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喜多村, 晃一 ; Kitamura, Koichi
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />B型肝炎ウイルス（HBV）持続感染者は国内で130～150万人と推定されており、感染を放置すれば慢性肝炎、肝硬変、肝がんへと進行するおそれがある。HBV持続感染では、cccDNAと呼ばれる環状ウイルス
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DNAが、宿主細胞の核内に維持されウイルス複製の鋳型となる。cccDNAを除去する有効な治療法は無く、B型肝炎の根治が難しい理由となっているが、現在のところcccDNAを標的とする分子機構の知見が少ない。本研究では、HBV cccDNAに対してゲノム情報を改変すると考えられる宿主因子AID/APOBEC蛋白質及び関連するDNA修復機構の作用について解析を行った。<br />Covalently closed circular DNA (cccDNA) forms a template for the replication of hepatitis B virus (HBV). Despite the crucial role of cccDNA in viral persistence, little is known about the host factors that target this viral intermediate. Recent studies have revealed that AID/APOBEC3 cytidine deaminase family members can induce C-to-U hypermutation on viral genome and restrict viral replication. Uracil residues in DNA are removed by base excision repair (BER) enzyme, uracil DNA glycosylase (UNG), when cytidine deamination is occurred in host genome. We investigated whether uracil residues were generated in HBV cccDNA by APOBEC3G and removed by UNG using in vitro. We found that IFNγ stimulation of hepatocyte cell lines induced the endogenous APOBEC3G expression and HBV cccDNA hypermutation. When UNG activity was inhibited, the IFNγ-mediated hypermutation of cccDNA was enhanced. Our result indicate that BER pathway cancels the mutations of the cccDNA generated by APOBEC proteins.<br />研究課題/領域番号:26460993, 研究期間(年度):2014-04-01 - 2017-03-31
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川口, 和紀 ; Kawaguchi, Kazunori
概要:
金沢大学附属病院消化器内科<br />B型肝炎ウイルスは肝炎および肝細胞癌を引き起こすが、肝組織内において肝細胞以外に内皮細胞、胆管細胞、免疫細胞など各構成細胞が存在し、ウイルス感染によってこれら各細胞がどのような相互作用を起こすかが明らか
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となっていない。そこで一細胞遺伝子解析を行うことにより、各構成細胞での遺伝子発現変化が明らかとなり、Notchシグナルをはじめとする細胞間シグナル変化は感染細胞におけるウイルス関連転写因子を制御させることが判明した。また、臨床肝組織検体において転写因子の解析を行った結果、核酸アナログによる影響はこのような細胞間シグナルに変化を与え、肝組織における構成細胞間の病態と密接に関与すること示した。<br />Liver tissue consists from endothelial cells, bile duct cells, immune cells and hepatocyte. Hepatitis B virus induces hepatitis and liver cancer, but the interaction and virus infection related signaling between these component cells are not still clarified. We analyzed these interactions by measuring gene expression in each component cells using single cell gene analysis. We clarified the intercellular signaling including Notch signaling activation and this interaction resulted in the involvement of transcription factors in hepatitis B virus infected cells. Results of analyzing clinical liver tissue found that these transcription factors or intercellular signaling were affected under nucleos(t)ide analogues treatment. In conclusion, intercellular signaling were found to be important in hepatitis B virus infected liver tissue.<br />研究課題/領域番号:17K09414, 研究期間(年度):2017-04-01 - 2020-03-31<br />出典：「B型肝炎ウイルスが引き起こす肝組織構成細胞の変化と癌化の解明」研究成果報告書 課題番号17K09414（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-17K09414/17K09414seika/)を加工して作成
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喜多村, 晃一 ; Kitamura, Koichi
概要:
国立感染症研究所 / 金沢大学医薬保健研究域医学系<br />B型肝炎ウイルス(HBV)持続感染ではcccDNAと呼ばれる環状ウイルスDNAが長期に維持されているが、現在のところcccDNAの形成や維持に関わる分子機構の知見は少ない。本研究
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では、HBV cccDNAの形成・維持に関わる新たな宿主因子の同定及び分子機構について解析を行い、FEN1というDNA修復因子がcccDNA形成に関わることを明らかにし、これを用いて新たなcccDNA実験系を開発した。この成果はさらなる分子機構解明と抗ウイルス薬の標的探索のためにも重要な知見となる。<br />Hepatitis B virus (HBV) infection remains a worldwide health problem that affects more than 350 million people. HBV is one of the major etiological pathogens for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. HBV covalently closed circular DNA (cccDNA) is a key viral intermediate for persistent infection. However, the molecular mechanism of cccDNA formation has not been clarified. In this project, we found that the host factor flap-endonuclease 1 (FEN1) is pivotal in cccDNA formation. We developed a novel cccDNA formation assay using purified viral precursor DNA with recombinant FEN1, DNA polymerase, and DNA ligase. This study provides new insights into the molecular mechanisms of cccDNA formation and proposes FEN1 as a potential anti-HBV drug target.<br />研究課題/領域番号:17K09412, 研究期間(年度):2017-04-01 - 2020-03-31<br />出典：「B型肝炎ウイルスcccDNAを標的とする分子機構の解析」研究成果報告書 課題番号17K09412（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-17K09412/17K09412seika/)を加工して作成
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黒木, 和之 ; Kuroki, Kazuyuki
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />B型肝炎ウイルス感染機構研究のための新規B型肝炎ウイルスベクターの作製およびダックB型肝炎ウイルス(DHBV)の感染に関わる宿主因子の同定とB型肝炎ウイルスのin vitro感染系の確立を試みた。その結
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果、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子を組込んだB型肝炎ウイルスの効率的な産生に成功した。また、DHBVの感染に関わる宿主因子は同定できていないが、ヒト肝がん由来細胞株HuH7がin vitro感染系樹立に有望であることがわかった。<br />For the study of entry pathway of hepatitis B viruses, we have constructed novel hepatitis B virus vectors and attempted to identify the host molecules related to the entry pathway and to establish in vitro infection systems for these viruses. As the results, we could construct novel hepatitis B virus vectors containing secretion-type luciferases as reporter genes. Unfortunately, we could not identify the host molecules relate to DHBV infection, but we were able to find human hepatoma cell HuH7 as HBV susceptible cells under the culture condition containing 2% DMSO.<br />研究課題/領域番号:22659090, 研究期間(年度):2010-2012
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村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
HBV X蛋白(HBx)がRNAポリメラーゼサブユニットRPB5と結合し、転写装置を修飾する可能性を検討した。本研究は、ウイルス制御蛋白が転写装置と直接相互作用し転写を正又は負に修飾する研究であり、転写装置の新しい局面を明らかにする研究と位
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置付けられる。この研究で得られた成果は、1)HBxが転写基本因子TFIIBとRPB5とに相互作用することを見い出した。置換変異HBxを用いた検討により、3者間の相互作用領域がHBxによるトランス活性化に必要であることを確認した(J.Biol.Chem.,‘97)。2)in vitro及びin vivo転写系で人為的プロモータを用いて、HBxは転写活性化因子として機能せず、転写補助因子として種々の異なった転写活性化系にCoactivatorとして機能した(J.Biol.Chem.,‘98)。3)RPB5が制御蛋白と相互作用するサブユニットであることから、RPB5と結合する新規蛋白の単離・同定を進めた。ヒトcDNAライブラリーからRPB5結合蛋白cDNAの単離を行い、新規のRMP(RPB5-mediatingprotein)を同定した(Mol.Cell.Biol.,‘98)。RMPは、TBPやHBxとの結合能は示さず、RPB5と特異的に結合した。HepG2細胞を用いてRMPを過剰発現すると、HBxによるトランス活性化が抑制された。更にHBxの存在しない条件で、活性化転写を抑制するCorepressor活性を示した。RMPのRPB5結合領域が内部欠損変異RMP(RMP-Id150など)を用いた解析から、RMPが転写を負に制御する機能には、RPB5結合領域が必須であった。これらの結果は、RMPがHBxと機能的な拮抗因子であることを示唆した。4)p53とHBxの結合を生化学的に示し、p53及びHBxのトランス活性化が相互に干渉すること、しかしXトランス活性化能を欠くがp53機能を干渉する欠損変異HBxの存在を明らかにした。これらの結果はHBxのトランス活性化とp53への干渉とは区別されるHBxの機能であることを明らかにした(Cancer Res.,‘97).<br />HBx has been suspected to have positive roles in hepatocarcinogenesis. Previously e reported that RNA polymerase II subunit 5 (RPB5) is one of the targets of HBx, suggesting a possibility that HBx may modulate transcription machinery. Our main results are following. 1).The trimeric interaction among HBx, RPB5 and TFIIB is necessary for HBx transactivation since the substitution mutants defective in binding either to TFIIB or RPB5 are impaired in transacting ability (J.Biol. Chem., 272 : 317 (1997)). 2)By in vivo and in vitro transcription assays, GaIDB-fused HBx can not act as transcriptional activator, but HBx augmented activated transcription by Gal-VP16, indicating that HBx can act as a coactivator (J.Biol. Chem., (1998)). 3)We isolated a novel RPB5-mediating protein (RMP) by a far Western cloning. RMP strongly bound RPB5 but neither HBx nor TBP in vitro and in vivo. RMP counteracts HBx transactivation in a dose dependent manner. Furthermore, RMP acts as a co-repressor since it inhibits transcriptional activation by Gal-VPl6. These RMP functions requires its RPB5-binding region, suggesting that these functional interference is due to competition between HBx and RMP to bind RMP.These results suggest that RMP negatively modulates transcription process at the interaction step between RPB5 and TFIIB which might be the target process of HBx (Mol. Cell. Biol., (1998)). 4)HBx interacts with p53 and interferes p53-dependent transactivation. However, the interference of the p53 function by HBx is distinct from the transactivation of HBx (Cancer Res., (1997)).<br />研究課題/領域番号:09044278, 研究期間(年度):1997-1998<br />出典：「ヒトB型肝炎ウイルスX蛋白による転写装置の修飾」研究成果報告書 課題番号09044278 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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中本, 安成 ; Nakamoto, Yasunari
概要:
金沢大学附属病院<br />慢性ウイルス肝炎からの肝発癌に関与するウイルス側、宿主側要因を明らかにする目的で、マウスモデルを用いて検討した。B型肝炎ウイルストランスジェニックマウスに、同系統の野生型マウスから骨髄細胞、脾細胞を移植することに
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よって慢性肝炎モデルを作成した。肝炎の経過を観察すると、約17カ月後に肝細胞癌が発症した(J.Exp.Med.188:341,1998)。1.ウイルス側要因の検討として、肝組織におけるウイルス遺伝子の発現をRNA、タンパクレベルで検討すると、前癌状態、非癌組織における発現はやや低いレベルながら持続していた。癌組織におけるウイルス遺伝子の発現レベルには多様性を認め、ウイルス遺伝子または発現調節因子の変異が示唆された。2.宿主側要因の検討として、移植する脾細胞をCD4またはCD8陽性Tリンパ球、Bリンパ球、単球の各分画に分離して役割を検討したところ、主にCD8陽性Tリンパ球が慢性肝炎の増悪および遷延化に作用していた。そこで臨床応用を念頭に、CD8陽性Tリンパ球の細胞障害作用を抑制する目的で、エフェクター分子であるFasリガンドに対する中和抗体を投与したところ、慢性肝炎が抑制され肝発癌が著明に減少した。これより、肝発癌過程には以上のウイルス側、宿主側要因の関与が示唆された。<br />研究課題/領域番号:11770270, 研究期間(年度):1999-2000<br />出典：「トランスジェニックマウスモデルを用いたウイルス性肝発癌の分子機構に関する研究」研究成果報告書 課題番号: 11770270（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11770270/）を加工して作成
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村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />B型肝炎ウイルス(HBV)X蛋白(HBx)は肝細胞がん発症への関与が示唆されている。我々は、RNAポリメラーゼサブユニット5(RPB5)がHBxの宿主標的であることを見い出し、HBxがRPB5、転写基本
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因子TFIIBとの3者の相互作用し、転写補助活性化能(coactivator)を示すことを見い出した(J.Biol.Chem.,1998)。更にHBxに拮抗する宿主蛋白として、転写抑制補助能(corepressor)を示すRMP(RPB5-mediatingprotein)を同定した(Mol.Cell,Biol.,98)。本年度の研究成果として、1)HBxが標的とするRPB5とTFIIBの相互作用の生物的な機能の解析を酵母細胞系で検討した。その結果、TFIIBのN端及びC端領域は、酵母とヒト間で互換性を示すことを見い出した。またyRPB5V110G(ヒトのcounterpartはV105に相当する)の高温度感受性変異は、yTFIIB又はヒトと酵母のキメラTFIIB(hTFIIB(aa1-47)/yTFIIB(aa58-339)の過剰発現によって形質抑制(phenotypic suppression)を受ける結果を得た。この結果は、酵母細胞とヒトの系でRPB5とTFIIBの機能的な相互作用が認められることが示された。2)RMPの機能的な拮抗因子と推定されたRMPは、細胞質と核に共に見い出された。転写を負に制御する機能にはRPB5結合部位以外に、RMPのC端領域が必要であり、その領域に存在する核移行シグナル(NLS)が必須であった。更にRMPのN端側にRMPの核への移行を干渉する領域が存在することを見い出した。細胞質への滞留に関与する配列はaa81-118内に限定され、この領域はcoiled-coil領域とほぼ一致した。細胞質に滞留する分子機構と核内への移行を促進する因子については、現在検討を進めている。<br />研究課題/領域番号:11154210, 研究期間(年度):1999<br />出典：「新規転写補助因子RMPによる転写制御とHBV X蛋白のトランス活性化」研究成果報告書 課題番号11154210（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11154210/)を加工して作成
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村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />RNAポリメラーゼサブユニットRPB5がHBVX蛋白(HBx)と結合し、HBxのトランス活性化に関わる結果(EMBO.J.,1995)をもとに、HBxによる転写装置の修飾機構を検討した。本研究は転写装置
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と直接相互作用して転写を正又は負に修飾する転写制御の新しい局面を明らかにする研究である。得られた成果は、1)人為的プロモータを用いたin vitro及びin vivo転写系で、HBxは転写活性化能は示さず、転写補助因子能(Coactivator)を示し、種々の異なった転写活性化系にCoactivatorとして機能した。各種変異HBxを用いたcoactivator機能の必須領域はトランス活性化ドメインと一致し、精製はHBxはHeLa核抽出蛋白の内在性転写活性化因子の活性化転写を促進した(J.Biol.Chem.,1998)。これらの結果は、従来からのin vivoで報告されたトランス活性化はcoactivator能の結果であると推定された。2)RPB5結合蛋白がHBxの機能修飾と拮抗することを想定して、RPB5結合蛋白cDNAの単離を行い、新規のRMP(RPB5-mediating protein)を同定した(Mol.Cell.Biol.,1998)。RMPは、TBPやHBxとの結合能は示さず、RPB5と特異的に結合した。RMPの過剰発現はHBxトランス活性化に拮抗し、HBx非存在下で活性化転写を制御するCorepressor活性を示した。これらのRMPの転写抑制効果には、RPB5結合領域が必須であった。これらの結果は、RMPがHBxと機能的な拮抗因子であることを示唆した。<br />研究課題/領域番号:10173213, 研究期間(年度):1998<br />出典：「新規転写補助因子RMPによる転写制御とHBvX蛋白のトランス活性化」研究成果報告書 課題番号10173213（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10173213/)を加工して作成
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中本, 安成 ; Nakamoto, Yasunari
概要:
金沢大学附属病院<br />肝発癌モデルにおいて、慢性肝炎の経過を組織学的に観察すると、移植9カ月後に肝細胞の異形性が出現し、17カ月後に100%(12/12)に肝腫瘍が発生した。FasLを介する経路を抑制する目的で、肝炎の経過中にFasL
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の中和抗体を投与すると以下の変化を認めた(J.Exp.Med.196: 1105,2002)。a)血清トランスアミナーゼ値から、肝炎のピークは1/3に軽快した。b)FasLにより活性化される肝細胞内のcaspase-3は、1/4に低下していた。c)肝細胞のアポトーシスをTUNELアッセイにより解析すると、1/5に低下していた。d)肝細胞の再生増殖をPCNA染色により検討すると、1/3に減少していた。e)肝組織に浸潤している単核球数や抗原特異的Tリンパ球の割合に変化はなかった。f)肝炎発症後7〜23ヵ月間の観察期間中に発生した肝腫瘍は、13%(2/15,P<0.0001)に減少した。これより、肝発癌モデルにFasL中和抗体を投与することによって、肝への炎症細胞の浸潤には影響しないもののFasLを介するシグナル経路が直接抑制されて、肝炎が軽減するとともに肝細胞のアポトーシス及び再生増殖が低下し、肝癌の発生が減少することが示された。<br />研究課題/領域番号:13770259, 研究期間(年度):2001-2002<br />出典：「トランスジェニックマウスモデルを用いた肝発癌の分子免疫学的予防法の研究」研究成果報告書 課題番号13770259（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13770259/ ）を加工して作成
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