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篁, 俊成
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Aslam, Abu F. M. ; Kiya, Taketoshi ; Mita, Kazuei ; Iwami, Masafumi
概要:
Insulin family peptide members play key roles in regulating growth, metabolism, and reproduction. Bombyxin is an insulin
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-related peptide of the silkmoth Bombyx mori. We analyzed the full genome of B. mori and identified five novel bombyxin families, V to Z. We characterized the genomic organization and chromosomal location of the novel bombyxin family genes. In contrast to previously identified bombyxin genes, bombyxin-V and -Z genes had intervening introns at almost the same positions as vertebrate insulin genes. We performed reverse transcription-polymerase chain reaction and in situ hybridization in different tissues and developmental stages to observe their temporal and spatial expression patterns. The newly identified bombyxin genes were expressed in diverse tissues: bombyxin-V, -W, and -Y mRNAs were expressed in the brain and bombyxin-X mRNA in fat bodies. Bombyxin-Y gene was expressed in both brain and ovary of larval stages. High level of bombyxin-Z gene expression in the follicular cells may suggest its function in reproduction. The presence of a short C-peptide domain and an extended A chain domain, and high expression of bombyxin-X gene in the fat body cells during non-feeding stages suggest its insulin-like growth factor-like function. These results suggest that the bombyxin genes originated from a common ancestral gene, similar to the vertebrate insulin gene, and evolved into a diverse gene family with multiple functions. © 2011 Zoological Society of Japan.
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原田, 真市 ; Harada, Shinichi
概要:
低周波交流磁界が生体、特に神経系にどのような影響を及ぼすかを調べるためモデル動物である線虫C.elegansを用いて磁界曝露による遺伝子発現レベルの変化と行動解析を行った。C.elegansに対して0.5Tの磁界を2時間暴露後、RNAを抽出
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し、前年度行ったマイクロアレイによる包括的なスクリーニングから発現に差があると見られる神経系遺伝子を抽出し、再現性の高いRT-PCRによる磁界曝露、非磁界曝露でのRNA発現量を比較した。マイクロアレイの結果、神経系関連遺伝子の多くはCa^<2+>に関連しており中でもカルモジュリンキナーゼIIをコードするunc-43遺伝子は磁界曝露により2.7倍の発現減少が認められ、RT-PCRの結果では2.35倍の減少を認めた。このことからCa^<2+>濃度を制御するカルモジュリン経路関連遺伝子(ckk-1(CaMKK), crh-1(CREB), cmk-1(CaMKIV), tax-6,cnb-1(Calcineurin)及びitr-1(IP3R))についてRT-PCRにより磁界曝露による遺伝子発現を検討した結果、unc-43,itr-1,cnb-1及びtax-6遺伝子は優位にRNAの発現が減少(P<0.01)したが、その他のckk-1,cmk-1及びcrh-1も減少傾向にあった。磁界曝露による行動解析には、線虫C.elegansの化学物質に対する誘引・忌避行動を指標とした解析により影響を評価した。誘引物質であるDiacetyl、忌避物質であるCuSO_4を培地上の一端に置き、それぞれの物質への到達率をカウントしたところ磁界曝露によりDiacetylへの到達率が減少し、またCuSO_4に対する突破率が増加した。このことから磁界はある特定の神経細胞に働き、Ca^<2+>濃度の変化を惹起させ遺伝子発現レベルを変化させることで行動に異常をもたらした可能性が示唆された。<br />The biological effect of extremely low frequency magnetic fields (ELFMFS) remains controversial. Some epidemiological studies have indicated positive correlations between magnetic fields and various types of cancer or other disease, including neurological disorders. To clarify the biological effects of ELFMFs, we performed the screening of ELFMFS-responding genes by using microarray technique in nematode C. elegans, as a model organism, and carried out the RT-PCR analysis not only the genes with significant difference identified by microarray, but also the associative and relative genes with possibility of ELFMFs-responding genes. Moreover, we investigated chemotactic response to either diacetyl or CuSO_4 after ELFMFs exposing.unc-43, one of the identified genes, is known to function as calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), that mediates Ca^<2+> signal transmission in the nervous system of C. elegans. We found that unc-43 mRNA was down-regulated (2.4-fold) under ELFMFs exposure by RT-PCR. Another related genes, tax-6 (Calcineurin), itr-1 (IP3R) and cnb-1 (Calcineurin) in Ca^<2+>-Calmodulin (CaM) pathway were significantly down-regulated, respectively. ckk-1 (CaMKK), crh-1 (CREB) and cmk-1 (CaMKIV) showed no significant decrease (P<0.1), though these genes were reported to be functioning in the CaM pathway,.In behavioral analysis, chemotaxis index to diacetyl decreased, also chemotaxis index to CuSO_4 was shown weakly defective in avoidance when exposed with ELFMFs.These results suggest that the ELFMFs exposure caused the expression changes of neuronal specific genes which are associated with a part of calcium signal cascades, and has affected spontaneous locomotoion in C. elegans.<br />研究課題/領域番号:13555218, 研究期間(年度):2005-2006<br />出典：「神経系における低周波交流磁界刺激感受メカニズムの解明」研究成果報告書 課題番号13555218 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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加藤, 聖 ; Katoa, Satoru
概要:
金魚の視神経は哺乳類と異なり再生し、4〜6ヵ月で視覚機能も完全に回復する。この長い再生過程(4〜6ヵ月)で働く分子を同定しその機能を追求することはきわめて重要である。本研究では特に視神経切断後早期に切断端からの再生神経線維の伸長に働く分子の
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同定を目指した。視神経切断後5日目の網膜からmRNAを抽出しcDNAを合成しcDNAライブラリーを作製した。ディファレンシャルハイブリ法で対照(無処置)と比べて視神経切断5日目に発現が増加(upregulation)するcDNAクローンをスクリーニングした。そのクローンの塩基配列を決定しDNA data baseの検索から、トランスグルタミネース(TG)やNa, K-ATPase α 3サブユニットをコードする遺伝子が捕捉された。ISH法や免疫組織化学法によりTGやNa, K-ATPase α 3の視神経切断後の経時変化を調べた所、網膜神経節細胞にのみ切断早期に発現が上昇し、Na, K-ATPase α 3は10日目、TGは20日でピークとなりその後徐々に対照群のそれに復した。また、成熟金魚の視神経をあらかじめ切っておき(5〜7日前)、網膜片を作製し培養すると神経節細胞から神経突起が伸長(神経再生のin vitro系の確立)する。この培養系にTG抗体やNa, K-ATPase α 3の特異的阻害剤ウアバインを添加すると、神経突起の伸長が完全に抑えられた。このことからTGやNa, K-ATPase α 3は視神経再生初期の再生線維の伸長に重要な役割を果たしていることがわかる。今後この遺伝子クローニング法を駆使して再生各時期に働く遺伝子を見つけたいと思っている。また、遺伝子改変動物を作製し、その遺伝子の機能も明らかにしたい。<br />The goldfish optic nerve can regenerate after injury. Regrowth of optic nerve fibers starts to extend 7-10 days after optic nerve transection. They arrive at the optic tectum 3-5 weeks after axtfomy. Finally, visual function is restored 4-6 months after optic nerve transection. To understand the molecular mechanism of optic nerve regeneration, we identified genes whose expression is specifically upregulated during the early stage of optic nerve regeneration. A cDNA library constructed from goldfish retina 5 days after transection was screened Two clones were identified as the Na, K-ATPase catalytic subunitalpha 3 isoform and the neural type of transglutaminase (TG) by sequence analysis. In northern hybridization, the expression level of the both mRNAs was significantly increased at 2 days and peaked at 5-10 days, and then gradually decreased and returned to control level by 45-60 days after optic nerve transection. In situ hybridization have revealed the location of this transient retinal change after axotomy. The increased expression was observed only in the ganglion cell layer at 10-20 days after optic nerve transection, The cDNA of TG was inserted into the plasmid DNA and thus a fused protein of TG (ca. 70kDa) was obtained. Antiserum against the recombinant TG was made by immunization. Immunohistochemical staining further confirmed the data of in situ hybridization. In an explant culture system, neurite outgrowth fkm the retina 7 days after optic nerve transection was spontaneously promoted. A low concentration of ouabain (an inhibitor of Na,K ATPase alpha 3 subunit) or neutral antibody against TG, completely blocked the spontaneous neurite outgrowth from the lesioned retina. Together, these data indicate that upregulation of the Na, K-ATPase alpha 3 subunit or TG is involved in the regrowth of ganglion cell axons after axotomy. Such molecular techniques will become useful tool for future genetic studies of nerve regeneration.<br />研究課題/領域番号:12680750, 研究期間(年度):2000–2001<br />出典：「トランスグルタミナーゼの神経系における役割りについて: 神経再生の分子機序解明」研究成果報告書 課題番号12680750 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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岩見, 雅史 ; Iwami, masafumi
概要:
昆虫の発生において、エクジソンは各組織で特異的な遺伝子発現を誘導させ、結果的に脱皮・変態を促す。一方、脳はエクジソンの合成・分泌を刺激する前胸腺刺激ホルモン(PTTH)を分泌し、最上位で昆虫の発生を支配している。脳では同時に、エクジソンに応
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答して様々な遺伝子が発現し、幼虫型から蛹型、成虫型へと形態的にもダイナミックな再構築が行われる。従って、脳におけるエクジソン応答遺伝子は、脳の再構築や内分泌系を介した後胚発生の制御に関与していることが示唆され、これらの解析により昆虫の後胚発生を司る分子メカニズムの解明が期待される。本研究では、カイコガ遺伝子の約80%を網羅したマイクロアレイ及びサブトラクションライブラリーによるエクジソン応答遺伝子の網羅的発現解析を行った。マイクロアレイでは、体内エクジソン濃度の低い5齢2日幼虫を用いて、エクジソン投与後2時間のサンプルとコントロールとしてリンガーを投与したサンプル間で全RNAを比較し、データを得た。加えて、エクジソンは、エクジソン受容体(EcR)及びUSPを介して、遺伝子の転写を直接誘導することから、EcRのisoformの一つEcR-A遺伝子のエクジソン応答性と脳内発現細胞の同定を試みた。マイクロアレイより、エクジソンにより発現が誘導される93の遺伝子、発現が抑制される97遺伝子を、サブトラクションライブラリーより7遺伝子を同定した。これら遺伝子の内、約30について発現細胞を同定したところ、ほとんどの遺伝子がPTTH産生細胞でのみ発現が見られた。一方、EcR-A遺伝子の脳内における発現細胞もPTTH産生細胞のみであった。エクジソン応答遺伝子のほとんどが、PTTH産生細胞でのみ発現していることは、PTTH産生細胞が昆虫の変態において、脳の機能と形態の制御機構を支配する細胞、すなわち、"master cells"の役割を担っていることを示唆している。<br />The steroid hormone, 20-hydroxyecdysone (20E), triggers the major developmental transitions of insects including molting and metamorphosis. 20E regulates target genes directly through the receptor and executes development. The dynamic morphological changes of the brain during metamorphosis such as the formation of optic lobes are also caused by 20E action. In the silkworm Bombyx mori, the 20E level is controlled by the prothoracicotropic hormone (PTTH) and PTTH is produced by the two pairs of lateral neurosecretory cells in the brain. Beside PTTH, the brain produces peptide hormones necessary for metamorphosis. The insect brain is thus the center of insect developmental control and the 20E action in the brain governs the post-embryonic development including the morphological change of the brain itself. However, the genomic response to 20E in the brain during metamorphosis has not been identified systematically.We therefore performed comprehensive expression analysis of the 20E-responsive genes of Bombyx brain with a microarray on which over 80% of total Bombyx genes are arranged and with a 20E-inducible cDNA library. We focused on the direct genomic response by 20E during metamorphosis and have identified 93 up-regulated and 97 down-regulated genes from the microarray and at least 7 genes from the cDNA library. In situ hybridization showed that major expression site of these genes characterized is at the PTTH-producing cells (PTPCs). One of the ecdysone receptor complex genes, EcR-A is also up-regulated by 20E and their mRNAs were detected exclusively in PTPCs in the larval brain. This result indicates that PTPCs are the major 20E-responsive cells in the larval brain and suggests that PTPCs are the master cells of insect metamorphosis.<br />研究課題/領域番号:15580039, 研究期間(年度):2003-2005<br />出典：「ステロイドホルモンによる脳の機能と形態の制御機構」研究成果報告書 課題番号15580039 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
本研究においては薬物の消化管吸収性促進を目的とし、小腸上皮細胞に備わるトランスポーターならびに膜動輸送機構に関する研究を行った。その結果、モノカルボン酸輸送については、アニオン交換輸送体として働く分子的実体の一つとしてAE2やMCT1が安息
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香酸やサリチル酸などのモノカルボン酸系化合物の消化管吸収に働いていることがわかった。即ち、pH依存的なモノカルボン酸輸送系としてMCT1やAE2が重要な役割を果たしていることが示唆され、モノカルボン酸系化合物の小腸上皮細胞膜輸送におけるトランスポーターの重要性が明らかとなった。一方、ペプチドトランスポーターPepT1については抗ウイルス薬アシクロビルのバリンエステル体がその基質となることを明らかにした。本結果はPepT1の基質認識に対してペプチド結合が必須でないことを示す新しいPepT1の機能特性を提示するものである。また、パーキンソン病治療薬L-dopaのペプチド誘導体を合成し、その吸収性促進効果について検討を行った結果、L-dopaがアミノ酸輸送系を介して吸収されるよりも誘導体がペプチド輸送系を介して膜透過されるほうがより高い吸収性が期待できることが示された。以上の成果は、PepT1の機能ならびに経口デリバリーへの応用性について新たな知見を与えるものである。さらに分子サイズの大きなペプチドの経口デリバリー法の樹立を目的とし、小腸における吸着介在型エンドサイトーシス機構について検討をした。その結果、小腸には塩基性ペプチドを幅広く取り込むエンドサイトーシス機構が備わっていることを明らかにできた。以上、本研究成果は、消化管に備わるトランスポーターあるいは膜動輸送機構が薬物の消化管吸収に機能することを実証するものであり、またそのような膜輸送機構が薬物の消化管吸収性を制御する手法として有用であることを示すものである。<br />In the present study, identification and functional significance of intestinal transporters in the drug absorption were studied. The obtained results are as follows :1. Monocarboxylic acids have been thought to be absorbed by passive diffusion mechanism according to pH-partition theory. However, in the present study, two transporters that are present at the intestinal epithelial cells and accept monocarboxylic acids as the substrates were identified. MCT1 is a proton-cotransporter for monocarboxylic acids such as lactic acid and pyruvic acid. However, when MCT1 was stably transfected to MDA-MB231 cells, it exhibited transport activity for acidic drugs such as benzoic acid and salicylic acid In addition, anion antiporter AE2 also transported such monocarboxylic acids. Furthermore, immunohistochemical analysis demonstrated the presence of MCT1 at the brush-border membrane as well as basolateral membrane. These results suggest that monocarboxylic acid drugs are absorbed via specific trans porters and will be useful for the enhancement of intestinal absorption of acidic drugs by utilization of these transporters.2. Peptide transporter, PepT1 is present at the brush-border membrane of intestinal epithelial cells and mediates absorption of various di- and tri-peptides in a pH-dependent manner. L-dopa, which has low bioavailability, was derivated to dipeptide and the mechanism of intestinal absorption was examined. L-dopa-L-phe, a peptide-derivative of L-dopa, showed significantly higher permeability than that of L-dopa across the intestinal epithelial monolayers and the permeability was significantly decreased in the presence of high concentration of native dipeptides. So, peptide-derivation is expected to be useful for the increased intestinal absorption by utilizing peptide transporter PepT1.These lines of studies provide new insight of the significance of membrane transporters and new strategy to control intestinal absorption of drugs by utilizing the transporters in the intestinal epithelial cells.<br />研究課題/領域番号:10557214, 研究期間(年度):1998-1999<br />出典：「小腸上皮トランスポーター遺伝子発現系による経口薬物スクリーニングシステムの開発」研究成果報告書 課題番号10557214 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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金子, 周一 ; Kaneko, Shuichi
概要:
研究成果は目的に応じて、1.肝臓病における包括的発現遺伝子データベース作成、2.従来から知られている肝臓病の解析、3.新たな解析法、診断・治療法の開発、4.従来は肝臓病と考えられていなかった肝臓異常の検出、の4点に分類し以下に簡潔に記入した
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。1.肝臓病における包括的発現遺伝子データベース作成肝臓における包括的発現遺伝子情報と臨床情報をデータベース化した。世界最大となる正確で系統的な各種肝臓病のヒト肝臓における発現遺伝子データベースを構築した。2.従来から知られている肝臓病の解析解析情報を用いて慢性肝炎など従来から肝臓病として知られる疾患の研究を行った。B型およびC型慢性肝炎、自己免疫性肝炎および原発性胆汁性肝硬変、肝癌を解析し発現遺伝子情報を用いることによって包括的発現遺伝子情報からみた疾病の診断および病態解析だけでなく、従来の研究手法で解決できなかった重要な問題点を解決した。3.新たな解析法、診断・治療法の開発#1を用いることによってヒトにおいても染色体に臓器特異的な発現遺伝子の集積領域があること、これを用いることによって新規肝臓発現遺伝子の探索が可能であることを示した。病態解析だけでなく肝臓疾患の治療方針の決定にもgenomics技術が有用であることを示し、この業績によって平成16年度の産学官連携功労者文部科学大臣賞を受賞した。4.従来は肝臓病と考えられなかった肝臓異常の検出軽度の異常あるいは従来は正常と診断されていた肝臓の解析を行った。糖尿病および肥満を有する症例の肝臓における包括的発現遺伝子は対照群と大きくことなること、それらの異常が各種の代謝異常と密接に関連し、さらには全身の動脈硬化病変の進行にも密接に関係する可能性を示した。<br />Results are summarized according to the four objects of this study.1.Construction of comprehensive gene expression profile database of liver diseases.Data base of gene expression profile of liver diseases were constructed with the clinical information, which is the biggest human liver database in the world.2.Analysis of liver diseases.Comprehensive analysis of gene expression of samples from chronic hepatitis B and C, autoimmune hepatitis, primary biliary cirrhosis, hepatocellular carcinoma were performed using serial analysis of gene expression (SAGE) and DNA chips, and demonstrated new findings on the diagnosis and understanding of the pathogenesis of those diseases.3.Development of new methods for the analysis, diagnosis, and treatment of liver diseases.Tissue specific region was found in the human chromosome by using the database #1. This method enables the discovery of tissue specific gene in the chromosomal region. The efficacy of treatment for liver disease was successfully predicted by the comprehensive gene expression analysis.4.Detection of hepatic abnormality, which is not considered as important diseases.Expression profile of diabetic liver with or without obesity was comprehensively analyzed. Gene expression in the diabetic liver was clearly different from that in non-diabetic liver. Furthermore, genes relating with angiogenesis were up-regulating in the liver, indicating that diabetic liver is directly relating with systemic complication including atherosclerosis.<br />研究課題/領域番号:13854015, 研究期間(年度):2001-2005<br />出典：「Genomics技術による新しい肝臓病学の確立」研究成果報告書 課題番号13854015 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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広瀬, 豊 ; Hirose, Yutaka
概要:
金沢大学がん研究所<br />真核生物RNAポリメラーゼII(RNAP II)最大サブユニットC-末端領域(CTD)は、種々のCTDキナーゼによってリン酸化されることによって、mRNA前駆体の転写とプロセシングおよび両者のカップリングの制御
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に関わっている。私は、CTDリン酸化による遺伝子発現調節の分子機構にアプローチするために、リン酸化に依存してCTDに結合するヒト新規因子を同定しその機能検索を行っている。本研究は、リン酸化CTD結合因子として新規に同定したヒト核蛋白質PCIF1の生物機能を、高頻度相同組み換えを起こすことが知られているトリB細胞株DT40を用いたジーンノックアウト、および組換えタンパク質を用いた生化学的解析によって検索することを目的としており、解析の成果および中間結果を以下に報告する。(1)トリPCIF1遺伝子のホモノックアウトDT40細胞株、およびテトラサイクリン添加によってPCIF1の発現をオフにできるコンディショナルノックアウトDT40細胞株を樹立した。(2)PCIF1ノックアウトDT40細胞を用い、PCIF1非存在下に於ける細胞増殖能、細胞全体のRNAP IIのリン酸化とヒストンH3のメチル化の程度、および熱ショック下における熱ショックタンパク質(HSP)遺伝子の発現誘導能の変化を解析した。その結果、PCIF1は細胞の増殖に必須なタンパク質でないことが示唆され、PCIF1ノックアウトによる細胞全体のRNAP IIのリン酸化およびヒストンH3のメチル化の程度、更にHSP mRNAの発現誘導に対する影響は見出されなかった。(3)トリPCIF1の発現減少・消失に伴って、細胞周期調節に関わるペプチジルイソメラーゼPin1の発現の亢進が観察された。(4)PCIF1発現・精製のための組換えバキュロウイルスを作製した。またTAPタグを持つ外来性PCIF1を発現誘導出来るヒト安定細胞株を樹立した。<br />Phosphorylation of the carboxy-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II largest subunit has important roles both in transcription and in coupling transcription to pre-mRNA processing. To better understand the molecular mechanism in which transcription coordinates with pre-mRNA processing, I have identified and characterized human factors that can directly interact with the phosphorylated CTD (pCTD).Recently I reported a novel human protein PCIF1 as a pCTD interacting factor. To investigate cellular functions of PCIF1, I disrupted the PCIF1 gene in the chicken B-cell line DT4O. I have established two independent mutant DT40 cell lines in which all three copies of PCIF1 gene are disrupted by homologous recombination. One clone is a homozygous PCIF1-null mutant and the other is a conditional knock out cell line in which PCIF1 protein is expressed from a chicken PCIF1 cDNA under control of a tetracycline-repressible promoter.Addition of doxycyclineto the cells results in depletion of PCIF1 protein within several days but not in growth defect. Thus, chicken PCIF1 is not essential for cell growth. Depletion of PC1FI in DT40 cells did not significantly affect neither the phosphorylation status of the CTD nor the methylation status of the histone H3 N-terminus region.PCIF1-deficient cells exhibited normal heat shock-response, as measured by inducible expression of heat shock genes.<br />研究課題/領域番号:14580682, 研究期間(年度):2002 – 2003<br />出典：「新規リン酸化RNAポリメラーゼII結合蛋白質の機能解析」研究成果報告書 課題番号14580682（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-14580682/145806822003kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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広瀬, 豊 ; Hirose, Yutaka
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />RNAポリメラーゼII(Pol II)最大サブユニットのカルボキシル末端領域(CTD)には、特徴的な7アミノ酸配列(Y-S-P-T-S-P-S)の繰り返しが存在している。CTDはリン酸化を受けることによ
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ってmRNAプロセシング因子と特異的に結合し、転写過程のみならず転写後のmRNA成熟過程にも重要な役割を担っていることが近年明らかになってきている。私は、転写過程とmRNAプロセシング過程を協調させている分子メカニズムの解明にアプローチするために、リン酸化CTDに結合する新規蛋白質の同定と機能検索を行っている。これまでにヒト新規蛋白質PCIF1および細胞周期調節関連蛋白質Pin1が、これらの蛋白質中に共通して存在しているWWドメインを介してリン酸化CTDと特異的に結合することを見出している。本研究において、これらの蛋白質の構造と機能を更に解析し以下のような知見を得た。(1)免疫組織学的観察およびヒト培養細胞抽出物に対する免疫沈降法による解析は、PCIF1とリン酸化Pol IIとの細胞内における会合を示唆した。(2)検査した全てのヒト組織においてPCIF1 mRNAの様な発現を検出した。(3)PCIF1およびPin1のヒト培養細胞に於ける過剰発現は、レポーター遺伝子発現のトランス活性化をそれらの発現量に依存して強く抑制した。(4)PCF1及びPin1の細胞内ターゲットを、酵母two-hybrid法及びGST-pull down法によって検索し、遺伝子発現に関わる数種の核内因子を候補として得た。リン酸化基質特異抗体を用いたスクリーニングから、PCIF1がPin1と同様にリン酸化蛋白質を標的にしていることが示唆された。(5)リン酸化CTDペプチドを用いた結合実験に於いて、PCIF1のWWドメインはCTD7アミノ酸配列中5番目のセリンのみがリン酸化したCTDペプチドに対し2番目のセリンのみがリン酸化したものに比べより強いアフィニティーを示したが、Pin1のWWドメインは両者を区別しなかった。<br />The carboxy-terminal domain (CTD) of RNA pqlymerase n (Pol II) largest subunit is consist of multiple repeats of 7 amino acids peptide (Y-S-P-T-S-P-S). Phosphorylation of the CTD has been suggested as an important signal for recruitment of pre-mRNA processing factors to transcription sites to coordinate each step of mRNA synthesis. To approach to the molecular mechanism in which transcription couples with pre-mRNA processing, I have identified and characterized novel human factors that can directly bind to the phosphorylated CTD (P-CTD). One such protein is novel and named as PCIF1. The other is Pin1, which has been implicated in cell cycle regulation. The WW domain in PCIF1 and Pin1 was responsible for the specific interaction with P-CTD. In this research, I got following findings. (1) PCIF1 mRNA was ubiquitously expressed among various human tissues. (2) Transiently expressed recombinant PCIF1 was co-immunoprecipitated with endogenous hyperphosphorylated Pol II (Pol IIO) from human cell extracts. Confocal microscopic analysis showed association of PCIF1 with Pol IIO. (3) Overexpression of PCIF1 or Pin1 in human cultured cells could strongly repress trans-activation of the reporter gene expression driven by various transcription activation domains. (4) Several nuclear factors involving in gene expression were identified as targets of PCIF1 and Pin1 in yeast two-hybrid screening and GST pull-down experiments from human cell extracts. PCIF1 WW domain could bind several human proteins recognized by a phosphorylated substrate specific antibody. (5) PCIF1 WW domain could preferentially bind to a CTD peptide phosphorylated at only Ser 5 position against a CTD peptide phosphorylated at only Ser 2 position. In contrast, Pin1 WW exhibited same affinity to botji CTD peptides.<br />研究課題/領域番号:12680672, 研究期間(年度):2000 – 2001<br />出典：「RNAポリメラーゼIIのリン酸化CTDに結合する新規蛋白質の機能解析」研究成果報告書 課題番号12680672（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12680672/ ）を加工して作成
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西條, 清史 ; Saijoh, Kiyoshi
概要:
中枢神経の特定の核に局在する蛋白がなぜその核に局在するのか,或いはどのような条件下で局在が起こるのかを検索した。アデノシン受容体サブタイプのうちA2Aが上丘に局在することで視覚入カを増強する形で制御されていること,近年中枢神経の生存促進因子
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であることが報告されたセレノプロテインPの遺伝子構造を解析し,発現調節に重金属関連転写因子や,インターフェロン関連転写因子を始めとする炎症関連因子が関わっていること,実験的近視眼では近視進展にともない一酸化窒素合成酵素mRNAの特定のサブタイプにのみ発現抑制が観察されること,神経組織以外でも線維芽細胞が骨芽細胞化することで硫酸トランスポーターに遺伝子発現の変化が生じることや被虐待児症候群患児において免疫担当細胞の機能低下が起こっていることなどを報告した。さらに,神経中毒を引き起こすような化学物質の影響を評価するために,実際の作業現場での健康影響を評価する一方,アルキル化酢酸の膜流動性変化に対する構造活性相関を明らかにし,ニトリル化合物が特定の神経細胞にアポトーシスを誘導することを見出し,ニトリル中毒時の行動異常発生機序の一部を明らかにした。現在アポトーシス力スケードのどの部位が標的であるかを検索中である。このことは分子生物学的なアプローチが産業衛生を実践していくうえでも有効であることを示しており,今後とも社会医学への貢献の基盤としたい。さらに,このようなアプローチは神経研究のみに有効なばかりでなく,癌特有の遺伝子発現を知るためにも有用であり,多段階発癌機構を明らかにしたり,癌悪性度の評価や腫瘍マーカーの検索に利用できると考え応用を試みている。<br />In order to elucidate the mechanisms why gene expression was regulated not only in a region-specific manner but also in a stimuli-specific manner, gene regulation of several proteins which were enriched in specific brain region was examined. Adenosine receptor subtype A2a was enriched in superior colliculs and its activation caused enhancement in visual input. Analysis of gene structure of selenoprotein RHO.which was recognized to be a survival elongation factor of neuron, displayed that its expression was regulated by metal-responsive-elements, interferon-related-elements, etc. Form-deprivation myopia caused differential regulation in nitric oxide synthase (NOS) gene in retina, namely, down regulation in iNOS and bNOS mRNAs but not F in eNOS mRNA.Aside from neurons, alteration in gene regulation was investigated, i.e., diastrophic dysplasia su1fate transporter was cloned because it was up-regulated in association with osteoblastic differentiation, while MHC-II antigens were down-regulated in lymphocytes of abused children. On the other hand, such molecular biological approach was applied to occupational health, especially, in order to elucidate neuronal toxicity of several chemicals. Anesthetic activity of alkyl acetates were associated with their hydrophobicity, namely their availability to change membrane fluidity. In case of nitriles which displayed neuronal toxicity, including behavioral abnormality, their toxicity involved in apoptosis to specific neurons. We are now investigating which apoptotic cascade is a major target to nitriles. Moreover, we are applying such approach to investigation in cancer-specific gene expression in order to clarify the mechanism of cancer progression, to estimate malignancy of each cancer, etc.<br />研究課題/領域番号:09670353, 研究期間(年度):1997-1998<br />出典：「中枢神経に局在する蛋白の遺伝子発現を司る核蛋白の同定と機能解析」研究成果報告書 課題番号09670353 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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