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吉田, 一晴
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伊藤, 清亮 ; Ito, Kiyoaki
概要:
金沢大学附属病院<br />関節リウマチ患者血中IgG においては、結合しているN結合型糖鎖のガラクトース欠損が知られている。近年TNFα 阻害薬治療により、糖鎖異常が正常パターンに戻ることが報告された。糖鎖は、抗体の受容体であるFcγ 受
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容体との相互作用や、補体結合作用において重要な働きをしている。我々は，IL-6 阻害薬投与症例およびDMARDs投与症例において，治療前後の血清を用いIgG を精製した。そして，MALDI-TOF MSを用いて血清IgG の糖鎖解析を行った。その結果，治療法に関わらず，治療後にはガラクトースが増加しているプロファイルがみられた。<br />N-glycosylation pattern of IgG in patients with rheumatoid arthritis is reduced galactosylation. This aberrant glycosylation improve after TNF-alfa blockade therapy. Glycosylation of IgG is important in effector function of IgG such as interaction with Fc receptor. We purify serum IgG in patients who recieved IL-6 blockade or DMARDs. And we performed glycan analysis using MALDI-TOF MS. The aberrant glycosylation of IgG improve after each therapy.<br />研究課題/領域番号:15K19572, 研究期間(年度):2015-04-01 – 2019-03-31
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浅野, 雅秀 ; Asano, Masahide
概要:
金沢大学学際科学実験センター<br />β4GalT-I欠損マウスの骨髄細胞はX線照射した野生型マウスに移植しても，レシピエントの骨髄に生着しないことを見いだした。β4GalT-I欠損骨髄細胞はレシピエントの造血系を再構築できないだけでなく
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，移植後短時間での骨髄への生着が顕著に減少しており，骨髄幹細胞（HSC）の骨髄へのホーミングが障害されていた。次に，シアル酸合成の鍵酵素であるGNE遺伝子の点変異マウス（シアル酸の合成が低下）の骨髄細胞を用いて移植を行ったところ，β4GalT-I欠損骨髄細胞ほどではないが，骨髄へのホーミングが半分程度に減少し，シアル酸もHSCの骨髄へのホーミングに重要であることが示唆された。<br />We have found that beta4GalT-I-deficient bone marrow (BM) cells cannot engraft in the BM of X-ray radiated wild-type mice. Not only beta4GalT-I-deficient BM cells cannot establish hematopoietic system of recipient mice, but also their engraftment into the BM shortly after BM transfer was markedly reduced, indicating that homing of hematopoietic stem cells (HSC) into the BM was impaired. We next investigated mice having a point mutation in the GNE gene, that encodes a key enzyme for sialic acids biosynthesis. Homing efficiency of BM cells from GNE point-mutant mice was reduced to half that of wild-type mice, although the reduction was not prominent as in beta4GalT-I-deficient mice. These results suggest that sialic acids at the terminus of carbohydrate chains also play a role in HSC homing.<br />研究課題/領域番号:23650232, 研究期間(年度):2011 – 2013
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浅野, 雅秀 ; Asano, Masahide
概要:
金沢大学学際科学実験センター<br />ガラクトース転移酵素やシアル酸合成酵素の遺伝子改変マウスを解析することにより,IgA腎症やネフローゼの発症に糖鎖異常が関わっていることを明らかにした。また,ガラクトース含有糖鎖はその種類によって,空間
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学習・記憶や協調運動などの高次脳機能や初期発生にも重要な役割を担っていることを明らかにした。これらの成果は糖鎖の生物学的重要性を示すと共に,ヒト疾患の診断や治療に応用できると考えられる。<br />研究課題/領域番号:19300144, 研究期間(年度):2007 – 2009
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浅野, 雅秀 ; Asano, Masahide
概要:
金沢大学学際科学実験センター<br />高次脳機能における糖鎖の役割を明らかにするために様々な糖鎖遺伝子の改変マウスを用いて,行動実験を中心に解析を行なった。β4GalT-2欠損マウスやC6ST-1 Tgマウスでは新奇刺激に対する過敏性や注
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意機能の異常が認められ,ドーパミン系の異常が示唆された。脳特異的β4GalT-5とβ4GalT-6欠損マウスでは活動性の変化や注意機能の異常が見られ,ミエリン形成の異常が示唆された。このように糖鎖は高次脳機能に重要な役割を持っていることが明らかとなった。<br />To elucidate the role of carbohydrates in higher brain functions, we investigated glycogene-manipulated mice using behavioral analysis. β4GalT-2 KO mice and C6ST-1 Tg mice showed hypersensitive to novel stimuli and disturbed attention, and were suggested to be impaired in the dopamine system. β4GalT-5 KO mice and β4GalT-6 KO mice showed abnormal activity and disturbed attention, and were suggested to be impaired in myelin formation. These results indicated that carbohydrates play an important role in higher brain functions.<br />研究課題/領域番号:22300142, 研究期間(年度):2010 – 2012
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吉原, 亨 ; Yoshihara, Toru
概要:
金沢大学子どものこころの発達研究センター<br />本研究では，糖転移酵素に変異を持つ遺伝子改変マウスを用いた行動解析を端緒として，高次精神機能の障害やそれを一因とする精神疾患と脳内の糖鎖機能との関連について検討した．糖鎖修飾に重要な3つの
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遺伝子改変マウスを用いて実験を行い，1）糖タンパクの合成に関わるガラクトース転移酵素を欠損させたマウスにおいては，不安の減弱，社会性行動と注意機能の変化を見出した．2）糖脂質の合成に関わるガラクトース転移酵素を欠損させたマウスでは軸索変性によると推察される顕著な運動障害と発育不全，これらの障害はヒトの精神疾患，神経疾患と類似するものであり，病因理解，治療法の確立に有用なモデルマウスであることが明らかとなった．<br />In this study, we focused on the functions of glycosyltransferases that acts as key factors in behavioral regulators. To reveal the relationships between those glycosyltransferases and human mental / neurological disease, we employed several strains of gene mamipulated mice and behavioral, histological and biochemical strategies were used. As result, 1) the knockout mouse related to the glycoprotein formation showed enhanced anxiety and disturbance of attention / sensory gating. 2) the knockout mouse related to the glycolipid formation showed severe motor disfunction and developmental retardation that could be explained by axonal disorganization. Therefore these behavioral phenotypes observed in several gene manipulated mice have similarities in human mental / neurological disease, we could confirm that these model mice are useful for the understanding of human disease.<br />研究課題/領域番号:23700509, 研究期間(年度):2011-2013
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渡邉, 琢夫 ; Watanabe, Takuo
概要:
金沢大学医学系研究科<br />細胞表面受容体RAGEの細胞内シグナル生成に関わる分子を同定することを目的とし、研究実施計画に基づいて研究を遂行した結果、以下の成果を得た。1.RAGE分子のアスパラギン酸結合型糖鎖修飾部位に変異を導入し、糖
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鎖を持たないRAGE分子を細胞に発現させることにより、糖鎖のリガンド結合およびシグナル生成への関与を検討した。その結果、糖鎖の付加によって一部のリガンドとの親和性が低下し、細胞内シグナル生成も減弱していることが明らかとなった。2.RAGE分子の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を蛍光色素で標識し、生細胞表面RAGEを蛍光標識することによりRAGE分子の挙動を観察した。その結果、RAGEはpinocytosisの関わる機構により恒常的に細胞内へ取り込まれていることが明らかとなった。この細胞内取り込みはリガンド刺激による影響を受けなかった。3.上記モノクローナル抗体をFRETのドナーとアクセプターの対をなす2種の蛍光色素で標識し、生細胞表面RAGE分子同士の2分子FRETを観察することにより、高分子リガンド依存性のRAGEのオリゴマー化の検出に成功した。4.RAGE分子のオリゴマー化を引き起こさないと予想される低分子量ヘパリンなどの低分子RAGEリガンドは、RAGEを介する細胞内シグナルを惹起せず、むしろ高分子リガンドによるシグナル生成を阻害する。これらの新知見から、高分子リガンドによるRAGEのオリゴマー化が細胞内シグナル生成の最初のステップであることが強く示唆され、臨床的応用が期待されるRAGE拮抗薬開発の基本原理が明らかになった。<br />RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) is a cell surface receptor that bind several ligands, such as AGE (advanced glycation endproducts), HMGB-1 (high mobility group box-I protein), amyloid beta. The intracellular signals evoked by RAGE-ligand interaction were thought to play pivotal roles in development of various diseases. However, the mechanism of generation of intracellular signals by RAGE was poorly understood.This study shed lights on several new aspects of RAGE signaling mechanism as follows.I. Recombinant wild-type, de-N-glycosylation and G82S RAGE proteins were produced in COS-7 cells, purified and assayed for ligand-binding abilities. De-N-glycosylation at N81 and G82S mutation decreased Kd for glycolaldehyde-derived AGE to three orders of magnitude lower levels compared with wild-type. AGE-induced upregulation of VEGF mRNA was significantly augmented in endothelial cell-derived ECV304 cells expressing de-N-glycosylated and G82S RAGE when compared with wild-type expresser.2. RAGE molecules of living cell surface were labeled by fluorescent dye-conjugated monoclonal antibody that binds to extracellular domain of RAGE (mAbl3G4), and the dynamic state of RAGE was analyzed by confocal fluorescence laser microscopy. The results indicated that RAGE molecules were constitutively internalized, and pinocytotic mechanism was, at least partly, involved in RAGE internalization. The rate of RAGE internalization was not altered by addition of RAGE ligand.3. RAGE molecules of living cell surface were labeled by mixture of mAbl3G4 conjugated with Alexa 488 and mAbl3G4 with Alexa 594, which are a pair of donor and acceptor for FRET (fluorescence resonance energy transfer), to detect oligomerization of RAGE molecule by FRET. The results indicated that the RAGE molecule oligomerized upon binding its ligand.4. Low molecular weight RAGE ligands such as low molecular weight heparin, which are speculated not to induce the RAGE oligomerization, did not evoke RAGE-mediated intracellular signal, and inhibited the signaling by high molecular weight ligands.These new findings strongly suggested that the oligomerization is the first step of the signal generation, and revealed the principle of the development of RAGE antagonists that should be promising candidates of the preventive medicine for RAGE-related diseases.<br />研究課題/領域番号:18590260, 研究期間(年度):2006-2007<br />出典：「マルチリガンド受容体RAGEによる細胞内シグナル生成機構の解明」研究成果報告書 課題番号18590260（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-18590260/185902602007kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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山本, 靖彦 ; Yamamoto, Yasuhiko
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />糖尿病状態で促進的に形成される後期糖化反応生成物(advanced glycation endproducts、AGE)がAGE特異受容体(receptor for AGE、RAGE)を介して糖尿病合
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併症の発症・進展に関わることが明らかになってきた。RAGEは一回膜貫通型受容体で、その細胞外領域に2本のN-結合型糖鎖構造をもち、これらの糖鎖付加部位に挟まれたごく狭い領域がAGEリガンド結合部位である。本研究の目的は、RAGEの糖鎖修飾がリガンド結合に与える影響を明らかにすることである。(1)培養血管内皮細胞株ECV304細胞に、野生型、それぞれ片方の糖鎖付加部位(-NXS/T-)のNをAにした変異導入型、両変異導入型の計4種類の組み換えRAGE蛋白を強制発現した。N末端側から2番目のN型糖鎖結合部位への変異導入によって、AGE-BSAに対するVEGF mRNAの発現増強が生じた。(2)培養血管内皮細胞で発現するRAGEの糖鎖修飾には、高血糖、AGE刺激、インスリン負荷のいずれにおいても、あるいは3者同時負荷においても影響が生じなかった。しかし、50mg/dl以下の低血糖暴露で糖鎖修飾がほぼ完全に阻害されることが明らかになった。(3)糖尿病あるいは非糖尿病正常マウスの脳、肺、腎、小腸からタンパクを抽出し、RAGE糖鎖修飾の有無をウエスタンブロットで推定した。その際に、N型糖鎖を酵素的に外すglycopeptidase-Fを使用した。腎臓においては糖鎖修飾のないRAGEも発現していた。RAGEのN-結合型糖鎖付加修飾がないと、AGEリガンドのRAGEへの結合能が亢進することが明らかとなった。低血糖暴露がRAGEのN-結合型糖鎖付加修飾を阻害する一因子であった。RAGEのリガンド結合部位の糖鎖付加修飾の多様性が糖尿病血管症の発症・進展に関わることがはじめて分子レベルで証明された。<br />研究課題/領域番号:16790183, 研究期間(年度):2004 – 2005<br />出典：「グライコミクスによる糖尿病合併症発症の新機序の解明」研究成果報告書 課題番号16790183（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16790183/)を加工して作成
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浅野, 雅秀 ; Asano, Masahide
概要:
金沢大学学際科学実験センター<br />細胞の増殖と分化には細胞間の相互作用が重要であり,細胞表面の糖鎖を介した相互作用はその中でも重要な機構の一つである。我々はβ-1,4-ガラクトース転移酵素-I(β4GalT-I)遺伝子KOマウスを作成
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して,生体内でのガラクトース糖鎖の役割を解析してきた。しかし,最近β4GalTが7つの遺伝子からなるファミリーを形成していることがわかり,β4GalT遺伝子群に役割分担があることがわかってきた。そこで,β4GalT-I KOマウスの糖鎖構造を詳細に解析して,β1,4-結合のGalを定量し、糖鎖生合成における細胞種ごとのβ4GalT-I遺伝子の寄与を検討した。次に、β4GalTが生合成に関与することが知られているセレクチンのリガンド糖鎖について解析し、その生合成におけるβ4GalT-Iの寄与を検討した。さらに、セレクチンが関与する炎症反応について、β4GalT-I KOマウスの応答性を解析し、β4GalT-I遺伝子の欠損が炎症反応に与える影響を明らかにした。また、皮膚創傷治癒過程におけるβ4GalT-I遺伝子欠損の影響を解析した。以上の結果、β4GalT-Iはセレクチンのリガンド糖鎖の生合成に重要な役割を担っており、β4GalT-I KOマウスでは、その欠損のために炎症反応の減弱や皮膚創傷治癒過程の遅延が生じたと考えられた。以上の解析はすべて交雑系のβ4GalT-I KOマウスを用いて行ったが、一方、近交系のβ4GalT-I KOマウスは胎生後期に致死となることを明らかにした。致死となる数日前から胎仔よりはむしろ胎盤の成長遅延が顕著に認められ、胎盤の異常が致死の原因であることが示唆された。このようにマウスの遺伝的背景により致死性が変化する理由として、他のβ4GalT遺伝子群による相補が考えられたので、他のβ4GalT遺伝子のKOマウスも作製して両者の役割分担の解析を現在進めている。<br />Cell-to-cell, interactions are important for cell growth and differentiation. The interaction through cell surface carbohydrates is one of indispensable mechanisms among them. We have been studying on the role of carbohydrates in vivo by generating a gene knockout mouse deficient in β-1.4-galactosyhransferase-I(β4GalT-I). β4GalTs are recently found to form the gene family consisting of 7 genes, which have their own roles.We analyzed carbohydrate structures of β4GalT-I KO mice in detail. Contribution of β4GalT-I gene to the biosynthesis of carbohydrates of various cell types was estimated by measuring Gal residues in the β1,4-linkage. Next, carbohydrate ligands of selectins, which are known to be synthesized by β4GalTs and other glycosyltransferases, were analyzed in β4GalT-I KO mice. Contribution of β4GalT-I gene to their biosynthesis was also estimated. Furthermore, Inflammatory responses of β4GalT-I KO mice and the effect of β4GalT-I deficiency were examined. In addition, the effect of β4GalT-I deficiency on skin wound healing was examined. Our results indicated that β4GalT-I plays an important role in the biosynthesis of carbohydrate ligands of selectins and their deficiency results in reduction of inflammatory responses and delayed wound healing in β4GalT-I KO mice.While these results were obtained using β4GalT-I KO mice on mixed genetic backgrounds, we found β4GalT-I KO mice on inbred background to be lethal during late embryogenesis. Since growth retardation of the placenta rather than the embryo was remarkable several days before its death, the defect of placenta was suggested to be a cause of the embryonic lethality. Since the reason of changeable lethality depending on genetic background might be a compensatory activity by other β4GalTs, gene knockout mice deficient in another β4GalT gene were generated. Studies on elucidating the role of these p4GalT genes are in progress.<br />研究課題/領域番号:13480280, 研究期間(年度):2001 – 2003<br />出典：「ノックアウトマウスを用いたガラクトース転移酵素遺伝子群の役割分担の解明」研究成果報告書 課題番号13480280（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-13480280/134802802003kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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論文
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大島, 徹 ; Ohshima, Tohru
概要:
金沢大学医学系研究科<br />皮膚創傷治癒過程は,炎症期,増殖期,成熟期と3つの時期に大別される生体防御反応である.この過程に関与する様々な細胞は,細胞表面分子を介した細胞間相互作用によって制御されている.細胞表面のガラクトース糖鎖は細胞
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間相互作用に重要な役割を果たしていると考えられているが,未だ詳細な検討はなされていない.本研究では,皮膚創傷治癒過程におけるガラクトース糖鎖の生物学的意義の解明を目的として,β-1,4-ガラクトース転移酵素(GalT)-I欠損(KO)マウス及びヘテロマウスの背部に皮膚欠損創を作製し,創傷治癒に関与する種々の因子についての経時的測定を行い,治癒の程度を比較検討した.ヘテロマウスに比べGalT-I KOマウスは創の閉鎖率,肉芽組織内における血管内皮細胞占有率,再上皮化が,各々有意に減少していた.さらに,損傷部におけるコラーゲン量が有意に減少しており,それらに関与する分子(TGF-β1,CTGF,COL1A1)並びに血管新生に関与するVEGFの発現が,各々有意に減少していた.損傷部における炎症の様態については,ヘテロマウスに比べGalT-I KOマウスでは,マクロファージ数及びケモカイン(MCP-1,MIP-1α,MIP-2)の発現が,各々有意に減少していた.以上から,コントロールマウスに比べGalT-I KOマウスは炎症反応の減弱が認められ,また,組織修復や血管新生に関与する遺伝子発現の減少が認められた.その結果として,GalT-I KOマウスでは皮膚創傷治癒が遅延したものと判断された.GalT-Iはセレクチンのリガンド糖鎖であるシアリルLexの生合成に関与していることから,GalT-I KOマウスでは創部へ白血球浸潤細胞数の減少が生じ,その結果,それら細胞群が分泌する増殖因子等の減少が生じたことで治癒が遅延したと考えられる.<br />研究課題/領域番号:13470101, 研究期間(年度):2001 – 2003<br />出典：「皮膚の創傷治癒過程における癌関連遺伝子の動態とその法医病理学的応用」研究成果報告書 課題番号13470101（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13470101/)を加工して作成
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