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論文 |
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伊藤, 清亮 ; Ito, Kiyoaki
概要:
金沢大学附属病院<br />関節リウマチ患者血中IgG においては、結合しているN結合型糖鎖のガラクトース欠損が知られている。近年TNFα 阻害薬治療により、糖鎖異常が正常パターンに戻ることが報告された。糖鎖は、抗体の受容体であるFcγ 受
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容体との相互作用や、補体結合作用において重要な働きをしている。我々は，IL-6 阻害薬投与症例およびDMARDs投与症例において，治療前後の血清を用いIgG を精製した。そして，MALDI-TOF MSを用いて血清IgG の糖鎖解析を行った。その結果，治療法に関わらず，治療後にはガラクトースが増加しているプロファイルがみられた。<br />N-glycosylation pattern of IgG in patients with rheumatoid arthritis is reduced galactosylation. This aberrant glycosylation improve after TNF-alfa blockade therapy. Glycosylation of IgG is important in effector function of IgG such as interaction with Fc receptor. We purify serum IgG in patients who recieved IL-6 blockade or DMARDs. And we performed glycan analysis using MALDI-TOF MS. The aberrant glycosylation of IgG improve after each therapy.<br />研究課題/領域番号:15K19572, 研究期間(年度):2015-04-01 – 2019-03-31
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清水, 宣明 ; Shimizu, Nobuaki
概要:
1.微小透析バイオセンサの開発 (1)酸化電流値のグルコース濃度依存性 グルコース濃度依存性を調べた結果、酸化電流値はグルコース濃度に比例して増加した。検出限界濃度は0.01mMであり、また5mM以上では直線性が認められなくなった。酵素固定
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化型の電極と比較して電流値の再現性は優れていた。 (2)溶存酸素依存性と電子メディエータの導入 グルコースオキシダーゼはその反応過程で酸素を必要とする。したがって低溶存酸素の状態では、センサの感度が低下する可能性がある。予め窒素ガスをバブリングすることで溶存酸素濃度を低下させた場合、感度の低下と応答時間に対する時定数の増加が見られた。フェロセンを電子メディエータとして白金電極とグルコースオキシダーゼの間に介在させることで、低溶存酸素領域でもセンサの感度を維持することができた。 (3)pHの影響 酵素には至適pHがあり、センサの識別素子として用いる場合にはpHの影響を調べる必要がある。そこでグルコースオキシダーゼ溶液をpH=5.6、試料溶液のグルコース濃度を1.0mMに設定し、溶液中のリン酸緩衝液のpH5.6〜8.0まで変化させ、試料溶液中のpHの影響を調べた。その結果、pH5.6から7.5の範囲において試料溶液中のpHの影響を受けないことが明らかとなった。これは、酵素が透析膜によって外液のpH変化から保護されているためと考えられる。 2.水晶振動子を用いた免疫センサの開発 AT-cutの水晶板上に金を蒸着し、ピエゾ圧電効果を利用した超微小量質量測定センサを作製し、電極表面にヤギ抗ヒトIgGを固定化し、IgGの測定について検討した。抗体は金電極表面上にチラミンを電解重合後、チラミン-グルタルアルデヒドー抗体のアミノ基間にシッフ塩を形成させることにより安定に固定化することができた。このセンサの電極質量変化と基本振動数との間には比例関係が成立し、その感度は1ng/Hzであった。各種濃度のヒトIgG溶液に対する免疫センサ応答の経時的変化を調べた結果、IgG投与によって振動数が極めてゆっくりとした時間経過で変化し、IgG50μg/ml投与では約20分後に最大振動数変化が200Hzに達した。<br />The purpose of this research project was to accomplish the biosensing system which can detect the endogenous chemical substances influencing neuronal activities in the brain. For this purpose, the characteristics of the following sensors were studied ; (1) enzyme microdialysis biosensor and (2) a quarts crystal microbalance biosensor for immunosorbent assay.1. Enzyme microdialysis biosensorThe concentric biosensor was consisted of glass body with a semi-permeable membrane at the tip, working electrode and an inlet and outlet capillary for the perfusion of enzyme solution. The working electrode and the inlet capillary were inserted into a semi-permeable hollow fiber (o.d.=220 μm). The advantage of the biosensor was that the micro-environment around the working electrode could be easily changed by perfusing the enzyme solution. Glucose oxidase was used in this study and steady state response of the sensor was proportional to the glucose concentration up to 5mM.The detection limit of the glucose concentration was 0.01 mM.The decrease in the sensitivity caused by the reduction of dissolved oxygen concentration was overcome by using ferrocene carboxyaldehyde as an electron mediator.2. Quarts crystal microbalance biosensorThe piezoelectric crystals were studied under various operational conditions and were also applied to the determination of human IgG concentration. AT-cut crystals, with a basic resonant frequency of 9 MHz, were modified by immobilizing goat anti-human IgG onto the surface of crystal electrode with tyramine and glutaraldehyde. The immobilization technique improved the long term stability of the biosensor, and the change in frequency caused by the adsorption of material onto the surface of electrode was confirmed to be 1 Hz/ng. The shift in frequency resulting from the reaction of human IgG and goat anti-human IgG correlated with a concentration range of 10μg/ml-50 μg/ml. The suitability of this technique for neurophysiological studies was confirmed for investigation of the chemical fluctuations in vivo.<br />研究課題/領域番号:10557006, 研究期間(年度):1998–2000<br />出典：「バイオアフィニティを利用する多機能バイオセンシングシステムの開発」研究成果報告書 課題番号10557006(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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吉川, 弘明 ; Yoshikawa, Hiroaki
概要:
重症筋無力症(MG)の胸腺細胞、骨髄細胞、末梢血単核球(PBMC)の抗アセチルコリン受容体抗体(AChRAb)産生能とIgG産生能を評価した。MG患者のPBMCは正常人のものに比べて高いIgG産生能を持っていることがわかった。また、MG患者
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のリンパ組織の中で、PBMCが胸腺細胞、骨髄細胞に比べて最も高いAChRAb、IgG産生能を持つことがわかった。Severe combined immunodeficiency (SCID) mouseは、機能を持ったT cellおよびB cellを持たないため、ヒト・リンパ球を注入することにより、ヒト免疫系を再構築することができる。MG患者リンパ球(胸腺細胞、PBMC)をSCID mouse腹腔内に注入し、100日程度経過した後でアセチルコリン受容体抗原を腹腔内注入することで、マウスの血清ヒトAChRAb価が上昇することを証明し、memory immune responseがおこることを証明した。また、MG患者PBMのサイトカイン産生を測定することにより、interleukin (IL)-5,IL-6がIgG産生を誘導することがわかった。以上より、T cellを標的とした免疫抑制薬タクロリムスのMGに対する有効性が期待された。臨床試験の結果、その有効性が証明され、現在、タクロリムスは難治性MGに対する治療薬として臨床で使われるようになった。タクロリムスは、これまでの免疫抑制薬に比べて効果が早く出ることがその特徴で、免疫系を介さない作用もあるものと予想された。培養骨格筋細胞の細胞内カルシウム濃度[Ca^<2+>]_iを測定することにより、タクロリムスはアセチルコリン添加によりひきおこされる[Ca^<2+>]_iを増強させることがわかり、骨格筋の興奮収縮連関に直接的に働くことが示唆された。<br />We evaluated anti-acetylcholine receptor antibody (AChRAb) and IgG productions from thymus cells, bone marrow, and peripheral blood mononuclear cells(PBMC) in patients with myasthenia gravis(MG). PBMC from MG patients spontaneously produced more abundant IgG than that from normal controls. PBMC of MG patients had an accelerated ability to produce immunoglobulin compared to that of thymus or bone marrow cells. Severe combined immunodeficiency(SCID) mice do not have functional T or B cells, and injected human lymphocytes can reconstitute a functional human immune system in the mice. We produced MG-SCID mice by injecting thymus cells and PBMC into the peritoneal cavity of the mice. One hundred days after cell transplantation, we injected acetylcholine receptor protein into the peritoneal cavity of the mice. We observed a sharp elevation of human AChRAb titer after the antigen administration suggesting a memory immune response of human lymphocytes. In a study to clarify factors that induce immunoglobulin production by cultured PBMC, we observed that interleukin (IL)-5 and IL-6 secretions are correlated with IgG production. As a result, immunotherapy targeting PBMC from MG patients seems to be effective. A clinical trial of tacrolimus proved to be effective for intractable MG patients. Currently, the usage of tacrolimus is admitted as an immunotherapy for intractable MG patients. As tacrolimus showed quick therapeutic effect compared to other immunosuppressants, pharmacological effects in addition to immunosuppression are suspected. We measured intracellular Ca^<2+> level ([Ca^<2+>]_i) in cultured skeletal muscle cell line (TE671). Tacrolimus increased [Ca^<2+>]_i induced by the addition of acetylcholine. Therefore, tacrolimus may have an effect on the excitation-contraction coupling as well as immunosuppressive effects.<br />研究課題/領域番号:13670636, 研究期間(年度):2001-2003<br />出典：「重症筋無力症の自己免疫性T細胞を標的とした免疫療法の研究」研究成果報告書 課題番号13670636 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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吉川, 弘明 ; Yoshikawa, Hiroaki
概要:
1.T細胞特異的免疫抑制剤であるFK506が、アセチルコリン受容体αサブユニット残基番号125-147に相当する合成ペプチド(Hα125-147)で免役して作成したラット実験的重症筋無力症モデル(EAMG)の発症を抑制することがわかった。2
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.多くの重症筋無力症(MG)患者において胸腺は、骨格筋抗原に特異的な免疫細胞の貯蔵器として重要な意味を持っているが、胸腺以外の臓器にも免疫細胞の存在部位を求めなければならない。3.ヒト骨格筋のニコチン性アセチルコリン受容体αサブユニットの一部分である125-147のペプチド(Hα125-147)は、これで免疫したルイスラットのリンパ節T細胞を刺激し、自己抗体を産生させ、EAMGとしての電気生理学的所見を引き起こす。この研究の目的は、このペプチドの中からヘルパーT細胞を活性化させて疾患を誘導する最小のエピトープを見つけ出し、その修飾を試みることである。我々は、Hα129-145が最小のエピトープであることを明らかにした。このペプチドの137番のフェニルアラニンをアラニンで置換したアナログペプチドは、ナイーブペプチドと同様にMHC class IIに結合するがT細胞を活性化させることができない。そのため、T細胞受容体のアンタゴニストと考えられ、治療手段として使える可能性がある。4.重症筋無力症患者の胸腺細胞を重症複合免疫不全(SCID)マウスの腹腔内に注入したところ、マウス体内でヒトIgGならびにIgMが産生された。このマウスから、胸腺細胞を回収することが可能であった。SCIDマウスの体内で機能を持ったヒトT細胞とB細胞が長期間生存することが可能であった。5.重症筋無力症患者の末梢血単核球は、骨髄細胞、胸腺細胞と比べてもっとも効率的に坑アセチルコリン受容体抗体を産生し、これは病期が2ヶ月以内と短い患者においても同様であった。末梢血単核球の抗体産生能のモニターは重症筋無力症の疾患活動性の評価に有用であると思われた。<br />1. T cell-specific immunosuppressive agent ; FK506 prevents induction of rat experimental autoimmune myasthenia gravis (EAMG) evoked by immunizing T cells against the synthetic peptide which corresponds to human acetylcholine receptor (AChR) α-subunit residues 125-147 (Hα125-147).2. The thymus in a majority of patients with acquired myasthenia gravis (MG) is the principal but not the sole reservoir of immunocytes that specifically react with muscle antigens.3. The α-subunit segment 125-147 (Nα125-147) of the nicotinic acetylcholine receptor of human skeletal muscle (AChR) is stimulatory for lymph node T cells of immunized Lewis rats, and induces autoantibody production and clinical and electrophysiological signs of EAMG.The goal of this study was to identify and modify in this autoantigen the minimal epitope (s) necessary for helper T cell activation and disease induction. We identified Hα129-145 as a minimum epitope. The analog peptide with alanine substituted for phenylalanine 137 may have therapeutic potential because it is equivalent to the native peptide in its binding to MHC class II, but fails to stimulate a T cell proliferative response, and is therefore a candidate T cell receptor antagonist.4. Thymocytes form MG patients were transferred into the peritoneal cavities of severe combined immunodeficiency (SCID) mice, which caused the mice to produce human IgG and IgM.The injected thymocytes were then recovered from the peritoneal cavities of MG-SCID mice. The functional human T and B cells survived in the SCID mice for a long period.5. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from MG patients is the most efficient site at producing AChRAb amongst thymocytes, bone marrow (BM) cells and PBMC, even in patients of short duration (equal to, or less than, 2 months). Monitoring AChRAb secretion by PBMC is useful to estimate the autoimmune activity of MG.<br />研究課題/領域番号:09670647, 研究期間(年度):1997-2000<br />出典：「重症筋無力症における自己抗体産生調節機構とその修飾に関する研究」研究成果報告書 課題番号09670647(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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