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平野, 由朗
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村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
HBV X蛋白(HBx)がRNAポリメラーゼサブユニットRPB5と結合し、転写装置を修飾する可能性を検討した。本研究は、ウイルス制御蛋白が転写装置と直接相互作用し転写を正又は負に修飾する研究であり、転写装置の新しい局面を明らかにする研究と位
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置付けられる。この研究で得られた成果は、1)HBxが転写基本因子TFIIBとRPB5とに相互作用することを見い出した。置換変異HBxを用いた検討により、3者間の相互作用領域がHBxによるトランス活性化に必要であることを確認した(J.Biol.Chem.,‘97)。2)in vitro及びin vivo転写系で人為的プロモータを用いて、HBxは転写活性化因子として機能せず、転写補助因子として種々の異なった転写活性化系にCoactivatorとして機能した(J.Biol.Chem.,‘98)。3)RPB5が制御蛋白と相互作用するサブユニットであることから、RPB5と結合する新規蛋白の単離・同定を進めた。ヒトcDNAライブラリーからRPB5結合蛋白cDNAの単離を行い、新規のRMP(RPB5-mediatingprotein)を同定した(Mol.Cell.Biol.,‘98)。RMPは、TBPやHBxとの結合能は示さず、RPB5と特異的に結合した。HepG2細胞を用いてRMPを過剰発現すると、HBxによるトランス活性化が抑制された。更にHBxの存在しない条件で、活性化転写を抑制するCorepressor活性を示した。RMPのRPB5結合領域が内部欠損変異RMP(RMP-Id150など)を用いた解析から、RMPが転写を負に制御する機能には、RPB5結合領域が必須であった。これらの結果は、RMPがHBxと機能的な拮抗因子であることを示唆した。4)p53とHBxの結合を生化学的に示し、p53及びHBxのトランス活性化が相互に干渉すること、しかしXトランス活性化能を欠くがp53機能を干渉する欠損変異HBxの存在を明らかにした。これらの結果はHBxのトランス活性化とp53への干渉とは区別されるHBxの機能であることを明らかにした(Cancer Res.,‘97).<br />HBx has been suspected to have positive roles in hepatocarcinogenesis. Previously e reported that RNA polymerase II subunit 5 (RPB5) is one of the targets of HBx, suggesting a possibility that HBx may modulate transcription machinery. Our main results are following. 1).The trimeric interaction among HBx, RPB5 and TFIIB is necessary for HBx transactivation since the substitution mutants defective in binding either to TFIIB or RPB5 are impaired in transacting ability (J.Biol. Chem., 272 : 317 (1997)). 2)By in vivo and in vitro transcription assays, GaIDB-fused HBx can not act as transcriptional activator, but HBx augmented activated transcription by Gal-VP16, indicating that HBx can act as a coactivator (J.Biol. Chem., (1998)). 3)We isolated a novel RPB5-mediating protein (RMP) by a far Western cloning. RMP strongly bound RPB5 but neither HBx nor TBP in vitro and in vivo. RMP counteracts HBx transactivation in a dose dependent manner. Furthermore, RMP acts as a co-repressor since it inhibits transcriptional activation by Gal-VPl6. These RMP functions requires its RPB5-binding region, suggesting that these functional interference is due to competition between HBx and RMP to bind RMP.These results suggest that RMP negatively modulates transcription process at the interaction step between RPB5 and TFIIB which might be the target process of HBx (Mol. Cell. Biol., (1998)). 4)HBx interacts with p53 and interferes p53-dependent transactivation. However, the interference of the p53 function by HBx is distinct from the transactivation of HBx (Cancer Res., (1997)).<br />研究課題/領域番号:09044278, 研究期間(年度):1997-1998<br />出典：「ヒトB型肝炎ウイルスX蛋白による転写装置の修飾」研究成果報告書 課題番号09044278 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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論文
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村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
我々は、B型肝炎ウイルスX蛋白に結合する宿主蛋白の探索から、RNAPI,II,IIIに共通するサブユニットであるRPB5をX結合蛋白として単離した。本研究は、両者の相互作用による転写開始機能の修飾を分子機構として解明するために、RPB5の機
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能標的を探索し、X蛋白の役割を検討し、RPB5の構造と機能の解析を行った。(1)RPB5は、X蛋白と相互作用をすると共に、転写基本因子TFIIBと特異的に結合することがin vitro 及びin vivoで確認された。TFIIBはRPB5と共にHBV X蛋白と特異的に相互作用し、3者の複合体形成がin vitro及びin vivoで確認した。(2)X蛋白のトランス活性化ドメインの置換変異の解析から、トランス活性化ドメイン内にRPB5及びTFII結合の区別される領域の存在が示され、X蛋白のトランス活性化にはRPB5とTFIIBとの結合が何れも必要であることが示された。3者の複合体形成と3者間結合のXトランス活性化能への効果は、X蛋白は転写開始複合体形成の段階でRNAPとTFIIBの結合を安定化する可能性が示唆された。(3)人工的な系であるGa14x5CATを用いた検討の結果、HBxはactivated Transcription系でco-factor機能を保持していた。X蛋白が機能する段階の検討が今後に残された。(4)RPB5がX蛋白と相互作用し転写の効率化をもたらす結果は、X蛋白がRPB5と内在性の宿主蛋白との相互作用を排除する可能性がある。この可能性を検討するために、RPB5結合蛋白のcDNA単離をfar-Westem法を用いて行い、I種のcDNA(RPB5-mediating-protein : RMP)を単離した。全長cDNAの単離を進めた結果、RMPは新規遺伝子であった(投稿準備中)。予備的結果は、RMPがX蛋白によるトランス活性化に拮抗した。この結果はRMPが抗X遺伝子として機能することを示唆した。RMPが新規のがん抑制遺伝子である可能性もあり、今後の系統的な解析が必要となった。<br />Our previous finding that HBx directly interacts with RPB5, a common subunit of RNA polymerases, implies that HBx modulates the function of RNA polymerase directly. This project addressed the molecular mechanism of transcriptional modulation of RPB5 by HBx. 1.We found that both HBx and RPB5 specifically bound to TFIIB in vitro and in vivo. We could detect the ternary complex consisting of RPB5, HBx, and TFIIB in vivo and in vitro. 2.Some HBx substitution mutants, which were severely impaired in transacting activity, exhibited reduced binding affinity with either TFIIB or RPB5 in a mutually exclusive manner, suggesting that HBx transactivation requires the interactions of both RPB5 and TFIIB.The results indicate that HBx is a novel virus modulator that facilitates transcriptional initiation by stabilizing the association between RNA polymerase and TFIIB through communication with RPB5 and TFIIB.3.We addressed whether HBx acts as a transcriptional activator when it is recruited to a distal cis-element, and whether HBx positively affects in vitro transcription. The results indicated that HBx can not act as a transcriptional transactivator but can act as a cofactor involving in transcription through protein-protein interaction. 4.To understand the function of RPB5, we tried to isolate RPB5-binding protein by direct cDNA cloning using far-Western blotting. We successed to isolate a cCNA redundantly which was found unreported and unique. The gene was designated as RPB5 mediating protein (RMP). Preliminarily experiments showed that RMP may interfer transactivation of HBx in mammalian cells. The results suggest that RMP may antagonize HBx. Further characterization of RMP is on going.<br />研究課題/領域番号:07458178, 研究期間(年度):1995-1996
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