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Ueda, Takumi ; Kohama, Yuri ; Kuge, Ayana ; Kido, Eriko ; Sakurai, Hiroshi ; 櫻井, 博
概要:
金沢大学医薬保健研究域保健学系<br />Growth arrest and DNA damage-inducible 45 (GADD45) family genes encode related proteins, including
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GADD45α, GADD45β, and GADD45γ. In HeLa cells, expression of GADD45 members is differentially regulated under a variety of environmental conditions, but thermal and genotoxic stresses induce the expression of all genes. The heat shock response of GADD45β is mediated by the heat shock transcription factor 1 (HSF1), and GADD45β is necessary for heat stress survival. Heat and genotoxic stress-induced activation of c-Jun N-terminal kinase (JNK) is suppressed by the expression of GADD45 proteins. GADD45 proteins bind the JNK kinase mitogen-activated protein kinase kinase 7 (MKK7) and inhibit its activity, even under normal physiological conditions. Our findings indicate that GADD45 essentially suppresses the MKK7-JNK pathway and suggest that differentially expressed GADD45 family members fine-tune stress-inducible JNK activity. © 2017 Elsevier Inc.<br />Embargo Period 12 months
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Bayarsaikhan, Munkhuu ; Takino, Takahisa ; Gantulga, Davaakhuu ; Yoshioka, Katsuji ; Sato, Hiroshi
概要:
金沢大学がん研究所がん分子細胞制御<br />金沢大学大学院医学系研究科<br />We previously reported that the level of c-Jun NH2-terminal kinase (JNK)/stres
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s-activated protein kinase-associated protein 1 (JSAP1), a scaffold protein for JNK signaling, increases dramatically during nerve growth factor (NGF)-induced differentiation of PC12h cells. In the present study, we investigated the function of JSAP1 during PC12h cell differentiation by knocking down the level of JSAP1. The depletion of JSAP1 caused NGF-treated PC12h cells to form aggregates and impaired their differentiation. The aggregation was not observed in JSAP1-depleted cells that were untreated or treated with epidermal growth factor. Immunocytochemical studies indicated that N-cadherin, but not E-cadherin, was localized to sites of cell–cell contact in the aggregated cells. Furthermore, an inhibitory anti-N-cadherin antibody completely blocked the aggregation. Taken together, these results suggest that JSAP1 regulates cell–cell interactions in PC12h cells specifically in the NGF-induced signaling pathway, and does so by modulating N-cadherin.
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Tanahashi, Hiroshi ; Kito, Keiji ; Ito, Takashi ; Yoshioka, Katsuji
概要:
金沢大学がん研究所がん分子細胞制御<br />MafB is a basic leucine zipper transcription factor that plays important roles in development and
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differentiation processes. During osteoclastogenesis, its expression is downregulated at the transcriptional level via the JNK and p38 MAP kinase pathways. In the present study, we demonstrated that MafB protein stability is regulated by JNK and identified a phosphorylation site, Thr62. The expression of a constitutively active form of JNK (a fusion protein MKK7α1-JNK1β1) promoted the degradation of MafB in COS7 cells, and a T62A substitution significantly reduced the instability of MafB. The introduction of a fourfold (T58A/T62A/S70A/S74A) substitution in an acidic transcription-activating domain almost protected the instability resulting from the activation of JNK. Furthermore, treatment with proteasome inhibitors increased the MafB level, and a high-molecular-weight smear, characteristic of polyubiquitination, was observed in lysates from cells in which MafB, ubiquitin, and MKK7α1-JNK1β1 were co-expressed. These results suggest that phosphorylation of MafB by JNK confers susceptibility to proteasomal degradation. © 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.
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Yoshioka, Katsuji
概要:
金沢大学がん研究所がん分子細胞制御<br />The mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, which is conserved from yeast to h
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umans, is activated in response to a variety of extra- and intracellular stimuli, and plays key roles in multiple cellular processes, including proliferation, differentiation, and apoptosis. The MAPK pathway transmits its signal through the sequential phosphorylation of MAPK kinase kinase to MAPK kinase to MAPK. Specific and efficient activation of the MAPK cascades is crucial for proper cellular responses to stimuli. As shown in yeast, the mammalian MAPK signaling system may also employ scaffold proteins, in part, to organize the MAPK signaling components into functional MAPK modules, thereby enabling the efficient activation of specific MAPK pathways. This review article describes recent advances in the study of potential mammalian scaffold proteins that may help us understand the complex regulation, including the spatial and temporal control, of the mammalian MAPK signaling pathways.
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滝野, 隆久 ; Takino, Takahisa
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />細胞外マトリックス分解と細胞運動が協調的に作用してがんの浸潤・転移が成立する。この協調作用は細胞運動の極性形成と密接に関与していると考えられる。本研究ではMT1-MMPおよびJNK情報伝達経路の構成分子
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とJNK結合分子の細胞運動における役割を調べた。ヒト線維肉腫細胞株HT1080をI型コラーゲン上に接着させることによりERK活性化、MMP-2活性化、MT1-MMP活性発現、細胞運動が誘導された。HT1080細胞におけるMT1-MMPの過剰発現は細胞運動およびERK活性化を亢進した。この細胞運動とERK活性化はMMP阻害剤とMEK阻害剤により抑制され、活性型MEK発現により誘導される細胞運動とMMP-2の活性化はMMP阻害剤でともに抑制された。また、MT1-MMPを遺伝導入した上皮細胞をコラーゲン上で培養し上皮細胞成長因子で刺激すると、対照細胞に比べてERK活性化が亢進することが判明した。上皮細胞増殖因子により誘導される細胞運動におけるMT1-MMP活性の役割を現在検討中である。MT1-MMPは恐らく細胞接着斑形成に関与することでI型コラーゲン上における上皮細胞増殖因子の情報伝達経路に影響を及ぼしていると考えられる。JNK足場蛋白であるJSAP1のグリオーマ細胞株における発現はFAKの活性化を導き、その結果p130Casのリン酸化を誘導した。この結果と一致してJSAP1発現はフィブロネクチン刺激によるJNK活性化を亢進した。さらにJSAP1発現はフィブロネクチン上におけるJNK依存的細胞運動を誘導し、JNK結合部位を欠失したJSAP1変異体では細胞運動・JNK活性化誘導は認められなかった。JSAP1mRNAの発現はグリオーマ細胞株の運動能、ヒト脳腫瘍の悪性度と相関して上昇していた。以上のことからJSAP1は悪性腫瘍の浸潤・転移能獲得に関与していると考えられた。<br />研究課題/領域番号:16022227, 研究期間(年度):2004<br />出典：「がん浸潤の細胞運動と細胞外マトリックス分解機構の解析」研究成果報告書 課題番号16022227（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16022227/)を加工して作成
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善岡, 克次 ; Yoshioka, Katsuji
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />哺乳類MAPキナーゼ(MAPK)経路の足場タンパク質は、シグナル伝達の特異性維持およびMAPKの時空間的制御に関わる因子と考えられているが、詳細については不明な点が多い。本研究課題では、我々のグループが
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同定した足場タンパク質JSAP1、およびそのファミリーメンバーJSAP2を中心に、細胞レベル・個体レベルでの解析を行った。先ず、in vitro分化系を用いたjsap1欠損マウス胚性幹細胞の解析を行い、JSAP1は心筋発生および神経発生において重要な役割を担っていることを明らかにした(JBC, 2002; BBRC, 2005)。また、JSAP1-JNKシグナル伝達系はFAK (focal adhesion kinase)と協調的に働き、細胞移動の制御に関わることを見いだした(Oncogene, 2002; JBC, 2005)。足場タンパク質JSAP1は細胞間相互作用にも関与しており、PC12h細胞では細胞接着分子N-カドヘリンを介して制御していることを見いだした(BBRC, 2007)。免疫組織化学法とin situハイブリダイゼーション法を用いて胎仔および成体マウス脳を詳細に調べ、発達過程および成体脳におけるJSAP1-JNKシグナル伝達系の重要性を強く示唆する結果を得た(JNC, 2006)。さらに、jsap1ノックアウトマウス(KO)および小脳初代培養系を用いた解析を行い、JSAP1-JNKシグナル伝達系は小脳顆粒前駆細胞の増殖プログラムを分化プログラムに変更する役割を担っていることを見いだした。一方、jsap2 KOマウスを作製・解析し、JSAP2が発生過程において重要な役割を担っていることを明らかにした。これらの成果は、難治疾病の病因解明や治療にも繋がると期待されるものである。特に、主に小児の小脳に発生する髄芽腫は、小脳顆粒前駆細胞の異常増殖に起因すると考えられているが、その異常増殖はJSAP1-JNKシグナル伝達系の破綻によることが強く示唆された。このように、本研究成果は、悪性腫瘍などの発症機序に関する分子レベルでの理解に貢献するとともに、JSAP1-JNKシグナル伝達系を標的とした薬剤開発にも応用されるであろう。<br />Scaffold proteins of the mammalian MAP kinase (MAPK) cascades are considered having critical roles in spatio-temporal regulation of MAPK pathways by organizing their signaling components into functional modules. We are particularly interested in the functions of these scaffold proteins, mainly c-Jun NH_2-terminal kinase (JNK)/stress-activated protein kinase-associated protein 1 (JSAP1); a scaffold protein that participates in JNK MAPK cascades, both in vitro and in vivo. Our findings are summarized as follows :1) We first investigated the JSAP1-null ES cells. We found that the cardiomyogenesis and neurogenesis process in JSAP1-null mutants were seriously impaired, which strongly indicated that JSAP1 plays an important role in cardiomyocyte and neural development (JBC, 2002 ; BBRC, 2005).2) We also demonstrated that JSAP1 regulates cell movement in cooperation with the focal adhesion kinase (Oncogene, 2002 ; JBC 2005).3) We further showed that JSAP1 scaffold regulates cell-cell interact ions in PC12h cells specifically in the NGF-induced signaling pathway, and does so by modulating N-cadherin (BBRC, 2007) through the knock down experiments in PC12h cells.4) We also studied JSAP1 and JNK expression in mouse brains. Our results obtained by in situ hybridization and immunohistochemical analyses strongly suggested that JSAP1-JNK signaling plays important roles in developing and adult mouse brains (JNC, 2006).5) During the development of the cerebellum, massive clonal expansion of granule cell precursors (GCPs) occurs in the outer part of the external granular layer (EGL). We have provided evidence that JSAP1 and active JNK were expressed preferentially in the post-mitotic inner EGL progenitors in the developing cerebellum. Moreover, jsapl deficiency resulted in increasing numbers of proliferating GCPs in mouse embryos. Besides, overexpression of JSAP1 in cultured GCPs led to increased numbers of NeuN-positive cells together with the activation of JNK. Together, these data strongly indicated that JSAP1 promotes the cell-cycle exit and differentiation of GCPs by modulating JNK activity in cerebellar development (in preparation).<br />研究課題/領域番号:14086205, 研究期間(年度):2002 – 2006<br />出典：「哺乳動物のストレス応答MAPキナーゼ経路における足場タンパク質の解析」研究成果報告書 課題番号14086205（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-14086205/140862052006kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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滝野, 隆久 ; Takino, Takahisa
概要:
HT1080細胞のI型コラーゲンおよびファイブロネクチン(FN)上での細胞運動はMMP阻害剤BB94により抑制され、ECM分解の減少、細胞接着斑の過形成と運動極性の喪失が認められた。一方、MT1-MMPの過剰発現はECM分解、細胞運動と細胞
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接着斑の代謝回転を誘導し、阻害変異体の発現でその抑制が認められた。HT1080細胞のBB94処理は細胞接着により誘導されるERK活性化を抑制した。以上の結果からMT1-MMPは細胞接着により誘導されるERK活性化を調節することにより細胞接着斑の代謝回転と細胞運動を制御していることが示唆された(T. Takino et al., Experimental Cell Research,2006)。 細胞運動時、MT1-MMPは細胞接着斑の集積と代謝回転が頻繁に起こる運動先端部の内側でECMを分解していた。細胞接着斑におけるMT1-MMPの機能に着目し、FAKの細胞接着斑標的ドメインをMT1-MMPとMT1-MMPの阻害変異体に付与し、細胞接着斑におけるMT1-MMPの役割を解析した。細胞接着斑に標的したMT1-MMPはFNへの接着後、迅速に細胞接着斑でFNを分解した。 細胞接着斑に標的したMT1-MMPの阻害変異体はMT1-MMP発現細胞におけるFN分解と細胞運動、3次元ECMへの細胞浸潤を顕著に抑制した。以上の結果から、細胞接着斑におけるMT1-MMP機能の重要性と、その活性阻害ががん浸潤・転移抑制に効果的であることが示された(T. Takino et al., Cancer Research, 2007)。<br />Membrane-type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) has been implicated in tumor invasion and metastasis. We previously reported that extracellular matrix degradation by MT1-MMP regulates cell migration via modulating sustained integrin-mediated signals. In this study, MT1-MMP-expressing cells were plated onto fibronectin-coated plates and monitored for cell-matrix adhesion formation and fibronectin degradation. The fibronectin was degraded and removed in line with the cell migration track. The migrating cells showed a polarized morphology and were in contact with the edge of fibronectin through the leading edge in which cell-matrix adhesions are concentrated. Expression of MT1-MMP targeted to cell-matrix adhesions by fusing with the focal adhesion targeting (FAT) domain of focal adhesion kinase (FAK) promoted the initial fibronectin lysis at the cell periphery immediately after adhesion. These results suggest that fibronectin is degraded by MT1-MMP located at cell-matrix adhesions which are concentrated at the leading edge of the migrating cells. lb inhibit MT1-MMP at cell-matrix adhesion, the dominant negative form of MT1-MMP (MT1-Pex) was targeted to the cell-matrix adhesion by fusing with the FAT domain (MT1-Pex-FAT). MT1-Pex-FAT accumulated at cell-matrix adhesions and inhibited fibronectin degradation as well as FAK phosphorylation more effectively than parental MT1-Pex. MT1-Pex-FAT was also shown to suppress the invasion of tumor cells into 3-dimensional collagen gel more strongly than MT1-Pex. These results suggest that MT1-MMP-mediated extracellular matrix lysis at cell-matrix adhesions induces the establishment of cell polarity, which facilitates cell-matrix adhesion turnover and subsequent cell migration. This model highlights the role of MT1-MMP at the leading edge of migrating cells.<br />研究課題/領域番号:18590287, 研究期間(年度):2006–2007<br />出典：「JNK結合分子による細胞接着斑と運動極性形成制御機構の解析」研究成果報告書 課題番号18590287 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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滝野, 隆久 ; Takino, Takahisa
概要:
FAK活性はJSAP1とp130casの共発現により増強され、その結果JSAP1とp130casのリン酸化を亢進した。JSAP1をグリオーマ細胞株U87MG細胞に遺伝子導入するとJNKのリン酸化が誘導され、fibronectin(FN)上で
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の細胞運動が亢進された。しかし、JNK結合部位を欠質したJSAP1変異体発現では細胞運動の亢進は認められなかった。JSAP1を遺伝子導入した細胞の運動先端部にJNKとJSAP1の集積が認められ、細胞運動はJNK阻害剤により抑制された。また、脳腫瘍組織を用いてMAPK足場蛋白(JIP-1,-2,JSAP1)のmRNA発現を検討した結果、JSAP1の発現と悪性度に正の相関が認められた。JSAP1は運動細胞の先端部にJNKを誘導し、FAKを介したJNK活性化経路を亢進することにより細胞運動を調節していると考えられた。 また、HT1080細胞のI型コラーゲンおよびFN上での細胞運動はMMP阻害剤BB94により抑制され、ECM分解の減少、細胞接着斑の過形成と運動極性の喪失が認められた。一方MT1-MMPの過剰発現はECM分解、細胞運動と細胞接着斑のturnoverの亢進を誘導し、dominant-negative体の発現でその抑制が認められた。HT1080細胞のBB94処理は細胞接着により誘導されるERK活性化を抑制する一方で、FAKの自己リン酸化(チロシン397番)を亢進していた。以上の結果からMT1-MMPは細胞接着により誘導されるERK活性化、FAKの自己リン酸化を調節することにより細胞接着斑、細胞運動を制御していることが示唆された。 細胞運動時の極性形成・維持機序は方向性を持った細胞運動およびその延長線上にあるがん浸潤・転移の機構を解明する上で重要である。JNK結合分子は細胞接着斑におけるJNKの局在と活性化部位を誘導することで細胞運動時の極性形成・維持を制御していると予想される。また、MT1-MMPによるECMの分解・再編をともなった微小環境の整備が細胞極性形成・維持に密接に関与していると推測される。ECMにおける極性を有した細胞運動とMT1-MMP活性発現の協調的な制御機構を解明することは、がんの浸潤・転移阻止の標的分子の同定、薬剤開発に貢献できるものと思われる。<br />JNK/SAPK-associated protein 1(JSAP1) mediated an association between focal adhesion kinase (FAK) and JNK, which was induced by either co-expression of Src or attachment of cells to fibronectin (FN). Complex formation of FAK with JSAP1 and p130 Crk-associated substrate (p130^<Cas>) resulted in augmentation of FAK activity and phosphorylation of both JSAP1 and p130^<Cas>, which required p130^<Cas> hyperphosphorylation and was abolished by inhibition of Src. JNK activation by FN was enhanced by JSAP1, which was suppressed by disrupting the FAK/p130^<Cas> pathway by expression of a dominant-negative form of p130^<Cas> or by inhibiting Src. JSAP1 was co-localized with JNK and phosphorylated FAK at the leading edge and stimulated of cell migration, which depended on its JNK binding domain and was suppressed by inhibition of JNK. The level of JSAP1 mRNA correlated with advanced malignancy in brain tumors, unlike other JIPs. We propose that the JSAP1/FAK complex functions cooperatively as a sc affold for the JNK signaling pathway and regulator of cell migration on FN, and we suggest that JSAP1 is also associated with malignancy in brain tumors.MT1-MMP expression promoted FN-induced cell migration, which was accompanied by FN degradation and reduction of stable focal adhesions, which function as anchors for actin-stress fibers, and attenuated integrin clustering. The attenuation of integrin clustering was abrogated by MT1-MMP inhibition. When cultured on fibronectin, HT1080 cells, which endogenously express MT1-MMP, showed so-called motile morphology with well-organized focal adhesion formation, well-oriented actin-stress fiber formation and the lysis of FN through trails of cell migration. Inhibition of endogenous MT1-MMP resulted in the suppression of FN lysis and cell migration and promotion of stable focal adhesion formation concomitant with enhanced phosphorylation of tyrosine 397 of FAK and reduced ERK activation. These results suggest that lysis of the extracellular matrix by MT1-MMP promotes focal adhesion turnover and subsequent ERK activation, which in turn stimulates cell migration.<br />研究課題/領域番号:16590241, 研究期間(年度):2004–2005<br />出典：「JNK結合分子による細胞運動極性制御機構の解析」研究成果報告書 課題番号16590241 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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善岡, 克次 ; Yoshioka, Katsuji
概要:
軸索輸送は神経細胞の成長と生存に不可欠であり、その障害は神経細胞死や神経変性疾患の直接の原因となることが知られています。我々は軸索輸送を制御するメカニズムの解明に向け、足場タンパク質JSAPを対象として研究を行いました。その結果、JSAPは
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キネシン依存的な軸索輸送の制御因子であり、その破綻は神経変性を引き起こす可能性を見出しました。<br />Axonal transport is essential for neuronal development and function, and disrupted axonal transport is an important pathophysiological factor in a variety of neurodegenerative diseases. We suggest that scaffold protein JSAP may function as a positive regulator of kinesin-dependent axonal transport to prevent neuronal degeneration.<br />研究課題/領域番号:23500385, 研究期間(年度):2011-2013
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善岡, 克次 ; Yoshioka, Katsuji
概要:
発達期小脳の免疫組織染色を行い、JSAP1および活性型JNKは増殖を停止し顆粒前駆細胞で強く共発現していることを見出した。また、小脳顆粒前駆細胞の分化過程における足場タンパク質JSAP1の細胞膜移行とその役割を明らかにした。本研究成果は、哺
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乳類JNK経路の空間的制御に足場タンパク質JSAP1が関与することを示した最初の知見である。さらに、小脳初代培養系を用いた解析を行い、JSAP1-JNKシグナル伝達系は小脳顆粒前駆細胞のプログラムを増殖型から分化型に変換する役割を担っていることを見出した。<br />We performed immunohistochemical analysis and found that JSAP1, a scaffold protein for JNK signaling pathways, is expressed predominantly in the post-mitotic granule cell precursors (GCPs) of the inner external granular layer. We also showed that when stimulated by FGF receptor, JSAP1 translocates to the plasma membrane, where it recruits JNK and facilitates the activation of JNK, leading to the differentiation of cerebellar GCPs. Furthermore, we found that JSAP1-JNK signaling promotes the cell cycle exit and differentiation of cerebellar GCPs.
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