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Shinmyo, Yohei ; Terashita, Yukari ; Duong, Tung Anh Dinh ; Horiike, Toshihide ; Kawasumi, Muneo ; Hosomichi, Kazuyoshi ; Tajima, Atsushi ; Kawasaki, Hiroshi ; 新明, 洋平 ; 堀池, 俊秀 ; 細道, 一善 ; 田嶋, 敦 ; 河﨑, 洋志
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />Folds in the cerebral cortex in mammals are believed to be key structures for accommodating increase
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d cortical neurons in the cranial cavity. However, the mechanisms underlying cortical folding remain largely unknown, mainly because genetic manipulations for the gyrencephalic brain have been unavailable. By combining in utero electroporation and the CRISPR/Cas9 system, we succeeded in efficient gene knockout of Cdk5, which is mutated in some patients with classical lissencephaly, in the gyrencephalic brains of ferrets. We show that Cdk5 knockout in the ferret cerebral cortex markedly impaired cortical folding. Furthermore, the results obtained from the introduction of dominant-negative Cdk5 into specific cortical layers suggest that Cdk5 function in upper-layer neurons is more important for cortical folding than that in lower-layer neurons. Cdk5 inhibition induced severe migration defects in cortical neurons. Taken together, our findings suggest that the appropriate positioning of upper-layer neurons is critical for cortical folding. © 2017 The Author(s)
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Shinmyo, Yohei ; Tanaka, Satoshi ; Tsunoda, Shinichi ; Hosomichi, Kazuyoshi ; Tajima, Atsushi ; Kawasaki, Hiroshi
概要:
The CRISPR/Cas9 system has recently been adapted for generating knockout mice to investigate physiological functions and
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pathological mechanisms. Here, we report a highly efficient procedure for brain-specific disruption of genes of interest in vivo. We constructed pX330 plasmids expressing humanized Cas9 and single-guide RNAs (sgRNAs) against the Satb2 gene, which encodes an AT-rich DNA-binding transcription factor and is responsible for callosal axon projections in the developing mouse brain. We first confirmed that these constructs efficiently induced double-strand breaks (DSBs) in target sites of exogenous plasmids both in vitro and in vivo. We then found that the introduction of pX330-Satb2 into the developing mouse brain using in utero electroporation led to a dramatic reduction of Satb2 expression in the transfected cerebral cortex, suggesting DSBs had occurred in the Satb2 gene with high efficiency. Furthermore, we found that Cas9-mediated targeting of the Satb2 gene induced abnormalities in axonal projection patterns, which is consistent with the phenotypes previously observed in Satb2 mutant mice. Introduction of pX330-NeuN using our procedure also resulted in the efficient disruption of the NeuN gene. Thus, our procedure combining the CRISPR/Cas9 system and in utero electroporation is an effective and rapid approach to achieve brain-specific gene knockout in vivo. © 2016, Nature Publishing Group. All rights reserved.
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細道, 一善 ; Hosomichi, Kazuyoshi
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />NK細胞に発現し、HLAを認識する受容体であるKIRは個人ごとに各ハプロタイプのもつ活性型と抑制型のKIRの遺伝子数は異なる。本研究は同種造血幹細胞移植成績向上を目指し、次世代シーケンサーによる網羅的
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なHLAならびにKIR領域のリシーケンス法を確立することを目的とした。34のHLA遺伝子、17のKIR遺伝子の全長をカバーするオリゴプローブをカスタムデザインし、シーケンスキャプチャー法による網羅的な解析手法を確立した。また、データ解析手法として、データベースに基づくタイピング、コピー数多型および構造多型検出によるハプロタイプ構造解析、網羅的一塩基置換および挿入欠失検出、の３つ解析法を確立した。<br />Killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) expressing on natural killer (NK) cells are ligands of human leukocyte antigen (HLA) class I molecules. The number of KIR genes is different among KIR haplotypes, therefore each individual has a different number of inhibitory and activating KIR genes. Here, we established high-throughput sequencing method to identify the haplotype structure of HLA and KIR genes. The method for KIR and HLA typing was based on sequence capture method with custom oligo probes and MiSeq. Sequence reads from seventeen KIR genes could be aligned. The alignment result of KIR genes has distinct depth indicating copy number variation (CNV). The single nucleotide variants were used to estimate KIR allele sequence. Combination of CNV and SNVs as KIR allele could be available to estimate KIR haplotype structure.<br />研究課題/領域番号:26430195, 研究期間(年度):2014-04-01 - 2017-03-31
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細道, 一善 ; Hosomichi, Kazuyoshi
概要:
本研究課題は、家族性IgA腎症を対象とし、エクソームシーケンスによる疾患原因変異の同定、疾患発症機序の解明、ならびにこれら一連の原因遺伝子同定から情報解析技術を駆使したプロトコールを確立することを目指している。家族性IgA腎症1家系のエクソ
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ームシーケンスによってIgAのトランスサイトーシスに関わり、腎臓で発現するEEA1に原因候補となる変異を同定した。さらに、家族性IgA腎症の発端者24名のうち5名に位置の異なる3つのEEA1の変異が認められた。これらの変異の集団内頻度は1%以下であるが、発端者24名中5名と高頻度に認められ、EEA1の変異は家族性IgA腎症の20%を説明しうると考えられた。<br />A genetic predisposition of IgA nephropathy (IgAN) has been suggested by the familial clustering of the disease. To identify the genetic cause of familial IgAN, we applied exome sequencing to a family comprising four biopsy-proven IgAN. Exome sequencing of four affected, two carriers, and two non-affected individuals were captured, followed by Next-generation sequenciing. After several-step filtering including annotation and functional expectation, a novel missense variant F161Y in EEA1 was found to be candidates for familial IgAN. Furthermore, we identified additional 3 rare mutations in 5 affected individuals of 24 familial IgAN probands by exome sequencing. In conclusion, mutations in EEA1 could be causality for 20% of familial IgAN.<br />研究課題/領域番号:24710223, 研究期間(年度):2012-04-01 - 2014-03-31
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細道, 一善 ; Hosomichi, Kazuyoshi
概要:
ニワトリMHC領域はトリインフルエンザ抵抗性との関連性から抵抗性を規定する遺伝子が存在する可能性が考えられる。本研究では感受性MHCハプロタイプB13と抵抗性B21のMHC領域220kbのリシークエンスを行い、両ハプロタイプ間の多様性を明ら
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かにすることでトリインフルエンザ抵抗性遺伝子を同定、その機能を明らかにすることを目的とした。MHC領域に含まれるアミノ酸変異を伴う非同義置換のSNPを検索したところ、17遺伝子がトリインフルエンザウイルス抵抗性遺伝子の候補として絞り込まれた。これらのうち、機能的ドメインとしてのアミノ酸変異を精査したところ、TRIM27.2のSPRYドメインにおいて3ヶ所のアミノ酸置換が認められた。<br />The chicken MHC (MHC-B) is one of the research interests because of the strong associations with avian influenza virus infection identified in particular MHC-B haplotypes. Because sequence data of MHC-B haplotypes have been lacking, efforts to systematically resolve which genes within the MHC-B region contribute to well-defined MHC-B-associated disease responses was hampering. To indetify the genetic factor against influenza virus infection in the MHC-B region, we determined the complete genomic sequence of 2 MHC-B haplotypes across a region of 220kb encompassing 34 gene loci ranging from KIFC1 to C4.<br />研究課題/領域番号:21710204, 研究期間(年度):2009-2010
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細道, 一善 ; Hosomichi, Kazuyoshi
概要:
主要組織適合遺伝子複合体 (Human leukocyte antigen; HLA)は自己と非自己を認識することで免疫応答の入り口として働く遺伝子であるが、HLA遺伝子は多くの疾患との関連に加え、薬剤副作用の発症とも強く関連する。ところが
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、なぜこのHLAが薬剤副作用と関連するのか、その発症メカニズムはいまだ不明である。本研究では薬剤副作用と特定のHLAアレルやハプロタイプとの関係を明確にし、その発症メカニズムを明らかにすることを目的とした。これを実現するため、ゲノムコホートサンプルを対象とした網羅的HLA遺伝子解析を実施し、データベースとして整備した。<br />The HLA region, a 3.6-Mb segment of the human genome at 6p21, has been associated with more than 100 different diseases, primarily autoimmune diseases. Furthermore, specific alleles of the HLA genes are strongly associated with hypersensitivities to specific drugs. For a better understanding of the adverse effects of drugs, the HLA gene and HLA haplotype structure should be extensively and unambiguously determined. Here we determined genotypes of 33 HLA genes for genome cohort samples and constructed HLA genotype database with various phenotypes including severe adverse effects of various drugs.<br />研究課題/領域番号:17K19804, 研究期間(年度):2017-04-01 - 2019-03-31<br />出典：研究課題「ゲノムコホートを対象にしたHLA-omicsに基づく薬剤副作用予防診断システム」課題番号17K19804（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-17K19804/17K19804seika/）を加工して作成
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細道, 一善 ; Hosomichi, Kazuyoshi
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />ヒトの主要組織適合遺伝子複合体 (HLA)は免疫応答の入り口として自己と非自己の認識を担うとともに、ヒトにおける機能的遺伝子としては最も高度な多型を示す。この多型は自己免疫性疾患や感染症、さらには薬剤
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副作用と関連する遺伝要因として研究が進んでいる。さらに、その高度な多型性は個人識別、人類集団の起源や形成過程を探る遺伝マーカーとしても有益である。本研究ではHLA遺伝子の多型に注目し、ヤポネシア人成立までの感染症との戦いの歴史といった免疫学的な視点からもヤポネシア人の歴史を探ることを提案したい。<br />古代人のHLA遺伝子型を決定手法の確立これまでに研究代表者が開発してきた NGSを用いたHLA遺伝子の解析手法を、バクテリアゲノムを多く含み、断片化が進んだ古代人DNAを対象にしたものに最適化するために、プローブデザインを再設計ならびにハイブリダイゼーションの条件を再検証した。DNAライブラリとプローブの比率を変更し、ハイブリの時間を2時間に短縮しても、一般的なヒトゲノムDNAのシークエンスキャプチャーであればオンターゲット率は85%に濃縮できるプロトコールとして最適化した。一方、含まれるヒトゲノムが微量の場合はそのオンターゲット率が15%程度の濃縮にとどまる結果となったが、HLAタイピングが可能なリード数を得ることができる条件であることを確認した。計画研究A02で解析が進められた縄文DNA、尻労安部サンプルを対象として上述のHLA遺伝子解析手法によるHLAタイピングを試みた。結果は良好で、縄文DNAサンプルであってもHLA型をクリニカルグレードとなる第4区域で決定することが可能であった。尻労安部のHLAアレル頻度はいずれの遺伝子においても日本列島人集団において10位以内となる高頻度のタイプであった。現代人のHLA遺伝子解析金沢大学で進めている、志賀町など能登地域を対象にしたゲノムコホートの住民DNAサンプルを対象に37のHLA遺伝子ならびに非HLA遺伝子についてシークエンスを実施した。1,187検体について第3区域(6桁)までのタイピングが完了している。また、日本人集団以外の解析として、東北アジアの5民族集団、北部漢民族、満民族、中国在住朝鮮民族(中国、ハルピン)、ブリヤート民族(ロシア、イルクーツク)およびモンゴル民族(モンゴル、ウランバートル)、さらに、アマゾン先住民族の一つであるワオラニ族のHLAタイピングを実施した。<br />研究課題/領域番号:19H05344, 研究期間(年度):2019-04-01 – 2021-03-31<br />出典：研究課題「HLA遺伝子の多様性にもとづくヤポネシア人進化の解明」課題番号19H05344（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PUBLICLY-19H05344/）を加工して作成
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