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論文 |
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横山, 茂 ; Yokoyama, Shigeru
概要:
抗カリウムチャネル(Kv1.1、Kv1.2)抗体を作製し、末梢神経系での局在を調べた。その結果、これらのチャネルはk筋および皮膚に分布する非侵害性感覚受容ニューロンに優位に発現していた。また、神経損傷後にKv1.2チャネルの発現低下が見られ
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た。これらの結果から、Kv1.2チャネルの神経損傷時の発現低下が、非痛覚(触覚、振動覚、温度覚等)ニューロンと二次痛覚ニューロンとの異所性シナプスの形成と相侯って、痛覚過敏、アロディニアで観察されるような過剰膜興奮を来たす可能性が示唆された。末梢神経の損傷および損傷前段階で誘導される因子を同定するために、成体ラットの坐骨神経を延長した。伸長速度が1.0、2.0、20.0mm/日の3群に分け、いずれも合計20.0mmまで伸長した。腰部脊髄後根神経節および坐骨神経からRNAを抽出し、インターロイキン1β(IL1β)、インターロイキン6(IL6)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン3(NT-3)、ニューロトロフィン4/5(NT-4/5)のmRNAの発現量をRT-PCRによって調べた。腰部脊髄後根神経節では、IL6のmRNA量が顕著に上昇し、TNFα、NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5のmRNA量に変化は認められなかった。また、坐骨神経では、TNFαのmRNA量が上昇し、IL1β、IL6、NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5のmRNA量に変化は認められなかった。これらの発現上昇は、Waller変性が認められない1.0、2.0mm/日群でも有意であった。IL6、TNFαは、神経損傷時にニューロン、シュワン細胞で誘導される主要な因子であると想定された。今後、IL6およびTNFαが膜電位依存性チャネル(特にKv1.1とKv1.2)の発現量を変化させるかどうか調べる予定である。<br />Kvl.1 and Kv1.2 are closely related pore-forming subunits of voltage-gated potassium (K+) channels, and are abundantly expressed in the peripheral nervous system. To clarify biological roles of these subunits in primary sensory afferentiation, we performed immunohistochemical analysis using specific polyclonal antidodies. In immunopeoxidase staining, dorsal root and trigeminal ganglia revealed that intense immunoreactivity (IR) for Kvl.1 and Kv1.2 was prediominant in medium to large cell bodies of primary sensory neurons. Double-immunofluorescence experiments revealed that the strongly immunoreactive neurons were most frequently RT97 (neurofilament)-positive; but rarely peripherin-or IB4-positive. In the spinad dorsal horn, both the anti-Kvl.1 and anti-Kv1.2 antibodies heavily stained the deeper laminae III-IV. These results suggest that voltage-gated channels composed of Kvl.1 and/or Kv1.2 subunits may play important roles in conducting mechanoceptive and proprioceptive sensation from skin and muscles. We also observed that, when sciatic nerve was ligated, Kv1.2-IR was reduced in DRG neurons. We now hypothesize that activities of particular subtypes of K+ channels are reduced after peripheral nerve injury, resulting in abnormal excitability of primary sensory neurons, (manuscript, in preparation) In pararell, we attempted to identify proteins unregulated after peripheral nerve perturbation. We demonstrated that sciatic nerve elongation induces production of interleukin-6 (IL-6) in DRG neurons and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) in Schwann cells. The induction was detected not only in the acutely elongated 20-mm/d group, in which nuclear eccentricity in the cell body and degenerated axons were observed, but also in the gradually elongated 1-and 2-mm/d groups, in which no degenerative change was detectable. These data indicate that the expression levels of IL-6 and TNF-α are regulated delicately in the peripheral nervous system. (Osamura, et al., Exp. Neurol. 191: 61-70, 2005; Hagiwara et al., J. Orthop. Sci.10: 614-621, 2005) In the future, we will examine whether or not IL-6 and TNF-α alter expression levels of Kvl.1 and Kv1.2 proteins in neuropathic pain models.<br />研究課題/領域番号:15500255, 研究期間(年度):2003-2005<br />出典：「一次求心性Aβ線維のイオンチャネル発現異常が神経障害性疼痛発生に与える影響」研究成果報告書 課題番号15500255 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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横山, 茂 ; Yokoyama, Shigeru
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />末梢神経損傷後の慢性疼痛には、感覚ニューロンの過剰興奮と共に交感神経終末の異常な発芽(sprouting)を伴うことが多い。本研究では、これらの変化を誘導する分子を同定するための実験をおこなった。慢性
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成体ラットの左坐骨神経を切断し、3-7日後に近位側断端および健常側の右坐骨神経幹からmRNAを抽出した。cDNAを合成した後、サブトラクション・ハイブリダイゼーション法を行い、cDNAクローン約150個を得た。これらの塩基配列を決定し、GenBank/EMBL/DDBJに登録されているデータと比較したところ、89%が既存の配列と一致もしくは高い相同性を示した。コードされるタンパクは、細胞外マトリックスおよび細胞膜表面分子、細胞骨格関連分子、リン酸化酵素等の代謝酵素、分泌タンパク、RNA合成関連分子、タンパク合成関連分子、細胞周期・DNA複製関連分子、その他に分類された。これらの中から、分泌性タンパクの構造を備えているホルモン等のタンパクと細胞外マトリックスタンパクについて検討した。ポリスチレンのプレートをVI型コラーゲンで被覆すると、神経成長因子で刺激したラッ褐色細胞種由来PC12細胞の突起伸展が誘導されるのに対し、非被覆時には誘導されなかった。(Yokoyama S, et. al. Soc. Neurosci. Abstr. 872.21,2007)これらの観察から、VI型コラーゲンには、疼痛発生時の神経回路の可塑的変化に関与する可能性が示唆された。膜電位依存性Na^+チャネルの発現増加あるいはK^+チャネルの発現低下をもたらす活性の有無について調べる予定である。また今回単離した他のcDNAクローンについても、交感神経終末の発芽誘導活性とイオンチャネルの発現誘導(あるいは抑制)活性の両面から検討する予定である。<br />Altered ionic channel expression and sympathetic nerve sprouting have been thought to underlie a condition of chronic pain, such as complex regional pain syndrome. Following a few weeks after injury, postganglionic sympathetic nerve endings sprout and surround cell bodies of dorsal root ganglion (DRG) neurons, and make abnormal synaptic contacts. Aberrant interactions between sensory and sympathetic neurons are also located in the peripheral sites including neuroma at a transected nerve and intradermal region. Despite extensive studies, however, little is known about the molecules that promote the outgrowth of sympathetic nerve. To identify chronic pain-associated proteins, we screened a subtractive cDNA library enriched for mRNAs increased in the proximal stump of transected rat sciatic nerve. Among the identified proteins, collagen type VI was induced prominently in the proximal stump. Collagen type VI-coated plastic plate allowed robust neurite outgrowth of dorsal root and superior cervical ganglion neurons dissociated from adult rats, NSC34 spinal motor neuron-like cells, and PC12 pheochromocytoma cells. The neurite-promoting effect was more long-lasting than those in collagen type I-, laminin-, poly-D-ornithine-, and poly-L-lysine-coated plates. In addition, coating with collagen type VI prevented death of PC12 and NSC34 cells to the extent comparable to laminin. Immunohistochemical analysis of damaged sciatic nerve revealed that intense immunoreactivity for collagen type VI was localized in nonmyelinating Schwann cells, macrophages and fibroblasts, and along vessels and tyrosine hydroxylase (TM-positive nerve fibers. These results suggest that collagen type VI promotes not only regeneration of motor and somatosensory nerves, but also sprouting of sympathetic nerve. We are planning to examine whether somatosensory and /or sympathetic neurons in contact with collagen type VI alter expression levels of ionic channels.<br />研究課題/領域番号:18613003, 研究期間(年度):2006 – 2007<br />出典：「一次求心性Aβ線維のイオンチャネル発現調節機構の解明と難治性疼痛治療への応用」研究成果報告書 課題番号18613003（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-18613003/186130032007kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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