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中尾, 眞二 ; Nakao, Shinji
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中尾, 眞二 ; Nakao, Shinji
概要:
一部の再生不良性貧血(再不貧)患者血清抗体によって認識される白血病細胞株UT-7由来の80kD蛋白を同定するため、免疫沈降により精製したこの蛋白のアミノ酸配列を質量分析を用いて同定した。その結果、この蛋白は細胞膜関連蛋白のモエシンであること
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が判明した。患者血清中の抗モエシン抗体価をELISA法により測定したところ、再不貧患者43例中20例(46.5%)が陽性であった。抗体の陽性率は、自己免疫性再不貧のマーカーであるPNH型血球陽性の再不貧患者では22例中14例(64%)であったのに対し、PNH型血球陰性の再不貧患者では18例3例(17%)のみであった。一方、UT-7由来のcDNAライブラリーのスクリーニングにより同定した蛋白diazepam-binding inhibitor-related sequence-1 (DRS-1)に対する抗体はPNH型血球陽性再不貧例84例中の32例(38.1%)に検出された。DRS-1のcDNA断片に由来するGST融合蛋白を作成し、各々に対する抗体の有無を決定したところ、抗体陽性者の約半数において、173-198位のペプチドに対する抗体が検出された。HLA-DR15蛋白と結合するT細胞エピトープのペプチドを合成し、DRS-1ペプチド特異的T細胞の前駆細胞頻度をELISPOTアッセイで調べたところ、抗DRS-1抗体陽性でDR15を持つ患者では、検討した2例の両例においてDRS-1特異的T細胞の前駆細胞が高頻度に存在することが示された。このDRS-1ペプチドによって患者末梢血単核細胞から誘導したDRS-1特異的CD4陽性T細胞は、DR15陽性白血病細胞株KH88を用量依存性に傷害した。したがって、抗DRS-1抗体を持つHLA-DR15陽性再不貧患者においては、DRS-1特異的CD4陽性が骨髄不全の発症に関わっている可能性が示唆された。<br />To identify an 80-kD protein derived from a leukemia cell line, UT-7, that was recognized by scrum IgG of a plastic anemia (AA) patients, we purified this protein using immunoprecipitation and determined amino acid sequence with mass fingerprinting. The protein proved to be moesin. When patients' sera were screened using ELISA and recombinant moesin, 20 of 43 (46.5%) AA patients were positive for anti-moesin antibodies. The antibody was detected in 14 of 22 (64%) patients possessing increased paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH)-type cells which are known to be a marker for lmmunopathophysiology of AA while it was detected in only 3 of 18 (17%) patients without increased PNH-type cells.We also identified diazepam-binding inhibitor-related sequence-1 (DRS-1), as a candidate autoantigen of AA using immunoscreening of cDNA library derived from UT-7. Antibodies to this protein were detectable in 32 of 84 (38.1%) of AA patients possessing increased PNH-type cells. Epitope mapping using GST-fusion protein fragments derived from DRS-1 cDNA showed that a 26 mer peptide (amino acid 173-198) contained a hot spot of antibody epitopes which was recognized by nearly half of AA patients showing anti-DRS-1 antibodies. When peripheral blood lymphocytes were examined using ELISPOT assay for the presence of T-cell precursors specific to a DRS-1 peptide which has high affinity to HLA-DR15, two AA patients carrying HLA-DR15 and anti-DRS-1 antibodies showed high frequency of DRS-1-specific CD4^+ T cells. DRS-1-specific T cells generated from one of the two AA patients by stimulating T cells with the DRS-1 peptide showed cytotoxicity against an HLA-DR15^+ and DRS-1-expressing leukemia cell line KH88 in a dose-dependent manner. These findings indicate that in AA patients possessing HLA-DR15 and anti-DRS-1 antibodies, DRS-1-specific T cells may contribute to development of bone marrow failure.<br />研究課題/領域番号:15390298, 研究期間(年度):2003-2004<br />出典：「再生不良性貧血における自己抗原の解析: 自己抗体によって同定された造血幹細胞抗原におけるCD4陽性T細胞エピトープの同定」研究成果報告書 課題番号1539029 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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杉盛, 千春 ; Sugimori, Chiharu
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />再生不良性貧血(再不貧)患者ではHLA-DRB1*1501アレルとHLA-DRB1*1502アレルを保有する患者が多く、発作性夜間血色素尿症(PNH)型血球が高率に検出されることが知られている。このP
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NH型血球は再不貧の病態に免疫学的異常が関与している事の証拠とされているが、HLA-DRB1*1501患者ではPNH型血球の微少増加が高率に検出され、均一な疾患像を呈する一方、HLA-DRB1*1502患者ではPNH型血球陰性例も多い。このことからHLA-DRB1*1501アレルHLA-DRB1*1502アレルはわずか1アミノ酸の違いながら再不貧の病態に果たす役割は異なっている可能性が考えられた。HLA-DRB1*1501患者保有患者と比較して検討した結果、HLA-DR15分子の抗原提示とは無関係の真の疾患感受性遺伝子がHLA-DRB1*1502の近傍に存在する可能性が考えられた。そこで、本研究ではHLA-DRB1*1502を保有するPNH型血球陽性および陰性のそれぞれの患者群を対象としてマイクロサテライトマーカーを用いた相関解析を行い、両群間で頻度が大きく異なるマイクロサテライトマーカーを同定することによりHLA-DRB1*1502に連鎖したPNH型血球陰性再不貧の疾患感受性遺伝子の同定を目指した。62例のHLA-DRB1*1502陽性再不貧患者(PNH型血球陽性患者37例、PNH型血球陰性患者25例)についてマイクロサテライトマーカーを用いた相関解析行った結果、PNH型血球陰性HLA-DRB1*1502陽性再不貧患者ではC1-3-1の293アレルの頻度が有意に高かった(33% vs 3%, Pc=0.03)。一方、PNH型血球陽性HLA-DRB1*1502陽性再不貧患者では同部位のアレル頻度に差は見られなかった。この事から、PNH型血球陰性HLA-DRB1*1502陽性再不貧患者ではC1-3-1近傍のOct-4などのいくつかの疾患感受性候補遺伝子が同定された。<br />研究課題/領域番号:18790648, 研究期間(年度):2006 – 2007<br />出典：「再生不良性貧血における連鎖解析を用いた疾患感受性遺伝子の同定」研究成果報告書 課題番号18790648（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18790648/)を加工して作成
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中尾, 眞二 ; Nakao, Shinji
概要:
金沢大学大学院・医学系研究科<br />再生不良性貧血の免疫病態に密接に関与するCD4陽性T細胞クローンZN1のエピトープを同定するため、Herpesvirus saimiri感染により不死化したZN1の標的細胞をスクリーニングしたところ、
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造血因子の存在下で1週間培養した自己骨髄単核細胞が、ZN1の有意な増殖を促すことが示された。この患者が持つHLAクラスII遺伝子のうち、どの分子が抗原提示に関わっているかを決定するため、ZN1にX線照射した培養自己骨髄単核細胞を加える際に、抗HLA-DR抗体、抗HLA-DQ抗体、または抗HLA-DR2抗体を加えたところ、抗DR抗体または抗DR2抗体を加えた時にのみNT1の増殖反応が抑制された。そこで、CLIP置換型Ii鎖遺伝子発現ベクターに由来するペプチドをHLA-DR2に提示させるため、COS-7細胞にDR2β鎖プラスミドとDR2α鎖プラスミドをトランスフェクトしたところ、抗DR2抗体で認識されるDR2分子の発現が確認された。現在、ペプチドライブラリーをこのCOS7トランスフェクタントに導入し、NT1によるスクリーニングを行っている。一方,同じ患者の自己抗体によって認識される造血幹細胞上の自己抗原をSEREX法によってスクリーニングしたところ、αグロビンペプチド(αグロビン^<1-101>)が同定された。このペプチドとGSTとのfusion蛋白に対する抗体は再生不良性貧血患者25例中21例に検出された。このペプチドにより刺激された患者末梢血単核細胞中には、αグロビン^<1-11>に特異的なCD8陽性T細胞が0.55%含まれていた。さらに、この培養T細胞は自己の造血前駆細胞由来コロニーを、CFU-GMで対照の43%、BFU-Eコロニーで50%に減少させた。以上の所見から、αグロビンは再生不良性貧血における自己抗原の一つであると考えられた。<br />To determine an epitope of a CD4^+ T-cell clone, ZN1, that appears to have an essential role in the development of aplastic anemia, we attempted to establish a system to screen a peptide capable of stimulating this T-cell clone using CLIP-replacement Ii-chain gene expression vectors. ZN1 was immortalized using infection with Herpesvirus saimiri. Stimulation with cultured bone marrow mononuclear cells (BMMCs) in the presence of IL-3 and GM-CSF induced DNA synthesis by ZN1. When monoclonal antibodies (mAbs) against HLA-DR, HLA-DR2 or HLA-DQ were added to the culture, both anti-DR and anti-DR2 mAbs inhibited DNA synthesis by ZN1 in response to cultured BMMCs, suggesting restriction ** antigen recognition by HLA-DR2. Then, we transfected COS7 cells with a DR2 b gene plasmid and a DR a chain plasmid. Flow cytometry confirmed expression of DR2 by the COS7 transfectant. We are now testing interferon-γ excretion by ZN1 stimulated by the HLA-DR2-COS7 that was transfected with CLIP-replacement Ii chain gene vectors.In relation to this project, we screened cDNA library derived from the patient's bone marrow mononuclear cells using serological identification of antigens by recombinant expression cloning to identify autoantigens in AA. IgG antibodies recognizing α globin (residue 1-101, α globin^<1-101>) was detected in the patient's serum. Immunoblotting using recombinant α globin^<1-101> detected the specific antibodies in 21 of 25 (84.0%) AA patients. When the patient's lymphocytes were stimulated with α globin^<1-11>, a low percentage of CD8* T cells reactive to this peptide were generated. The cultured T cells showed cytotoxicity against HLA-A*0201^+JY cells that were pulsed with this peptide. Addition of T cells stimulated by α globin^<1-11> to autologous CD34^+ cells reduced the number of colonies derived from BFU-E and CFU-GM to nearly a half of the control, α globin may serve as a target of immune system attack in AA patients possessing HLA-A-*0201.<br />研究課題/領域番号:13470202, 研究期間(年度):2001 – 2002<br />出典：「自己免疫性再生不良性貧血における自己抗原の解析-CD4陽性T細胞エピトープの同定-」研究成果報告書 課題番号13470202（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-13470202/134702022002kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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中条, 達也 ; Chuhjo, Tatsuya
概要:
金沢大学医学部附属病院<br />1.再生不良性貧血(再不貧)のうち、HLA-DR15を保有し末梢血中に微小なPNH形質の血球を有する例において、免疫抑制療法に対する反応性がみられた。再不貧患者の末梢血顆粒球のclonalityを検討したと
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ころ、主としてPNH血球陰性例にclonalityが確認された。2.PNH血球陽性の再不貧患者の血清中には、巨核芽球性白血病細胞株UT7の細胞質内蛋白に対する抗体が、間接蛍光抗体法とWestern blot法にて確認された。3.UT7に対する抗体陽性例の血清にてcDNAライブラリーをスクリーニングして、抗原遺伝子Diazepam binding inhibitors(DBI)-related sequence-1(DRS-1)を同定した。4.レコンビナントDRS-1蛋白を用いてELISAを行ったところ、PNH血球陽性の再不貧71例中27例(38.5%)に抗DRS-1抗体がみられたが、PNH血球陰性再不貧32例中では2例のみ(6.3%)にしか抗体がみられなかった。5.定量PCRを用いてDRS-1のmRNAの発現を検討したところ、成熟白血球では発現レベルが低かったが、UT-7やCD34陽性の骨髄造血細胞ではレベルが高かった。6.DR15上にDRS-1のアミノ酸配列上のCD4 epitope(同配列は、抗体の認識するhot spot 191-204と重なっていた)のペプチドを付加して、抗DRS-1抗体を持つ再不貧患者末梢血T細胞を刺激して得られた細胞障害性T細胞は、DRB1*1501を遺伝子導入されDRS-1を高発現しているL cell(マウス線維芽細胞)のみを選択的に障害した。7.Enzyme-linked immunospot assayにより、HLA-DR15を保有し抗DRS-1抗体を持つ再不貧患者末梢血中において、このCD4 epitopeに特異的なT細胞が高頻度に見いだされた。<br />To identify candidate antigens in aplastic anemia (AA), we screened proteins derived from a leukemia cell line with serum of an AA patient and identified diazepam-binding inhibitor-related protein I (DRS-1). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) revealed high titers of antiミ DRS-1 antibodies (DRS-1 Abs) in 27 (38.0%) of 71 AA patients displaying increased paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH)-type cells (PNH+), 2 (6.3%) of 32 PNH- AA patients, 5 (38.5%) of 13 PNH+ myelodysplastic syndrome (MDS) patients, and none of 42 PNHミ MDS patients. DRS-1 gene was abundantly expressed in myeloid leukemia cell lines and in CD34+ cells derived from healthy individuals. Stimulation of T cells from an AA patient displaying high DRS-1 Abs with a putative CD4+ T -cell epitope (amino acid residues [aa's] 191-204) presented by HLA-DRI5, which overlapped with a hot spot (aa's 173-198) of DRS-1 Ab epitopes, gave rise to T cells cytotoxic for L cells (murine fibroblasts) that were transfected with DRB 1^*1501 and DRS-1. Enzyme-linked immunospot assay demonstrated increased frequency of T-cell precursors specific to the DRS-1 peptide in other HLA-DRl5+ AA patients displaying high DRS-1 Ab titers. These findings indicate that DRS-1 may serve as an autoantigen eliciting immune attack against hematopoietic stem cells in a subset of AA patients characterized by increased PNH-type cells.<br />研究課題/領域番号:14570969, 研究期間(年度):2002 – 2003<br />出典：「抗造血幹細胞抗体の検出による自己免疫性骨髄不全の診断法の確立」研究成果報告書 課題番号14570969（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-14570969/145709692003kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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