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論文 |
論文
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榎並, 正芳 ; Enami, Masayoshi
概要:
NS1蛋白に欠損を持つ遺伝子組み換えウイルスを作成し感染細胞で解析した。dl12は、N端付近の12残基を欠失するが、温度感受性となり感染後期にすべてのウイルス蛋白の翻訳が特異的に阻害された。N110はC端側52%を欠失するが、後期蛋白の翻訳
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だけが特異的に阻害された。N110のNS1は核外輸送に欠損を持っていた。WSN株NS1蛋白に加え、N端110残基(N110)、C端190残基(C190)、及び66-77残基目の欠損(d112)蛋白を大腸菌で発現・単離した。NS1蛋郷はA,、C-、及びG-キナーゼを用いてリン酸化した。ウサギ網状赤血球ライセートにウイルス感染細胞から精製したmRNAを添加、in vitroの翻訳に於けるNS1蛋白の機能を解析した。wt-NS1はin vitro翻訳系でNPとM1の翻訳を強く促進し、NS1の翻訳は弱く促進した。いずれのキナーゼもNS1蛋白をリン酸化したが、リン酸化により翻訳促進活性は有意に増加した。N110-NS1蛋白はin vitroで翻訳を促進し、C190-NS1蛋白は翻訳促進活性が欠損していた。NS1のN端側131残基及び151残基の下流に自己切断活性を持つ17残基の2Aプロテアーゼ配列を挟んでCAT遺伝子を挿入したNS2ACATウイルスを作成した[NS(131)2ACAT及びNS(151)CAT]。NS(131)2ACATウイルスは非温度感受性で、NS(151)CATウィルスは温度感受性となり、マウスに対して高度に弱毒化された。感染細胞内ではNS1とCATの融合蛋白を発現した後、直ちに自己切断され成熟型蛋白となった。感染24時間後にはCAT蛋白の50%が培養上精中に検出された。マウス肺ではウイルスの僅かな複製とCATの発現が確認され、血中1gG抗体価の僅かな上昇が見られた。当該ウイルス感染マウスは、致死量のWSNウイルス感染に対し完全に感染防御がみられた。<br />Influenza virus NS1 protein stimulates translation of some viral proteins in vivo, Interaction among the NS1 protein, host translational initiation factors, and 5'-UTR of viral mRNA may be involved in this regulation. The NS1 protein is a phosphoprotein, however, it is not clear whether the phosphorylation is required for this activity.We have obtained some NS1 mutant viruses using our reverse genetic system. Characterization pf these viruses indicated that dl12, which deletes 12 residues near N terminus of the NS1 protein, showed temperature-sensitive phenotype and the translation of all viral proteins was interfered. N110 virus, which deletes 52% of the C-terminus of the NS1 protein, has defect in the translation of the late viral proteins. We have also analyzed the phosphorylation in the virus-infected cells by using several protein kinase inhibitors. However the phoshorylation of the NS1 protein was not significantly interfered in that system.We have then analyzed the phosphorylati on of the NS1 protein in vitro using purified A-, C-, or G-kinases. The NS1 protein was obtained by expression from plasmid DNA in E. coli and followed by affinity purification. Translational regulation by the NS1 protein was analyzed using rabbit reticulocyte lysate system in vitro. In this experiment, mRNAs were purified from WSN virus-infected MDBK cells. The NS1 protein was phosphorylated by either A-, C-, or G-kinases in vitro. Unphosphorylated NS1 protein was shown to stimulate the translation of the M1 and NP proteins. In addition, phosphorylation of the NS1 protein significantly stimulated this activity, indicating that the phosphorylation of the NS1 is not essential but important for the regulation. Relatively lower effect was observed for the translation of the NS1 using this system. We have then analyzed the NS1 mutants. The N110 NS1 was shown to stimulate the translation in vitro. C190 NS1, which deletes N-terminal 40 residues, has defect in that activity. These data together indicates that N-terminal110 residues has the functional domain enough for this activity.<br />研究課題/領域番号:10470075, 研究期間(年度):1998-2001<br />出典：「インフルエンザウイルスNS1、NS2蛋白のウイルス工学的、細胞生物学的研究」研究成果報告書 課題番号10470075(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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榎並, 正芳 ; Enami, Masayoshi
概要:
1)インフルエンザウイルスNA分節に、IRESを介在配列として約100-1800bpの種々の外来遺伝子を導入したウイルスの回収を試みた。短い遺伝子は安定に導入されたが、発現は極めて低かった。最も長い遺伝子として麻疹HA遺伝子を導入したウイル
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スを回収したが、HA遺伝子の約70%を欠失していた。既存の技術を用いたインフルエンザベクター系には発現レベルと安定性に問題のあることが判明した。2)そこで、インフルエンザゲノム中最もサイズが小さく遺伝子発現レベルの高いNSゲノムを当面の標的とし、新たな遺伝子組換え技術の開発を行った。ウイルス粒子から単離したRNPをNSのcDNA存在下RNaseHで処理し、NSのcDNAから試験管内で再構成したRNPと共に細胞に導入することにより様々な変異ウイルスを回収した。NLS2(核移行シグナル2)及びエフェクタードメインを含むC端側半分を削除すると、ウイルスは弱毒化した。N端側半分に12残基の欠失を持つウイルスは温度感受性となった。ウイルス弱毒化のプロトコールが得られた。次に、CAT遺伝子をNSゲノムへ2Aプロテアーゼ配列を介在配列として導入し、ウイルスを回収した。3)サブジェノミックRNAの非コード領域に、ゲノム特異的認識シグナルの存在が確認された。今後サブジェノミック型ベクター開発にはこの領域への変異導入が必要である。4)インフルエンザウイルスRNA転写・複製を促進する宿主因子RAFを同定した。今後、大量発現のヘルパー細胞としてRAFの過剰発現が利用可能と思われる。<br />1) We have isolated and analyzed viruses containing foreign genes (100-1800bp) in the NA genome. Short inserts were stable but the expression was low. Insertion of the measles virus H gene lead to 70% deletion of the insert. Therefore, previously described protocol was shown to be insufficient for practical use.2) Then we have developed a novel protocol to isolate influenza transfectant containing mutations in the NS genome. The RNP,which was isolated from influenza virion, was treated with RNase H in the presence of NS cDNA.This was co-transfected to the cells together with in vitro-reconstituted NS RNPs. We successfully isolated several mutants in which deletion of the C-terminal half of the NS1 protein attenuated the virus. The deletion of 12 residues in the N-terminal half read to the temperature-sensitive phenotype. This would be good protocol to generate live attenuate vaccine.3) It was shown that noncoding region of the genome may contain segment-specific regulatory signals.4) A host factor was isolated which stimulates influenza virus RNA transcription and replication. This factor may be useful for efficient expression of proteins from the virus genome in the future.<br />研究課題/領域番号:07557215, 研究期間(年度):1995-1996<br />出典：「インフルエンザウイルスを用いた多目的ベクターの開発と実用化」研究成果報告書 課題番号07557215 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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