※一部利用できない機能があります
| 1.
論文 |
論文
|
村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
テロメラーゼは抗がん剤研究の有力な標的である。本年度、FLAG標識hTERT発現HeLa細胞のヒトテロメラーゼ複合体とhTERTと相互作用するヌクレオリンの生物的機能の解析(村上)、hTERT発現による不死化ヒト初代細胞系の解析(本多)、更
…
に細胞の増殖・分化などに重要な役割を担う受容体型チロシンキナーゼの解析(善岡)を行った。得られた主な結果は、1)HeLa細胞にFLAG-hTERTを導入して得られた活性型組み換え型テロメラーゼは、昆虫細胞系2成分発現ヒトテロメラーゼ複合体と類似して、分子篩法で2種類の複合体(IとII)に分画された。Hsp90を含まず、Hsp90阻害剤に耐性の複合体Iと、Hsp90を含む後者の複合体IIは、Hsp90阻害剤に感受性を示し内在性及びFLAG標識hTERTは共に不安定であった。また内因性hTERTとFLAG-hTERTの大半は複合体Iに分布した。ヌクレオリンが複合体Iに含まれ、複合体IIには殆ど含まれない。これらの結果は、細胞内で異なる2種類の活性型テロメラーゼ複合体が存在し、テロメラーゼの異なる局在或いは活性型テロメラーゼの異なる機能を示唆した。2)hTERT発現レトロウイルスベクターをヒト正常線維芽(BJ)細胞に感染させ、hTERT発現細胞が不死化した細胞株を樹立した。ジーンチップ解析では、hTERT導入不死化BJ細胞ではBJ細胞に比較し、細胞増殖、細胞周期に関与する因子の発現亢進が認められた。3)hTERTと特異的に相互作用するヌクレオリンは、C型肝炎ウイルス(HCV)複製に必須であることが、ヌクレオリン結合性を消失したHCV NS5B変異を持つHCVサブレプリコン系ではHCV複製が全く起きないことと、RNAi法でヌクレオリン発現が低下した細胞では、HCV複製が大きく低下する結果により示された。<br />Since telomerase activity is barely detectable in primary cells but clearly detected in cancerous cells, telomerase has been considered to be a strong candidate of the targets to cancer treatment In the fiscal year, we concentrated in several experiments including purification and characterization of recombinant human telomerase complex, and biological function of the specific interaction of nucleolin and hTERT recovered from a HeLa cell line stably expressing FLAG-hTERT (Murakami), analyses of human primary cells immortalized by hTERT (Honda), and the tyrosine kinases of receptor type which play critical odes in cell proliferation and differentiation (Yoshioka). The followings are the main conclusions of the experiments.1) The partially purified active telomerase complexes comprise two different complexities, complex I (around 680 kDa), and complex II (around 400 kDa), that are quite alike to those that can be recovered firm the insect cells co-expressing FLAG-hTERT and hTERC. The com plex I does not contain Hsp90 and is resistant to Hsp90 inhibitors, whereas complex II contains Hsp90 and is sensitive to Hsp90 inhibitors. Human TEAT in the complex II is rather unstable during incubation in vim and in ring. Such unstable property was not observed with the complex I. Since MG132, a specific proteasome inhibitor, but not MG133, a negative control, stabilized hTERT in the complex Z strongly suggesting that hTERT in the complex If is under degradation pathway under the control of proteasome. The two different complexities of human telomerase seem to imply two different entities of active telomerase in different subcellular localization or its different functions. 2) We have established a cell line of the human primary fibroblasts(BJ cells) stably expressing hTERT, and we compared expression profiles of RI cells and the KJ cells immortalized by MERE Some genes involving in cell cycle progression and cell proliferation were evidently expressed higher in the immortalized 131-hTERT than these in in the primary cells. 3) Nucleolin, one of the specific interacting partners of hTERT can bind to Hepatitis C Virus (HCV) NS5B, RNA-dependent RNA replication of HCV. We evaluated the role of the specific interaction of nucleolin and NS5B in HCV replication. The HCV subreplicon system has been applied for the address We found that the HCV subreplicons harboring alanine substitution mutations or mutation at the residue(s) either one of two critical sequences within NS5B both of which are necessary for the nucleolin-binding could not replicate at all in a transient HCV replication system in HepG2 ml/s., although the wild replicon could support efficient HCV. By introducing transiently RNAi of nucleolin, that down regulated expression of nucleolin by half to one third, reduced HCV evidently reduced HCV replication using the HCV subreplicon system. Taken together, the specific interaction of nucleolin and NS5B is critical for HCV replication.<br />研究課題/領域番号:17390091, 研究期間(年度):2005-2007<br />出典：「テロメラーゼの細胞内局在と活性制御」研究成果報告書 課題番号17390091 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
続きを見る
|
||||
| 2.
論文 |
論文
|
京, 哲 ; Kyo, Satoru
概要:
金沢大学大学院・医学系研究科<br />我々は細胞の不死化過程に関わるとされるテロメレースをターゲットにした遺伝子治療の戦略をたて、これを婦人科癌の遺伝子治療に応用することを試みた。まずテロメレースの構成成分であるhuman telomer
…
ase RNA(hTR)をターゲットとしてこれに対するantisense DNAを合成し、その5'端に2-5Adenylate(以下2-5A)を付加したキメラ合成DNAによる癌の遺伝子治療の基礎実験を試みた。2-5AはRNAse Lのactivatorであり、antisense sequenceによって会合したtarget RNAをRNAse Lの活性化により分解することが期待される。子宮頚癌細胞であるME180 cellに2-5A anti-hTRをlipofectionにより導入し、hTRの発現を観察したところ、hTRは25-48時間で効率的に分解された。さらにテロメレース活性もそれに引き続いて低下し、細胞増殖も抑制された。細胞増殖抑制の原因としてflow cytometryの解析によりアポトーシスが誘導されていることが判明した。現在アポトーシス誘導機構の解析を行うとともに、動物実験でのin vivoの効果についても検討中である。また我々はテロメレースの酵素活性を担うhuman telomerase reverse transcriptase(hTERT)のプロモーターをクローニングし、これが極めて癌特異性が高いことを報告してきたが、このプロモーターを様々なアポトーシス誘導遺伝子とともにベクターに組み込み、in vitroおよびin vivoでの癌増殖抑制効果を検討した結果、本プロモーターを組み込んだベクターが極めて癌特異性の高い治療用ベクターをなり得ることが確認された。<br />We established novel methods that inhibit telomerase activity in cancer cells using 2-5Adenylate-linked antisense DNA against human telomerase RNA component (hTR). This antisense DNA effectively blocked telomerase activity in cervical cancer ME180 cells. Growth of ME180 cells in vitro was significantly inhibited by the treatment with 2-5A anti-hTR. Surprisingly, inhibition of cell growth was observed in 24-48 hr after treatment, quite earlier than expected. Telomere length was not shortened in this short period. These findings suggest that blockade of telomerase led to cell growth inhibition via telomere-independent mechanisms. We confirmed that growth inhibition of cells by the treatment with 2-5A anti-hTR was due to induction of apoptosis. The further anaylsis of mechanisms how 2-5A anti-hTR induces apoptosis is on going.We also established novel vector system for cancer gene therapy. We previously cloned promoter of human telomerase reverse transcriptase (hTERT), which is highly specific to cancer cells. We thus used this promoter for cancer-specific gene expression in gene delivery system. Various apoptosis-inducible genes, such as caspase-8 and FADD, were combined with hTERT promoter and used as vectors for cancer gene therapy. Introduction of these vectors effectively induced apoptosis of cancer cells but of surrounding normal tissues.<br />研究課題/領域番号:13557138, 研究期間(年度):2001 – 2002<br />出典：「婦人科癌をターゲットにした新たな遺伝子治療の戦略」研究成果報告書 課題番号13557138（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-13557138/135571382002kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
続きを見る
|
||||
| 3.
論文 |
論文
|
京, 哲 ; Kyo, Satoru
概要:
金沢大学大学院・医学系研究科<br />血液中の微量癌細胞をテロメレース活性を示標に同定することを目的として実験を行った。上皮細胞特異的抗体を吸着させたビーズを用いて患者血液から採取した単核球分画より上皮細胞を選択的に濃縮回収した。この回収
…
物より細胞抽出液を得て、TRAP法によりテロメレース活性を測定した。予備実験として癌細胞株を血液5ccに様々な細胞数で混ぜ合わせ、同様の方法でテロメレース活性を測定したところ、血液5cc中に1000個の癌細胞が存在すれば検出可能な感度であった。なお正常ボランティア40名より得た検体のテロメレース活性も同時に測定し、これよりカットオフ値を設定したところ進行婦人科癌患者21例のうち4例にテロメレース活性陽性例を認めた。これらはいずれも3期あるいは4期の子宮癌および卵巣癌患者であった。さらにこれらの患者のうち2例は治療により腫瘍マーカーの陰性化を認めたが、治療後の血液細胞中のテロメレース活性もカットオフ値以下に減少し、病勢を反映している可能性が示唆された。今後さらに症例数を増やして検討して行く予定である。さらに子宮内膜細胞診材料よりテロメレース活性測定法(TRAP法)を用いて内膜癌細胞の検出も試み、感度80%以上の良好な診断率を得た。特に、細胞診陰性の見逃し例のなかに、TRAP法で陽性となる症例があり、細胞診との併用により診断率が向上することが期待される。<br />To examine the possibility of novel tumor markers, telomerase activity was measured by the TRAP assay using blood samples from patients with various gynecologic tumors. To purify the epithelial components in blood samples, beads-based method was used, in which blood cells were incubated with beads that were conjugated with specific anti-epithelial antigen. Approximately, 20% of patients exhibited telomerase activity in this method, all of them had advanced gynecologic tumors, such as cervical and ovarian cancers, while none of 40 normal healthy volunteers showed no telomerase activity. Interestingly, telomerase activity observed in these patients decreased after initial treatment, such as chemotherapy and radiotherapy, suggesting that it might reflect disease progression.We also examined the possibility of telomerase-based screening method for endometrial cancers using exfoliated endometrial scarping samples. We could achieved more than 80% of sensitivity to detect endometrial cancers using TRAP assay with endometrial scarping samples. Combination of this method with classical cytologic smear test may improve sensitivity and specificity to screen endometrial cancers.<br />研究課題/領域番号:13671702, 研究期間(年度):2001 – 2002<br />出典：「テロメレース活性を利用した婦人科癌の新たな遺伝子診断および遺伝子治療の開発」研究成果報告書 課題番号13671702（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-13671702/136717022002kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
続きを見る
|
||||
| 4.
論文 |
論文
|
京, 哲 ; Kyo, Satoru
概要:
金沢大学医学部・附属病院<br />テロメレースは染色体DNAの末端構造であるテロメアを伸長させる酵素で、ほとんど全ての癌においてテロメレースの活性化が知られている。これに対して正常細胞ではテロメレース活性は認められていない。よってテロメレ
…
ースの活性化は細胞の不死化や癌化に重要なステップであると考えられている。我々は癌特異的に認められるテロメレースの活性を利用して、これを癌の診断に応用することを目指し研究を進めてきた。特にテロメレースの活性中心であるhTERTの発現を同定することで、婦人科癌診断への応用が可能か否かについて検討した。テロメレーステロメレース活性を規定する因子であるhuman telomerase reverse transcriptase(hTERT)の発現は我々の研究により癌に特異的に認められ、テロメレース活性とも非常によく相関していた。RT-PCR法によるhTERT mRNAの検出は極めて高感度で、テロメレース活性を測定するのと同等以上に高い感受性および特異性を持ち、卵巣癌、内膜癌、子宮頚癌などで診断価値があることを見いだした。またスクリーニングの方法としても利用価値が高く、子宮頚部の擦過細胞からRNAを抽出してRT-PCRを施行し、hTERTの発現の有無を検討したところ、子宮頚部異形成にも一部に発現が認められ、子宮頚癌では高率に発現が確認された。我々はさらに子宮内膜細胞診においてもhTERT発現を検討し、通常の閉経後の正常人にはほとんど発現が認められないのに対し、内膜癌患者では80%以上に発現が認められ、内膜癌のスクリーニングにも有用であることを明らかにした。以上の結果よりテロメレース活性、特にhTERT mRNAの発現が新たな癌診断のためのマーカーとなり得ることが確認され、今後臨床応用に向けたさらなる研究が期待される。<br />Telomerase is a cellular reverse transcriptase which catalyzes the synthesis and extension of telomeric DNA.This enzyme is specifically activated in most malignant tumors, but is usually inactive in normal somatic cells, and within which telomeres therefore progressively shorten with cell division. A mechanism to maintain telomere stability is required for the cells to overcome replicative senescence, and telomerase activation may therefore be a rate-limiting or critical step in cellular immortality and oncogenesis. Human telomerase reverse transcriptase (hTERT) is a catalytic subunit protein of telomerase and is a critical determinant of its enzymatic activity.In the present study, we examined the utility of detecting telomerase activity and hTERT mRNA expression for the diagnosis and screening of gynecologyc tumors. We found that most gynecologic cancers express telomerase activity while the corresponding normal tissues do not. Cervical and endometrial exfoliated cells were collected from the patients with or without cervical or endometrial lesions and telomerase activity and hTERT mRNA expression were detected by the TRAP assays or RT-PCR assays. Approximately 90% of the patients with cervical or endometrial cancer were positive for telomerase activity or hTERT mRNA expression, while less than 10% of those without any lesions were so. 50 to 60% of the patients with premalignant lesions, such as suqamous intraepithelial lesions (SIL) expressed telomerase activity or hTERT mRNA.These findings suggest that detection of telomerase activity or hTERT mRNA expression may be an useful tool for cancer diagnosis and screening.<br />研究課題/領域番号:11671604, 研究期間(年度):1999 – 2000<br />出典：「テロメレース活性および活性中にサブュニットの検出による婦人科癌診断への応用」研究成果報告書 課題番号11671604（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11671604/ ）を加工して作成
続きを見る
|
