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Kato, Yukio ; Kubo, Yoshiyuki ; Iwata, Daisuke ; Kato, Sayaka ; Sudo, Tomohisa ; Sugiura, Tomoko ; Kagaya, Takashi ; Wakayama, Tomohiko ; Hirayama, Akiyoshi ; Sugimoto, Masahiro ; Sugihara, Kazushi ; Kaneko, Shuichi ; Soga, Tomoyoshi ; Asano, Masahide ; Tomita, Masaru ; Matsui, Toshiyuki ; Wada, Morimasa ; Tsuji, Akira
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />Purpose: Solute carrier OCTN1 (SLC22A4) is an orphan transporter, the physiologically important subs
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trate of which is still unidentified. The aim of the present study was to examine physiological roles of OCTN1. Methods: We first constructed octn1 gene knockout (octn1-/-) mice. Metabolome analysis was then performed to identify substrates in vivo. The possible association of the substrate identified with diseased conditions was further examined. Results: The metabolome analysis of blood and several organs indicated complete deficiency of a naturally occurring potent antioxidant ergothioneine in octn1-/- mice among 112 metabolites examined. Pharmacokinetic analyses after oral administration revealed the highest distribution to small intestines and extensive renal reabsorption of [3H]ergothioneine, both of which were much reduced in octn1-/- mice. The octn1-/- mice exhibited greater susceptibility to intestinal inflammation under the ischemia and reperfusion model. The blood ergothioneine concentration was also much reduced in Japanese patients with Crohn's disease, compared with healthy volunteers and patients with another inflammatory bowel disease, ulcerative colitis. Conclusions: These results indicate that OCTN1 plays a pivotal role for maintenance of systemic and intestinal exposure of ergothioneine, which could be important for protective effects against intestinal tissue injuries, providing a possible diagnostic tool to distinguish the inflammatory bowel diseases. © 2010 Springer Science+Business Media, LLC.
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辻, 志郎 ; Tsji, Siro
概要:
ラットにて一側黒質に6-ヒドロキシドーパミンを定位的に微量注入してドーパミン神経を選択的に破壊することでパーキンソンモデルを作成した。2週間後、アポモルフィンの腹腔内投与による回転運動を計測した後、断頭屠殺し脳の新鮮凍結切片を作成した。抗チ
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ロシンハイドロキシラーゼ(TH)抗体による免疫抗体染色を行い、定量した。[3H]SCH-23390を用いたドーパミンD1受容体、[3H]YM-09151-2によるドーパミンD2受容体および[3H]GBR-12935を用いたドーパミントランスポータ(DAT)の各オートラジオグラフィを専用イメージングプレートを使って行い、イメージングアナライザ(FUJI BAS-5000)で定量的に解析した。対照群では、生理食塩水を注入した。定量値は、それぞれ健側に対する破壊側の比で検討した。モデルラットの破壊側にてDAT結合と抗TH抗体による免疫抗体染色性が低下した。D2受容体の軽度上昇が認められたが、D1受容体の変化は無かった。これらは従来の報告に一致する。アポモルフィン投与による回転数と抗TH抗体染色性の低下との間には負の強い相関関係が認められた。DAT結合は、抗TH抗体染色性との間に弱い相関があったが、回転運動の評価や抗TH抗体染色性より鋭敏であった。破壊側のドーパミンD2受容体増加は回転運動が起きるような強い破壊でみられ、ドーパミン減少に伴う代償反応と考えられたが、THの低下しない弱い程度の破壊では増加が無くドーパミンの低下が乏しいことが推定される。DATによる画像化は、抗TH抗体の変化やアポモルフィンによる回転運動が起こるよりも軽度のドーパミン神経系の傷害を鋭敏に捉えることができる有用な方法であることが示された。ドーパミン神経の機能障害時においてドーパミン減少前に異常を捉えられて早期診断に役立つと思われる。<br />The aim of this study is to clarify the relationship between dopamine transporter autoradiography and tyrosine hydroxylase immunostaining in experimental unilateral parkinsonian model rat. Method : Parkinsonian model rats were stereotactically infused 6-OHDA into unilateral substantia nigra, and evaluated clockwise rotation behavior induced by administration of apomorphine. Sequential brain sections underwent immunostaining using anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody and autoradiography of dopaminergic system. Dopamine D1, D2 receptors and transporter density was assessed by imaging plate autoradiography using SCH, YM and GBR, respectively. Immunostained section were analyzed by optical digital imaging analyzer, and autoradiography were analyzed by imaging plate analyzer. Ratios of lesioned side value to contralateral side value in the caudate-putamen were used as indices. Correlations among apomorphine-induced rotation, TH immunostaining, dopamine D1, D2 receptors and transporter were analyzed statistically. Results : Significant positive correlations were shown between rotation, TH and GBR.GBR was more sensitive than TH and rotation. Conclusion : Dopamine transporter imaging is more sensitive than TH and rotation. This results support that dopamine transporter imaging may detect an early disease without obvious symptoms.<br />研究課題/領域番号:11670877, 研究期間(年度):1999-2000<br />出典：「脳内ドーパミン作動性神経受容体及び節前線維機能の核医学的同時評価の基礎的研究」研究成果報告書 課題番号11670877 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
生体は、要・不要なものの識別輸送によって栄養物質を効率的に取込む一方、異物に対しては防御機能を備えており、この過程にトランスポーターと代謝酵素が協調的に関わることが明らかにされつつある。しかし、生体は生体異物に対し、巧妙・多様な応答を示し、
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その複雑なメカニズムを理解するための新しいドグマの確立が要求されている。本研究では、分子認識および実体異物排除を担う分子をそれぞれ、パスポートタンパク質およびゲートウェイタンパク質と位置づけて、研究を実施した。その成果として、(1)オリゴペプチドトランスポーター・PEPT1がβ-ラクタム系抗生物質であるcephalexinに対して代謝機能を発揮することを示唆した。このことは、薬物トランスポーターが輸送機能に加え、代謝機能を協奏的に発揮し、ゲートウエイタンパク質として効率的な異物排除に寄与する可能性が示された。(2)有機カチオン/カルニチントランスポーター・OCTN2がカルニチンの消化管取り込みの分子的実体であることを明らかとし、また、H1アンタゴニストの臓器分布に寄与することが明らかとした。本研究によってインフラックストランスポーターがパスポートタンパク質として機能し、生理的・薬物動態学的に重要であることが示された。(3)薬物投与部位として有用な皮膚に注目し、解析を実施した。NSAIDsであるflurbiprofenに担体介在性取り込み機構が存在することを見出した。薬物皮膚透過における薬物トランスポーターの寄与が示されたことから、新規経皮投与薬の開発が期待される。(4)OCTNsなどのトランスポーターが膜裏打ちタンパク質による制御を受けていることを示唆した。また、新規薬物スクリーニング系を考案し、その基盤技術を構築した。本研究で得られた成果は、個体における役割解明、構造解析による分子機序解明、また、創薬への実用化などの多数の発展形態が期待される。<br />rug transporters are thought to be an important factor in drug absorption, distribution, excretion and delivery. Therefore, in this project, we studied drug transporters that act as the 'Passport' and 'Gateway' proteins in human body, and aimed to elucidate the mechanisms of substrate recognition and construct a system for high-through-put screening in drug developments.As the harvests of this project, the hydrolysis function of intestinal oligopeptide transporter, PEPT1, was suggested. The hypothesis that transporters could act as metabolic enzymes is novel one in this field, and verifying with proteoliposomes will provide beneficial findings to develop the orally effective peptide-like drugs. Additionally, Octn2 was shown to be involved in the intestinal absorption of carnitine. This finding suggested that influx transporters, such as PEPT1 and PCTN2, also have important roles in the intestinal absorption of drugs, and that further intensive in vivo researches will be lead to the improvement of bioavailability in oral administrations. Furthermore, study on protein-protein interaction provided the information about regulation mechanisms for drug transporter. PDZ-K1, a membrane scaffold protein was clarified, to regulate or modify the expression, stability and activity of drug transporters. Therefore, it was suggested that transporters are physiologically governed via interactions with membrane scaffold proteins. Information obtained from this project lead to build up high-through-put screening. Xenopus laevis oocytes system expressed with transporters and membrane scaffold protein.<br />研究課題/領域番号:16390039, 研究期間(年度):2004-2006<br />出典：「パスポートタンパク質・ゲートウェイタンパク質の機能を利用した薬物動態制御」研究成果報告書 課題番号16390039 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
ペプチドトランスポーターを利用した選択的な抗がん剤デリバリーの可能性を検証する目的で以下の検討を行った。1.ヒト小腸オリゴペプチドトランスポーターhPEPT1 cDNAをHeLa細胞に遺伝子導入し強制発現細胞(HeLa-hPEPT1)を得、
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その輸送活性を確認した。2.HeLa-hPepT1を背部皮下に移植した担がんマウス(Balb/c nu/nu)に、ベスタチンおよび[3H]カルノシンを投与し組織移行性を検討した結果、細胞間液のみ分布する[14C]イヌリンの値と比べ有意に高く、両ペプチドが腫瘍細胞内に蓄積することが示された。3.in vitroでのベスタチンに対する感受性の変化をMTT法により検討したところ、HeLa-hPEPT1細胞については2.2μg./ml似上の濃度において顕著な増殖抑制効果がみられた。in vivo実験として担がんマウスにベスタチン(0.5mg/kg)を28日間経口投与した結果、HeLa-hPEPT1を移植した腫瘍の増殖はmock細胞の腫瘍に比べて顕著に抑制された。4.ヒト由来の各種株化腫瘍細胞25株について、ペプチドトランスポーター遺伝子の発現量をリアルタイム定量PCR解析した結果、PEPT1の発現量はML-1細胞、NakajimaおよびCaco-2に顕著な発現が見られた。PEPT2は殆どの細胞に発現が見られた。各細胞のペプチド取り込み活性と比較した結果、トラスポーター発現量と輸送活性とが必ずしも一致しないことから、新規のペプチドトランスポーターの存在が示唆された。5.がん細胞に発現するOCTN、OATP等のトランスポーターのクローニングならびに機能特性解析、体内動態制御への利用法についての検討も行った。6.腫瘍細胞の増殖に関与するアミノ酸トランスポーターLAT1およびLAT2が、血液脳関門を形成する脳毛細血管内皮細胞にも発現すること明らかにした。<br />In the present study, we studied feasibility of drug delivery using oligopeptide transporter which expressed in some tumor cell lines. During this study period, we obtained following findings.1. A stable cell line which over expresses human oligopeptide transporter PEPT1 was established by transfecting hPEPTl cDNA into HeLa cells. Its transport actiyity was confirmed by measuring glycylsarcosine and termed the cell line HeLa-hPEPT1.2. Nude mice (Balb/c nu/nu mice) inoculated with HeLa-hPEPT1 bared tumor within several weeks. In these mice, I.v. injected an anti-tumor drug bestatine, and dipeptide carnosine were accumulated in the hPEPT1-expressing tumors.3. HeLa-hPEPT1 was more sensitive to bestatine than parent HeLa cell line by in vitro MTT assay. Tiimor growth of HeLa-hPEPT1 in nude mice was strongly suppressed by oral dose of bestatine to the mice, while that of HeLa inoculated mice was not affected.4. Messenger RNA expression levels of known oligopeptide transporters that is PEPT1 and PEPT2 were quantitatively analyzed by the real time PCR in iridivisual 25 tumbf lines. Among them ML-1, Nakajima and Caco-2 cells expressed PEPT1in high level on the other hand, PEPT2 expression was observed majority of cell lines examined. Comparing mRNA expression and transport activity profiles, we found little correlation between them. Therefore, existence ofnovel transporter that represents the uptake of peptides has been suggested.5. Molecular cloning of CDNA of organic cation transporter OCTNs and OATPs were performed and some of which were expressed in tumor cell lines.6. We have proved that expression of amino acid transporter LAT1 and LAT2, which play roles in tumor growth, in the blood-brain barrier.In conclusion, detailed characterization of many kinds of transporters which expressed in tumors will provide us valuable information to establish method for tumor specific delivery of drugs.<br />研究課題/領域番号:12557204, 研究期間(年度):2000-2001<br />出典：「ペプチド輸送系の組織特異的発現と分子認識多様性を利用した腫瘍選択的薬物デリバリー」研究成果報告書 課題番号12557204 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
本研究は、薬物の体内動態に影響を与えるトランスポーター群の多様な薬物構造認識・輸送機構を小腸、腎臓、肝臓、脳などの特定臓器に焦点を当て、臓器レベル、細胞レベル、オルガネラレベル、分子レベル、遺伝子レベルで解明し、薬物動態の臓器普遍性または臓
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器特異性を明確にすることを目的として、1)PEPT1、OCTN1、OCTN2、NPT1等について、各トランスポーター発現細胞における詳細なin vitroでの分子構造認識・輸送特性を明らかにした。2)有機アニオン系、有機カチオン系、ペプチド系等の薬物に対して生体に備わった物質輸送、蓄積、排泄機構の組織、細胞および細胞膜レベルでの検討を行った。3)それらのin vivo、in vitro実験の情報を元にした新規トランスポーター群(mOCTN1,mOCTN2,mOCTN3,OATP-B、OATP-C、OATP-D、OATP-E)のクローニングに成功した。4)クローニングしたトランスポーターに対する抗体の作成とそれを用いた組織内および極性細胞における細胞内局在性を明らかにするとともに、発現細胞を作成してその輸送特性を明らかにし、生体の種々生体物質および薬物輸送における役割について検討した。5)血液脳関門の持つ輸送機構の詳細を明らかにするため、不死化ラット脳毛細血管内皮細胞株を確立し、種々トランスポーターの機能発現を確認した。中枢移行性の少ない種々ニューキノロン抗菌薬やH1-アンタゴニストの輸送機構とABCトランスポーターの関与を明らかにした。6)OCTN2やOATP-C等のSNPsの機能特性を明らかにした。7)トランスポーターを発現するアデノウイルスベクターを構築し、本組換えウイルスをラットおよびマウスに投与することによって肝臓や血液脳関門に新たな薬物輸送活性を付与することに成功した。本研究によっていくつかの薬物の体内動態に及ぼすトランスポーターの意義が明確にされた。本研究の成果は、今後、合理的な医薬品の分子設計の提言し、臓器標的化を指向したドラッグデリバリーシステムの開発に役立てて行く必要がある。<br />The author' s research on transporter-mediated pharmacokinetics focuses on the molecular functional characteristics of drug transporters including oligopeptide transporter, monocarboxylic acid transporter, anion transporter, organic cation transporters, organic cation/carnitine transporters (OCTNs) and the ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and MRP2. We have successfully demonstrated that the transporters play important roles in the influxes and/or effluxes of drugs in intestinal and renal epithelial cells, hepatocytes and brain capillary endothelial cells that form the blood-brain barrier. In the systemic carnitine deficiency (SCD) phenotype mouse model, juvenile visceral seatosis (jvs) mouse, a mutation in the OCTN2 gene was found. Furthermore, several types of mutation in human SCD patients were found, demonstrating that OCTN2 is a physiologically important carnitine transporter. OCTNs transport not only carnitine but also various organic cationic drugs in a sodium-independent manner. It is suggested that OCTNs are multifunctional transporters for the uptake of carnitine into tissue cells and at the same time for the elimination of intracellular organic cationic drugs. In this research term, novel cDNA of organic anion transporters i.e., OATP-B, OATP-D and OATP-E have been isolated and functionally characterized. Furthermore, single nucleotide polymorphism of OATP-B, OATP-C and OCTN2 in the Japanese population was analyzed. Although more data should be collected, such information will enable us to establish ultimate drug delivery system.<br />研究課題/領域番号:12307057, 研究期間(年度):2000-2002<br />出典：「薬物トランスポーター群の分子認識・輸送の多様性に基づいた臓器移行性の制御」研究成果報告書 課題番号12307057 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
本研究においては薬物の消化管吸収性促進を目的とし、小腸上皮細胞に備わるトランスポーターならびに膜動輸送機構に関する研究を行った。その結果、モノカルボン酸輸送については、アニオン交換輸送体として働く分子的実体の一つとしてAE2やMCT1が安息
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香酸やサリチル酸などのモノカルボン酸系化合物の消化管吸収に働いていることがわかった。即ち、pH依存的なモノカルボン酸輸送系としてMCT1やAE2が重要な役割を果たしていることが示唆され、モノカルボン酸系化合物の小腸上皮細胞膜輸送におけるトランスポーターの重要性が明らかとなった。一方、ペプチドトランスポーターPepT1については抗ウイルス薬アシクロビルのバリンエステル体がその基質となることを明らかにした。本結果はPepT1の基質認識に対してペプチド結合が必須でないことを示す新しいPepT1の機能特性を提示するものである。また、パーキンソン病治療薬L-dopaのペプチド誘導体を合成し、その吸収性促進効果について検討を行った結果、L-dopaがアミノ酸輸送系を介して吸収されるよりも誘導体がペプチド輸送系を介して膜透過されるほうがより高い吸収性が期待できることが示された。以上の成果は、PepT1の機能ならびに経口デリバリーへの応用性について新たな知見を与えるものである。さらに分子サイズの大きなペプチドの経口デリバリー法の樹立を目的とし、小腸における吸着介在型エンドサイトーシス機構について検討をした。その結果、小腸には塩基性ペプチドを幅広く取り込むエンドサイトーシス機構が備わっていることを明らかにできた。以上、本研究成果は、消化管に備わるトランスポーターあるいは膜動輸送機構が薬物の消化管吸収に機能することを実証するものであり、またそのような膜輸送機構が薬物の消化管吸収性を制御する手法として有用であることを示すものである。<br />In the present study, identification and functional significance of intestinal transporters in the drug absorption were studied. The obtained results are as follows :1. Monocarboxylic acids have been thought to be absorbed by passive diffusion mechanism according to pH-partition theory. However, in the present study, two transporters that are present at the intestinal epithelial cells and accept monocarboxylic acids as the substrates were identified. MCT1 is a proton-cotransporter for monocarboxylic acids such as lactic acid and pyruvic acid. However, when MCT1 was stably transfected to MDA-MB231 cells, it exhibited transport activity for acidic drugs such as benzoic acid and salicylic acid In addition, anion antiporter AE2 also transported such monocarboxylic acids. Furthermore, immunohistochemical analysis demonstrated the presence of MCT1 at the brush-border membrane as well as basolateral membrane. These results suggest that monocarboxylic acid drugs are absorbed via specific trans porters and will be useful for the enhancement of intestinal absorption of acidic drugs by utilization of these transporters.2. Peptide transporter, PepT1 is present at the brush-border membrane of intestinal epithelial cells and mediates absorption of various di- and tri-peptides in a pH-dependent manner. L-dopa, which has low bioavailability, was derivated to dipeptide and the mechanism of intestinal absorption was examined. L-dopa-L-phe, a peptide-derivative of L-dopa, showed significantly higher permeability than that of L-dopa across the intestinal epithelial monolayers and the permeability was significantly decreased in the presence of high concentration of native dipeptides. So, peptide-derivation is expected to be useful for the increased intestinal absorption by utilizing peptide transporter PepT1.These lines of studies provide new insight of the significance of membrane transporters and new strategy to control intestinal absorption of drugs by utilizing the transporters in the intestinal epithelial cells.<br />研究課題/領域番号:10557214, 研究期間(年度):1998-1999<br />出典：「小腸上皮トランスポーター遺伝子発現系による経口薬物スクリーニングシステムの開発」研究成果報告書 課題番号10557214 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
本研究では、薬物や生理的物質の体内動態に関わるトランスポーターの同定・機能解析を目的とした。得られた第一の成果は、新規に遺伝子クローニングに成功したOCTNトランスポーターファミリーの薬物ならびに生理的基質としてのカルニチン輸送解析である。
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本研究では、特にヒト及びマウスOCTN2の遺伝子クローニングを行い、その組織分布性や機能特性から生理的役割として脂肪酸代謝に重要なカルニチントランスポーターであることを実証した。すなわち、カルニチン欠乏症状を示すjvsマウスならびに臨床医の協力を得て得られた患者におけるOCTN2遺伝子解析によって、OCTN2遺伝子変異が直接的にカルニチン欠乏症と関連していることを示すことに成功した。さらに、OCTNはカルニチンとともに有機カチオンも輸送することが示された。しかも、カルニチンはナトリウムイオン依存的に、有機カチオン輸送はナトリウムイオン非依存的に輸送する多機能的トランスポーターであることが示された。本研究成果は、全身性カルニチン欠乏症の原因遺伝子の同定という、生理的・医学的に極めて意義のある研究成果となった。特にカルニチン欠乏症は小児においては致死的あるため、その遺伝子診断など臨床的に極めて有用な情報を提供する基礎研究成果となった。その他には、血液脳関門で働くモノカルボン酸トランスポーターMCT1の機能発現の実証、元来リン酸トランスポーターとしてクローニングされたNpt1がアニオン性薬物を輸送しその腎・肝排泄に関わること、キノロン系抗菌薬の臓器移行・排泄にはMRP2やP-糖蛋白質を含む複数のトランスポーターが関与していること等の結果が得られた。これら薬物輸送に働くトランスポーターの同定、機能解析、発現部位の同定、および薬物速度論的なトランスポーターの役割の解析研究は、トランスポーターを利用した薬物動態制御法の可能性を強く示すものである。<br />Various transporters that mediate membrane transport of drugs as well as physiological compounds were clarified by molecular cloning of the genes and their functional analysis by gene expression systems. The obtained results are as follows :1. Novel transporter family OCTNs were molecularly cloned and their transport functions were analyzed by transfection of the gene to HEK293 cells. Human and mouse OCTN2 transported physiologically important carnitine in a sodium dependent manner. JVS mice that show systemic carnitine deficiency(SCD) syndrome had a mutation in OCTN2 gene with loss of carnitine transport function. Furthermore, various mutations in OCTN2 gene were identified in patients who show the SCD syndrome. From these results, it was clarified that OCTN2 is a physiologically important camitine transporter and its mutation leads to the SCD. Interestingly, OCTN2 and its isoform OCTN1 transported organic cations in a sodium independent manner. Accordingly, OCTNs are unique transporters which have are multifunctionality by transporting carnitine and organic cations in the distinct mechanisms.2. Molecular characterization of the transporter for monocarboxylic acids at the blood-brain barrier (BBB) was performed. Monocarboxylic acid transporter MCT-1 gene was expressed at the BBB and was found to play important role in the transport of organic weak acids by the in vitro cultured cells and in vivo studies.3. Multiple efflux mechanisms for new quinolone antibacterial agent were found to be expressed at the BBB. They are P-glycoprotein and unknown transporters sensitive to anionic compounds. These multiple efflux transporters seem to restrict the brain distribution of quinolones and other drugs, resulting in a low distribution into the central nervous system.These lines of studies provide new insight of the siginificance of membrane transporters and new strategy to control disposition of drugs by focusing on the transporters function present in various tissues.<br />研究課題/領域番号:10470510, 研究期間(年度):1998-1999<br />出典：「薬物のトランスポーター介在輸送に基づいた臓器移行性の制御」研究成果報告書 課題番号10470510 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
臓器・細胞・分子・遺伝子レベルで薬物動態・薬効の臓器普遍性または臓器特異性を明らかにし、これを合理的に制御する方法を開発することを目的とし、本研究班構成員14名の2年間の研究により、次に示す成果を得た。1.薬物の口腔・消化管からの吸収・分泌
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、肝・腎排泄、脳などの臓器分布・排出に関与するトランスポータ(TP)群の存在の示唆及びそれらの化学構造認識・輸送特性の解明、PepT1, PepT2, MCT1, cMOAT, OATK1, OCT2などのTP群のクローニングとその機能解析、及びこれらのTP群の組織分布性を明らかとした。また、P-糖蛋白質が脂溶性薬物の小腸からの吸収や脳移行を制限するバリアー機能を演じていることを明らかとし、吸着介在エンドサイトーシスによってペプチドを脳に送達する道を開いた。2.グリコシド化、粘膜接着性、パイエル板のエンドサイトーシス活性、イオントフォレ-シスの利用あるいは細胞間隙拡大物質による低・高分子薬物の吸収促進機能を解明した。3.分画へパリンのスカベンジャーレセプター及び血漿蛋白質が介在する肝移行制御、ガラクトース修飾蛋白質の肝特異的分布性の調節、活性酸素やNOラジカルが病態制御因子として重要な役割を演じることをつきとめ、部位指向性SODを標的病態臓器に集積させることに成功した。また、腫瘍臓器血管内皮細胞に対するモノクロナール抗体を利用した斬新な癌ミサイル療法の道を開いた。4.α_1受容体をモデル系として、ヒト薬物受容体のクローニングとその細胞内情報伝達機構を解析した。また、脳内および抹消組織には、それぞれN^3-フェナシルウリジンおよびウリジンと強い親和性を有するレセプターの存在を示唆する新規な結果を得た。ペンタゾシンをラットに投与後の血漿中・脳内濃度と鎮痛効果の時間推移を薬物動態学的に解析し、神経活動の制御機構を解明する方法を開発した。以上の成果により、本総合研究は初期の目的をほぼ達成することができた。<br />The purpose of this research project is to clarify the organ specific transports of drugs from the view points of organ, cell, molecular and gene levels and to develop novel method for regulation of pharmacokinetics and pharmacodynamics of drugs. The following results were obtained by two years term of this research project consisted of 14 investigators :1.Several evidences were obtained for molecular and biological characteristics of transporters involved in the buccal and intestinal absorption and secretion, renal secretion and reabsorption, hepatic uptake and biliary secretion and in the brain influx and efflux transports. Cloning of transporters of PepT1, PepT2, MCT1, cMOAT,OAT-K1 and OCT2, their transport functions and tissue distribution were clarified. It was also clarified that P-glycoprotein functions as the transport barrier for lipophilic xenobiotics in the intestine and at the blood-brain barrier (BBB). Peptides were confirmed to be taken up by adsorptive-mediated endocytos is at the BBB to be delivered into the brain. 2.Improvement of absorption for drugs was achieved by glycosylation, endocytosis across Peyer's patches, iontophoretic method and by absorption enhancers to open tight junction. 3.Uptake of fractionated heparin by hepatocytes and Kupffer cells was clarified to be regulated by the scavenger receptor-mediated and plasma proteins-mediated mechanisms. Liver-specific delivery of drugs, proteins and gene was achieved by using galactosylated technology. Reactive oxygen species, such as superoxide and nitric oxide (NO), were clarified to play critical roles in the pathogenesis of various diseases. To overcome the oxidative stress, synthesized site-directed SOD derivatives were succeeded to deliver the targeting cells. An attractive approach for the antibody-based therapy of solid tumors was proposed and evaluated successfully by use of "vascular targeting" antibody to recognize tumor endothelial cells. 4.Using alpha 1-adrenoreceptor as a model, cloning of the receptors and detection of the tissue localization of the receptor protein were succeeded. It was indicated that uridine receptor plays some role not only in brain but also in peripheral tissues. Pharmacokinetic and pharmacodynamic behaviors for the transport in the brain, receptor binding and analgesic action were analyzed after peptazocine administration in rats.<br />研究課題/領域番号:07307035, 研究期間(年度):1995-1996
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学薬学部<br />本研究では、血液脳関門に存在するトランスポーターの分子的・機能的探索と新規評価系の確立を試みた。二年間の研究を通じて、血液中から脳内への栄養物輸送に働く種々のトランスポーターの同定に成功した。まず、乳酸やピルビン酸
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輸送に働くモノカルボン酸トランスポーターMCT1である。二番目はアミノ酸輸送に働くLAT1、LAT2およびその補助因子4F2hcであり、三番目はカルニチントランスポーターとして働くOCTN2である。いずれのトランスポーターも脳内への物質取り込みに働くタイプであり、これらが安息香酸、L-DOPAやアセチルカルニチンなどの薬物の脳内移行にも働くことを示した。また、薬物の中枢移行についてはH1アンタゴニストのエバスチンおよび代謝産物カレバスチン、さらにキノロン系抗菌薬のグレパフロキサンに着目した。その結果、いずれの薬物もP-糖タンパク質による排出により脳内移行性が低く保たれており、中枢性副作用が低いものと推定された。さらにグレパフロキサシンについてはP-糖タンパク以外の排出輸送機構の存在が示唆され、複数の排出輸送系により脳内の恒常性が維持されているものと考えられた。本研究を通じて、新たな評価系として脳毛細血管内皮の不死化細胞RBEC1の樹立を行い、研究成果を得る上で有用な実験系となった。さらに、より生理的機能を維持できると考えられるin viro血液脳関門評価系として、脳毛細血管内皮細胞とアストロサイトの共培養系の導入を行った。共培養により血液脳関門マーカーや密着結合性の向上が見られたが、さらなる改善の必要性を示す結果となった。以上、本研究成果として新たな血液脳関門機能を分子・機構論的に見いだすことに成功するとともに、マススクリーニングに適した評価系の確立を試みた。評価系についてはさらなる改善が必要であるが、見いだされた新規血液脳関門機能は今後の脳内への薬物デリバリーに有用な情報を与えるものとなった。<br />In the present study, we studied membrane transporters equippecd, in the brain capillary endothelial cells that are functional as the blood-brain barrier. Through this study, we found three new transporters that are expressed at the blood-brain barrier.One of those transporters are monocarboxylic acid transporter MGT1, which tworks for uptake and/or efflux organic weak acids such as lactic acid, pyruvic acid and benzoic acid. The second transporter is neutral amino acid transporters LAT1 and LAT2. These two amino acid transporters work for the uptake of amino acids that are relatively hydrdphpbic and large molecules, including leucine, tyrosine and phenylalanine. These are also important for the brain livery of L-DOPA that is effective for perkinsonism. The third transporter is OCTN2that is callsified as the carnitine/organic cation transporter. OCTN2 is a Na^+-dependent carnitine transporter and works for the brain uptake of acetyl-L-carhitirie that is expected to be useful for Aitzhe imer's disease. On the other hand, brain efflux transporters that protect brain from the toxic xenobiotics. As the model drugs, H1-antagonist, ebastine and carebasitine and fluoroquinolone, grepafloxacine, was used in the present study. Generally, fluoroquinolonesand H1 antagonists exhibit adverse effects such as epilepsy and sedative effects, while the drugs studied in the present study do not show such adverse effects. We expected that these drugs might not have enough permeability across the blood-brain barrier, resulting in the insufficient delivery to the brain to cause unfavorable adverse effects. Varipus Kinds of studies on the BBB transport of these drugs demonstrated that there are at least two types of brain efflux transporters, including p-glycoproteih and anion exchange transporter, of which molecular identification remains to be succeeded.All of these studies were performed by using various BBB-transport techniques. Especially, newly developed cell line RBEC1 that were derived from rat brain capillary endothelial cells was useful for the success of the present study. Furthermore, we challenged of the coculture of the endothelial cells and astrocytes in order to mimic the in vivo BBB. Although we partly succeeded to prepare the in vitro BBB model, further improvement will be essential for the efficient and complete model for the evaluation of blood-brain barrier transport.<br />研究課題/領域番号:12557229, 研究期間(年度):2000-2001<br />出典：「血液脳関門の機能的実体解明に基づいた薬物中枢移行性評価法の確立」研究成果報告書 課題番号12557229 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学大学院自然科学研究科<br />カルニチン欠乏症は、最終的には心機能異常など致死的症状を示す病態であるが、主に遺伝性の全身性カルニチン欠乏症と、また臨床的な薬物投与や食事等栄養状態による二次性カルニチン欠乏症に分けられる。本研究では
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二次性カルニチン欠乏症の中で、薬物誘導型カルニチン欠乏症におけるOCTN2の寄与の可能性について、腎を中心とした臓器におけるOCTN2の有機カチオン輸送や薬物によるカルニチン輸送活性変動について解析を行うことにより、OCTNトランスポーターの生理的・薬物動態的役割ならびにカルニチン欠乏症との関連について解析を行った。ヒトならびにマウスOCTN2は、カルニチンをNa^+依存的に、有機カチオンの一種であるテトラエチルアンモニウム(TEA)をNa^+非依存的に輸送した。また、TEA以外にもメピラミンやベラパミル及びキニジンなどのカチオン性薬物を輸送した。一方、これらカチオン性化合物に加え、中性ならびにアニオン性化合物によってもカルニチン輸送活性は機能阻害を受けた。OCTN2が存在する腎臓においては、カルニチンはNa^+を駆動力とした再吸収に働くが、このような臨床的に使われる医薬品によって機能阻害を受けるということは、薬物誘導型の二次性のカルニチン欠乏症発症原因の一つとしてOCTN2が関与することを示すものであることが明らかになった。一方、他のOCTNメンバーOCTN1ならびにマウスOCTN3についても解析を行った結果、OCTN3精巣特異的な発現であり、またOCTN1は低いカルニチン輸送活性しか有せず、全身性カルニチン欠乏症としてはOCTN2が最も重要であることが示唆された。<br />In the present study, novel Na^+-dependent carnitine/organic cation transporter family, OCTNs from human and mouse were identified and functionally characterized. We isolated two and three members of OCTN family from human and mouse, respectively. OCTNs are present in various tissues, including kidney, heart, skeletal muscle and placenta strongly, and in several human-derived cancer cell lines. By immunohistochemical analysis in kidney, mouse OCTNs localized commonly in luminal membrane of tubular epithelial cells. Most of human and mouse OCTNs exhibited multifunctionality by transporting both of carnitine and organic cation, tetraethylammonium (TEA). Furthermore, sodium ions were essential for carnitine transport by human and mouse OCTN1 and 2. In systemic carnitine deficiency (SCD) phenotype mouse model, juvenile visceral steotosis (jvs) mouse, mutation in OCTN2 gene was found. Furthermore, several kinds of mutation in human SCD patients were found, demonstrating that OCTN2 is a physiologically important carnitine transporter. Interestingly, TEA transport was sodium independent. In addition, OCTNs transporterd various cationic drugs such as quinidine, verapamil, and actinomycin D.Furthermore, since one mutation of human OCTN2 lost carnitine transport activity but retained TEA transport activity, it was suggested that OCTN2 have differential functional sites for carnitine and organic cations. So, OCTNs are thought to be multifunctional transporters by transporting carnitine and organic cations by sodium ion dependent and independent manner, respectively, and would be important for disposition of organic cationic drugs as well as carnitine. Furthermore, since carnitine transport via OCTN2 is inhibited various compounds, including organic cations, organic anions such as valproic acid and neutral compound such as cortisole, it is anticipated that drug-induced secondary carnitine deficiency could be caused by interaction on OCTN2.<br />研究課題/領域番号:11672212, 研究期間(年度):1999-2000<br />出典：「高親和性カルニチントランスポーターの機能特性と薬物誘導型毒性発症機構との関連」研究成果報告書 課題番号11672212(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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