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論文 |
村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
HCVの持続感染の遮断が肝がん発症のリスクを低下させると期待される。RNA依存RNA合成酵素(RdRP)であるNS5BはHCV複製遮断の有力な標的である。NS5Bに集約型(Cm)及び置換型(Pm)変異を導入しRdRP活性の検討を行い、RdR
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P活性に必須な5残基を新たに報告した。本研究では、RdRP活性と構造の研究を進め、NS5Bと相互作用するHCV NS5Aと宿主蛋白ヌクレオリンのRdRP活性への影響と、in vitroで得られた知見がHCV複製に与える影響を解析し、以下の成果を得た。1)NS5Bがオリゴマー化することを見い出し、Cm変異解析によりオリゴマーに必須な2残基は、活性中心より離れたRdRP活性に必須な2残基と一致した。これはRdRP活性にオリゴマー化が必須であることを示した。2)NS5BとNS5Aの特異的結合を見い出し、NS5Bの4配列とNS5Aの2つの領域が相互作用に必要である。精製NS5Aは少量でRdRP活性を促進し、多量でRdRP活性を阻害した。3)我々は、ヌクレオリンとNS5B相互作用を見い出し、2蛋白の相互作用領域を限定した。この結合がNS5Bの細胞内局在に影響を与えた。4)MILE HCV RNAレプリコン系を用いて解析した結果、RdRP活性に必須な5アミノ酸残基がHCV複製に必須であった。5)HCV RNAレプリコン系にNS5AのNS5B結合領域にCm或はPmを導入した解析で、NS5B結合変異NS5AではHCV複製が起きず、NS5AとNS5Bとの相互作用がHCV複製に必須であることを強く示唆した。6)ヌクレオリンとNS5Bの相互作用の影響をHCV RNAレプリコン系で検討した。ヌクレオリン結合領域にCm或はPmを持つレプリコンは、HCV複製が起きないか極端に低下していた。SiRNA法でヌクレオリン発現が一時的に低下した細胞では、Hcv複製が1/3-1/4程度に低下した。<br />Eradication of HCV persistent infection may prevent or delay incidence of hepatocellular carcinoma. HCV NS5B is RdRP that is a strong target to eradicate HCV replication. In hope to find novel strategies, we had identified 5 residues of NS5B critical for RdRP activity by introducing clustered alanine substitution (Cm) and point alanine substitution. This grant aims to get further insight of structure and function of RdRP enzyme, to characterize NS5B-interacting partners, NS5A and a host factor nucleolin, and finally to evaluate these interactions and mutations of NS5B on HCV RNA replication using a HCV RNA replicon system. Followings are the results we obtained.1)Oligomer formation of NS5B was observed and two residues were defined by scanning the Cm and Pm libraries to be critical for oligomer formation. Interestingly the two residues are among the residues indispensable for RdRP activity, strongly suggesting that oligomeric interaction might be prerequisite for RdRP activity. 2)Speci fic interaction between NS5B and NS5A was found. The critical regions of the two factors for the interaction were mapped, 3)We found NS5B truncated at C-terminal was enriched in nucleoli. Nucleolin was defined to the interacting factor with NS5B. The NS5B-binding fragments did not affected much RdRP activity, although the interaction affected the subcellular localization of NS5B. 4)We evaluated whether the critical 5 residues for RdRP in vitro are indispensable for HCV replication using MlLE HCV RNA replicon. Actually all the residues are absolutely required for HCV replication. 5)Using HCV replicon harboring mutations of NS5A that are defective in NS5B-binding, we evaluated the role of the NS5A-NS5B interaction in HCV replication. Cm mutants and some Pm mutants within the regions necessary for NS5B-binding could not support HCV replication, strongly suggesting the importance of the inter action. 6)We evaluated the interaction of nucleolin and NS5B in the HCV RNA replicon system. Cm mutant of NS5B defective in nucleolin-binding could not support efficient HCV replication. Transient knock-down of nucleolin with siRNA greatly reduced the G418-forming foci, strongly suggesting that the interaction of nucleolin and NS5B is critical for HCV replication.<br />研究課題/領域番号:14370054, 研究期間(年度):2002-2004<br />出典:「C型肝炎ウイルス(HCV)複製酵素(NS5B)と製御因子NS5Aの機能解析」研究成果報告書 課題番号14370054 (KAKEN:科学研究費助成事業データベース(国立情報学研究所)) 本文データは著者版報告書より作成
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論文 |
村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
HCVの持続感染の遮断が肝がん発症のリスクを低下させると期待される。HCVは宿主とは異なるRNA複製過程があり、RNA依存RNA合成酵素(RdRP)であるNS5BはHCV複製遮断の有力な標的である。HCV複製の阻止を目標に、HCVNA5Bの
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構造と機能の検討を行った。我々は、1)集約型と点置換アラニン変異を系統的に導入し、NS5BのRdRP活性に必須である5アミノ酸残基を新たに特定した。RdRP活性には鋳型結合能は要求せず、鋳型/primer結合能を要求した(Hepatol., 2001)。2)NS5Bがhomomericにオリゴマー化することを見い出し、オリゴマーに必須な2残基を特定した。各種置換変異による解析から、この2残基の交換が可能である結果を得た(J.Biol Chem., 2002)。3)NS5BとNS5Aの特異的結合を見い出し、集約型アラニン置換変異NS5Bによる解析から4配列がNS5A結合に必要な領域と限定し、NS5AがNS5BのRdRP活性を修飾することを見い出した(J.Biol.Chem., 2002)。4)ヌクレオリンと全長型NS5Bの膜構造での共局在を見い出した。相互作用はヌクレオリンのC端側の領域と、NS5Bでは2つの領域に限定された。ヌクレオリン結合欠損のNS5Bの変異で、全長NS5Bとヌクレオリンの共局在は観察されなかった(J.Biol.Chem., in press, 2003)。HCV複製の阻害剤開発の新たなデザインとして、NS5Bのオリゴマー化、NS5Aとの相互作用、及びヌクレオリン結合領域が標的となる可能性を示唆した。今後HCVレプリコン系を用いたHCV複製の効果の比較が必要である。<br />As inhibition of HCV replication is expected to reduce or even block incidence of HCV-associated hepatocellular carcinoma, HCV NS5B, aRNA-dependent RNA polymerase, might be a strong target for drug designs to inhibit HCV replication. The main results are followings. 1) 5 residues of NS5B were newly identified to be critical for RNA-dependent RNA synthesis (RdRP) activity. 2)Two residues among them located far from the RdRP catalytic center were specified to be indispensable ones for oligomerization of NS5B. The oligomerization of NS5B was found to be prerequisite to RdRP activity of NS5B by demonstrating that the two residues are residue-specific and exchangeable for oligomerization and RdRP activities. 3)Specific interaction between NS5A and NS5B was characterized, and we found that NS5A can modulate RdRP activity through the direct interaction in vitro. 4) Nucleolin, was found to bind directly to NS5B and affected subcellular localization of NS5B when the C-terminal membrane-attachment domain was truncated. These interaction surfaces of NS5B would be putative targets for drug designs to inhibit HCV replication.<br />研究課題/領域番号:12558084, 研究期間(年度):2000-2002<br />出典:「C型肝炎ウイルスの複製酵素と複製を標的とした阻害剤のデザイン開発」研究成果報告書 課題番号12558084 (KAKEN:科学研究費助成事業データベース(国立情報学研究所)) 本文データは著者版報告書より作成
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論文 |
村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
HCVの持続感染の遮断が肝がん発症のリスクを低下させると期待される。HCVは宿主とは異なるRNA複製過程があり、RNA複製酵素であるNS5BはHCV複製遮断の有力な標的である。HCV複製の阻止を目標に、HCV複製酵素NS5Bの構造と機能の検
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討と、NS5Bの宿主の炎症応答経路への影響の検討を行った。我々は、集約的な及び1残基のアラニン置換変異を系統的に導入し、NS5Bの諸機能を解析した。その結果1)NS5BのRNA依存RNA合成(RdRP)活性に必須である5アミノ酸残基を新たに特定した(Hepatology,in press)。2)NS5BのRdRP活性には、鋳型結合能は要求せず、鋳型/primer結合能を要求した。Y276が鋳型/primerに必須なアミノ酸残基として特定された。3)活性中心より離れたRdRP活性に必須2残基が、NS5Bのhomomericな相互作用に関わることを見い出し、各種の置換変異を用いてhomomericな作用がRdRP活性に必須で、この2残基は相互作用に直接関わる残基の可能性が強く示唆された。4)NS5Bの過剰発現系で炎症関連シス配列AP-1、NFkBの活性化を認めた。しかしアラニンスキャンでNS5Bの特定配列との相関が認められず、発現量によってNS5Bの転写活性化効果は変動した。NS5Bによる炎症関連遺伝子の修飾の可能性はあるが、感染時にHCVの他の蛋白が同時発現する条件で、NS5Bの微量発現が今回観察された効果が得られるか否かは今後の検討に残された。<br />Eradication of HCV has been expected to reduce or prevent incidence of HCC.HCV NS5B, RNA-dependent RNA polymerase(RdRP), is a target to inhibit HCV replication. We constructed a series of clustered and point alanine substitution mutations of NS5B and examined the effects of the mutations on functions of NS5B.The results are followings. 1)5 amino acid residues were newly identified to be indispensable for RdRP activity(Hepatology, in press). All are outside of the motifs conserved among RdRPs and reverse transcriptases. The result may provide desigins for specific inhibitors for HCV RdRP.2)RdRP activity of NS5B requires not template binding but template/primer. All mutants negative in the template binding are positive in RdRP activity except Y276A which is both negative in template/primer binding and RdRP activity. 3)The two residues apart from the catalytic center of RdRP activity are important for oligomerization of NS5B which we could find to be essential for RdRP activity. 4)Overexpression of NS5B activated AP-1 and NF-kB critical for acute inflammatory response, but a NS5B sequence could not be specified to be responsible for the activation which is influenced by expression level of NS5B.NS5B may modulate inflammatory responses but it remains addressed whether our observation has biological relevance in chronic HCV infection where a low amount of NS5B with coordinated expression of the other NS proteins is expected.<br />研究課題/領域番号:11694257, 研究期間(年度):1999-2000<br />出典:「C型肝炎ウイルス(HCV)NS5BのRNA合成活性と炎症応答の修飾」研究成果報告書 課題番号11694257(KAKEN:科学研究費助成事業データベース(国立情報学研究所)) 本文データは著者版報告書より作成
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