に到達し、エフェクターT細胞が生成されるプロセスは正常であることが示唆された。したがって、PYNOD欠損マウスの獲得免疫応答異常の原因は所属リンパ節のエフェクターT細胞が末梢組織へ移動する段階以降に存在することが示唆された。<br />In this study, we have investigated the physiological role of PYNOD (a cytoplasmic protein belonging to the NLR family), especially its role in the immune system using PYNOD-deficient mice. PYNOD-deficient mice exhibited a clear defect in the delayed type hypersensitivity that is a type of acquired immune responses, whereas we could find no apparent defect in innate immune responses in these mice. However, draining lymph node cells isolated from PYNOD-deficient mice that had been immunized through skin routes exhibited normal antigen-specific IFN-gamma production, suggesting that peripheral antigen was successfully delivered to draining lymph nodes and effecter T cells were normally generated in these mice. Thus, it is likely that the cause of the defect in the acquired immune system of PYNOD-deficient mice exist in a process of or after the migration of effecter T cells from draining lymph nodes to peripheral tissues.<br />研究課題/領域番号:23390092, 研究期間(年度):2011-04-01 - 2014-03-31
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