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櫻井, 博 ; Sakurai, Hiroshi
概要:
熱ショック転写因子HSF1は、シャペロンの発現を誘導する主要な転写調節因子として機能するが、通常の細胞増殖においても、シャペロン以外のさまざまな遺伝子群の発現を調節する。本研究では、HSF1の非シャペロン型標的遺伝子に注目し、１）初期応答因
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子IER5はプロテインホスファターゼ2Aのモジュレーターとして細胞周期を制御する、２）基本転写因子TAF7はシャペロン遺伝子の持続的な発現に必要である、３）細胞増殖制御因子GADD45は熱ショックによる細胞死に関与することを示した。これらの結果より、HSF1はさまざまな非シャペロン遺伝子の発現を制御することにより細胞増殖や細胞死に関与すると考えられる。<br />Heat shock factor HSF1 is known as the major transcriptional regulator for chaperone genes, and it also regulates the expression of non-chaperone genes under normal growth conditions. In this study, I focused on the roles of HSF1-target genes, including immediate-early response factor IER5, general transcription factor TAF7, and cell growth regulator GADD45. IER5 functions as a modulator of protein phosphatase 2A and regulates the protein stability and activity of cell division cycle regulators. Heat-induced TAF7 is necessary for the prolonged expression of chaperone genes. GADD45 is necessary for heat stress survival. These results suggest that HSF1 is involved in the control of cell proliferation and death through regulating the expression of various non-chaperone target genes.<br />研究課題/領域番号:16K07292, 研究期間(年度):2016-04-01 – 2019-03-31
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櫻井, 博 ; Sakurai, Hiroshi
概要:
進化的に保存された熱応答性制御因子であるHSF(熱ショック転写因子)三量体は、heat shock element(HSE)に結合し、標的遺伝子の発現を調節する。連続型HSEはnGAAn配列の連続した逆向き反復配列であり、不連続型HSEはユ
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ニット間にギャップを含んでいる。本研究では、ヒトを含むさまざまな生物のHSFが、連続型HSEと同様に不連続型HSEにも結合することを明らかにした。さらに、三量体形成の制御は、HSFのHSE特異性において重要であった。<br />HSF(heat shock factor) trimer, an evolutionarily conserved heat-responsive regulator, binds to heat shock element(HSE) and regulates expression of target genes. Continuous HSEs consist of contiguous inverted repeats of the nGAAn sequence, and discontinuous HSEs contain gaps in the array of the unit. This study shows that HSFs of various organisms, including human, bind discontinuous HSEs, as well as continuous HSEs. Furthermore, modulation of the trimer formation is important for the HSE specificity of HSFs.<br />研究課題/領域番号:21570181, 研究期間(年度):2009-2011
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櫻井, 博 ; Sakurai, Hiroshi
概要:
ストレス対応反応において重要な役割を担う熱ショックタンパク質群の遺伝子発現は、プロモーター領域にあるHSE配列とこれに結合する熱ショック転写因子(HSF)により制御されている。本研究では、酵母, シロイヌナズナ, 線虫, ショウジョウバエ,
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ゼブラフィッシュ, ヒトのHSFのHSE配列特異性について検討して。生化学的、および、酵母菌・HeLa細胞での発現実験より、これらのHSFは多様なHSE配列を認識することが明らかになった。HSE配列の多様性は、ストレスや遺伝子特異的な転写に関すると考えられる。<br />研究課題/領域番号:19570164, 研究期間(年度):2007-2008<br />出典：「熱ショック転写因子による多様な塩基配列の認識と生物間での普遍性」研究成果報告書 課題番号19570164（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-19570164/19570164seika/)を加工して作成
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櫻井, 博 ; Sakurai, Hiroshi
概要:
すべての細胞は外界からストレスを受けると、その恒常性を維持するために熱ショック応答を行なう。この生物に普遍的な応答機構は、熱ショックタンパク質(HSP : Heat Shock Protein)に担われている。多くのHSP遺伝子の発現(転写
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)は、そのプロモーター領域にある特異的塩基配列HSE(Heat Shock Element)に結合する熱ショック転写因子(HSF : Heat Shock Factor)により制御されている。一方酵母菌のHsf1は熱ショックによりリン酸化され転写活性化能力を3得する。本研究では「Hsf1のリン酸化と脱リン酸化の制御機構」について解析した。さらにストレス応答全般におけるHsf1の役割について明らかにするため、「さまざまなストレス応答反応におけるHsf1の役割」について検討した。DNAマイクロアレイ法により、酵母Hsf1は約70個の遺伝子の熱ショック転写に必要であり、その標的遺伝子は、HSPをコードするのみならず、熱ショック時の細胞壁の再構成や小胞体でのS-S結合の形成にも関与することを明らかにした。また、Hsf1のリン酸化はHsf1三量体が1つ結合するようなHSEを持つ遺伝子の転写には必要だが、2つ以上結合する場合は不要であることより、リン酸化はHsf1三量体間の相互作用と関連すること、Hsf1のリン酸化には三量体形成が必須であり、また、DNA結合領域の構造変化と密接な関連があること、DNA結合領域の構造変化は転写活性化能力を調節することを明らかにした。さらに、ヒトのHSF1は酵母のHsf1と異なる機構によりHSEに結合する結果も得た。今後は、さまざまなHSE配列は遺伝子特異的な転写調節、さらに、ストレス特異的な制御について解析していく必要がある。<br />All organisms respond to elevated temperatures by changing transcription programs and expressing a set of proteins called heat shock proteins (HSPs). In eukaryotes, heat sock transcription factor (HSF) activates transcription of HSP genes. The target genes of HSF contain a cis-acting sequence designated the heat shock element. The baker's yeast, Saccharomyces cerevisiae, has one HSF encoded by the HSF1 locus. Under heat shock condition, Hsfl protein is extensively phosphorylated and acquires a stronger activating ability, although detailed regulatory mechanisms remain unknown. In this project, I focused on mechanisms of Hsfl phosphorylation and dephosphorylation' and 'roles of Hsfl in the response to various stresses'.By using DNA microarray analysis, we have shown that yeast Hsfl is necessary for heat-induced transcription of〜70 genes and that target genes encode molecular chaperones and proteins involved in a broad range biological functions. We have characterized multicopy suppressor genes of a temperature-sensitive hsfl mutation and found that Hsfl in concert with a protein kinase Pkc1 regulates cell wall remodeling in response to heat shock. Heat-induced hyperphosphorylation of Hsfl was required for transcriptional activation of approximately half of Hsfl target genes. This requirement was related to cooperative interactions among Hsfl trimers bound to the HSE. Consistent with this, oligomerization of Hsfl was prerequisite for stress-induced hyperphosphorylation of Hsfl. We have also shown that human HSF1 recognizes HSEs in a slightly different way than yeast Hsfl.Taken together, these results suggest that the architecture of the HSE is an important determinant for HSF-HSE interactions.<br />研究課題/領域番号:16570142, 研究期間(年度):2004-2006<br />出典：「ストレス応答における熱ショック転写因子のリン酸化制御」研究成果報告書 課題番号16570142 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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櫻井, 博 ; Sakurai, Hiroshi
概要:
転写活性化因子からの転写シグナルは、MediatorやTAP(TBP-associated factor)のような仲介因子を経て、RNAポリメラーゼIIと基本転写因子(TBP, TFIIB, TFIIE, TFIIFとTFIIH)から構成さ
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れる転写開始複合体に伝達される。酵母菌の分子遺伝学的方法を用いた研究により、RNAポリメラーゼIIのカルボキシ末端領域(CTD)をリン酸化するTFIIHのキナーゼ(KIN28遺伝子産物)は、熱ショック遺伝子のようなストレス応答性遺伝子の転写には必須ではないことが示された。本研究では、Kin28非依存的な転写は、熱ショック転写因子(Hsf : heat shock factor)により調節されることを示した。また、Kin28の活性を調節する基本因子のTFIIEは、銅メタロチオネインをコードするCUP1遺伝子の銅誘導性転写には必要なかった。CUP1の転写は、Hsf1とAce1(銅誘導性の転写活性化因子)により制御されている。さらに、Kin28やTFIIE非依存的な転写のメカニズムについて解析を行い、次のことを明らかにした。1.TFIIE非依存的なCUP1の転写活性化は、 Mediator複合体の構成タンパクにより行われる。2.もう一つの仲介因子であるTAFは,Hsf1によるKin28非依存的な転写に関与する。3.Hsf1のC-末端側がTAFに結合しKin28非依存的な転写を行う。4.Hsf1のC-末端には、熱ショックにより誘導されるHsf1のリン酸化を制御する領域がある。これらの結果より、ある特殊な転写活性化領域が、転写反応の主経路に必須であるいくつかの基本転写因子の必要性を決めることが示された。<br />The transcription activation signals of transcription activators are transmitted to the transcription initiation complex via intermediary factors such as Mediator and TAF(TBP-associated factor). The initiation complex consists of RNA polymerase II and the general transcription factors TBP,TFIIB,TFIIE,TFIIF,and TFIIH. By using the methods of yeast molecular genetics, it has been disclosed that activity of the TFIIH kinase(encoded by the KIN28 gene), which phosphorylates the carboxy-terminal domain(CTD) of RNA polymerase II, is dispensable for activation of several stress responsive genes such as heat shock genes. In this study, I have shown that the Kin28-independent activation of the heat-inducible genes is mediated by the heat shock transaction factor Hsfl. In addition, the general transcription factor IIE, which regulates the kinase activity of Kin28, was dispensable for copper-induced transcription of the CUP1 gene encoding copper metallothionein. Transcription of CUP1 is regulated by Hsfl and Aoe 1(copper-inducible activator). I further analyzed the Kin28-and TFIIE-independent transcription mechanisms and revealed the following. 1)The TFIIE-independent activation of CUP1 is mediated by oertain components of the Mediator complex. 2)The recruitment of TAFs, another well-known intermediary factor, is involved in the Kin28-independent transcription by Hsfl. 3) The C-terminal half of Hsfl has activities to recruit TAFs to a promoter and to undergo transcription independently of Kin28. 4)The C-terminal region of Hsfl contains a novel domain that regulates heat-inducible phosphorylation of Hsfl. These results illustrated that an alternate pathway of transcription reaction, in which a specific domain of activator plays a critical role in abrogation of requirement for subset of general transcription factors that are prerequisites in the main pathway of the transcription reaction.<br />研究課題/領域番号:13680760, 研究期間(年度):2001-2003<br />出典：「熱ショック転写因子と転写開始複合体の相互作用」研究成果報告書 課題番号13680760(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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小川, 智 ; Ogawa, Satoshi
概要:
金沢大学医学系研究科<br />血管新生は胎児発生における血管系の発育に中心的役割を果たすだけでなく、生後では損傷の治癒、慢性低潅流領域における側副血行路の発達、さらに腫瘍の増殖などにも関与する生体応答であるこの生体応答を構成するのは血管内
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皮細胞であり、低酸素環境下における血管内皮細胞の増殖が血管新生の本態である。血流を必要とする細胞は、低酸素環境下において、VEGF(Vascular endothelial cell growth factor)をはじめとする増殖因子を産生、これに対し血管内皮細胞は増殖因子に対する受容体を発現、低潅流領域に選択的な血管新生が成立する。従来より、低酸素環境における血管新生に関しては、腫瘍細胞をはじめとする血流要求細胞がVEGFを誘導するメカニズムのみが研究され、低酸素環境での細胞内輸送に関する研究は全くなされていなかった。本研究では、血管新生のきわめて盛んなヒトglioblastoma病理組織で、血管周囲でのORP150の発現とVEGFの発現パターンがきわめてよく一致することを見いだした。このことは、血流の相対的不足部位で、これらの小胞体分子シャペロンが腫瘍細胞からのVEGF分泌に深く関わることを示唆している。さらにアデノウイルスベクターを用いてORP150による遺伝子治療を行うことにより、強力な血管新生因子であるVEGFが低酸素環境で産生されるためには、ORP150を介する経路が必須であることを示し、将来的にはORP150の発現調節による血管新生のコントロール、ガン増殖・進行の抑止が可能であることを示した。<br />Newly synthesized protein and immature proteins are easily aggregated because they ej(pose hydrophobic regions. Many stress conditions, such as heat shock or hypoxia, slow down their folding process and cause accumulation of unfolded/misfolded proteins in the cell. Molecular chaperones, including heat shock'proteins (IISPs), are induced in these conditions, bind to unfolded/misfolded proteins, and help them to be folded or reflolded properly. The protective role of molecular chaperones for the cells under stress has been reported.Expression of angiogenic factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF) under conditions of cell stress involves both transcriptionaland translational events, as well as an important role for inducible endoplasmicreticulum (ER) chaperones. Coexpression of VEGF and 150-kDaoxygen-regulated protein (ORP), a novel ER chaperone, in human glioblastomasuggested a link between angiogenesis and ORP150. C6 gliomacells stably transfected with ORP150 antisense displayed selectively reduced ORP150 expression. Tumors raised after in culation of immunocompromisedmice with ORP150 antisense C6 glioma transfectants demonstratedan initial phase of growth comparable to wild-type C6 gliomacells which was followed by marked regression within 8 days. Decreaseddensity of platelet/endothelial cell adhesion molecule 1-positive structureswithin the tumor bed was consistent with reduced angiogenesis in C6 gliomas expressing ORP150 antisense, compared with tumors derived from C6 cells overexpressing ORP150 sense or vector controls. In vitro,inhibition of ORP150 expression decreased release of VEGF into culturesupernatants ; in ORP150 antisense transfectants, VEGF accumulatedintracellularly within the ER. These findings demonstrate a critical rolefor the inducible ER chaperone ORP150 in tumor-mediated angiogenesisvia processing of VEGF, and, thus, highlight a new facet of angiogenicmechanisms amenable to therapeutic manipulation in tumors.Heat shock proteins (HSPs)/stress proteins are molecular chaperflnes that are induced by various environmental and physiological stimuli. Evidence of the relations between the expression of HSPs and the regulation of cell growth or transformation has accumulated. The 150-kDa oxygen-regulated protein (ORP150), a new member of lisp family, functions as a molecular chaperone in the endoplasmic reticulum. We have examined whether transduced antisense ORP150 cDNA reduces tumorigenicity and angiogenicity. Relations between these stress proteins and cancer and possibilities for anticancer gene therapy are described.<br />研究課題/領域番号:12671522, 研究期間(年度):2000 – 2001<br />出典：「新規分子シャペロンORP150を利用した遺伝子治療に関する実験的研究」研究成果報告書 課題番号12671522（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12671522/）を加工して作成
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小川, 智 ; Ogawa, Satoshi
概要:
金沢大学医学部<br />虚血環境下における遺伝子発現の制御は、脳血管障害の遺伝子治療を考える上で必須のテクノロジーである。その第一歩として、脳虚血におけるheat shock protein(HSP)72によるストレス応答を、レポーター遺
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伝子およびそれを導入したトランスジェニックマウスを用いて検討した。この虚血レポーターのin-vitroにおける発現を確認するため、次にSV40の核移行シグナルを付けたHSPプロモーター遺伝子と、βgalactosidase遺伝子(lacZ)とを組み合わせたレポーター遺伝子を導入したtransgenic mouseの作成を試みた。このマウスを用いて、片側頸動脈閉塞および再潅流を行うと、虚血ストレスによるレポーター遺伝子の発現が見られ、核の青染が起こることが確認された。また、申請者らは、中枢神経系で神経細胞に比してアストログリアが環境変化に極めて強いことに注目し、ラット培養アストロサイトを低酸素ストレスに暴露する系を用い、新規小胞体ストレス蛋白ORP150、SERP1のクローニングに成功した。ストレス応答の場で、神経細胞がこれらストレス蛋白の発現に乏しい事実から、小胞体の機能不全としての神経細胞死を提唱してきた。小胞体の機能不全を救済することが神経細胞死を救うと言うこの研究を発展させ、ORP150のレポーター遺伝子を作成すべく、現在プロモーター領域の同定を行っている。ストレス蛋白のプロモーターを用いたレポーター遺伝子のtransfection系やそれを導入したトランスジェニックマウス虚血ストレス応答の解析に有用であることが示唆された。またそれらはストレス応答の簡便な定量化、可視化も可能ることで脳虚血の研究に役立つと考えられ、また治療に関しても今後新たな可能性を提示するものと考えられる。<br />An integral component of the cellular response to environmental challenge is expression, usually by de novo protein synthesis, of stress-associated polypeptides, such as heat shock proteins (induced by high temperature), glucose-regulated proteins (GRPs ; induced by glucose deprivation), and oxygen-regulated proteins (induced by oxygen deprivation). These biosynthetic responses are well preserved from prokaryotes to mammals, and have been hypothesized to contribute importantly to maintenance of cellular homeostasis as cellular adaptation to altered environmental conditions is under way.Astrocytes are strategically positioned to exert cytoprotective effects on neurons, the latter known for their vulnerability to changes in the local environment. Such neuro-protective and even neuro-trophic properties of astrocytes have been suggested in the setting of trauma, inflammation, and ischemic insults. To analyze specific mechanisms through which astrocytes mediate these effects, we analyzed polypeptides made by astrocytes exposed to hypoxia, an important component of the ischemic milieu. Our studies have identified a novel 150 kDa protein, ORP150. This endoplasmic reticulum (ER)-associated chaperone has been shown to contribute importantly to the viability of several cultured cell lines under conditions of oxygen deprivation.In view of the susceptibility of neurons to ischemic stress, we hypothesized that such vulnerability might be due, at least in part, to limited expression of ORP15O.In contrast, the resistance of astrocytes to ischemic stress might result from abundant ORP150 expression.Oxygen-regulated protein 150 kDa (ORP150) is a novel endoplasmic reticulum-associated chaperone induced by oxygen deprivation/ischemia. Although ORP15O was modestly upregulated in neurons from human brain undergoing ischemic stress, there was robust induction in astrocytes. Cultured neurons overexpressing ORP150 were resistant to hypoxemic stress, whereas astrocytes with inhibited ORP15O expression were more vulnerable. Mice with targeted neuronal overexpression of ORP150 displayed smaller strokes compared with controls. Neurons with increased ORP150 demonstrated suppressed caspase-3-like activity and enhanced elaboration of neurotrophic BDNF under hypoxia. These data indicate that ORP150 is an integral participant in ischemic cytoprotective pathways.<br />研究課題/領域番号:10480215, 研究期間(年度):1998 – 2000<br />出典：「脳虚血における細胞のストレス応答の可視化とその制御」研究成果報告書 課題番号10480215（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-10480215/104802152000kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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