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遺伝子研究施設 ; 西内, 巧 ; 堀家, 慎一 ; 西山, 智明 ; 浅野, 雅秀 ; 浅野, 智哉 ; 加藤, 智朗 ; 富樫, 真紀 ; 森, 美紀 ; 松井, 由美子
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西内, 巧 ; Nishiuchi, Takumi
概要:
金沢大学学際科学実験センター遺伝子研究施設<br />植物病原糸状菌であるムギ類赤かび病菌は、作物に減収だけでなくかび毒汚染による質的な被害をもたらす。本研究では、本菌に罹病性のシロイヌナズナを用いて、植物の抵抗性やかび毒解毒に関わる候補遺
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伝子の発現を改変させた形質転換体を解析し、抵抗性を顕著に向上させる2遺伝子、かび毒を低減化させる2遺伝子を同定した。これらの遺伝子を効果的に組合せることで、赤かび病による病徴とかび毒蓄積を共に低減化し得る植物の作出が期待された。<br />Fusarium head blight (FHB) is serious disease leading to significant yield loss and accumulation of trichothecene mycotoxins. To improve disease resistance and mycotoxin detoxification in plants against F. graminearum, we generated transgenic stacking in Arabidopsis plants. We had identified some defense-related genes that are involved in the disease resistance against F. graminearum. Among these genes, we revealed that the ubq6/6* double mutant strong disease resistance. The barley HvGST13 and HvGR2 genes were specifically upregulated in the barley breeding lines showing lower mycotoxin (DON) accumulation. The HvGST13ox and HvGR2ox Arabidopsis plants were DON-resistant phenotypes compared to wild type. In addition, HvGST13ox Arabidopsis plants showed weak disease symptoms and low DON accumulation after inoculation of F. graminearum conidia. In the future, crossing the ubq6/6* mutant with HvGST13ox and HvGR2ox likely shows low disease symptoms and DON accumulation by F. graminearum.<br />研究課題/領域番号:26450053, 研究期間(年度):2014-04-01 - 2017-03-31
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西内, 巧 ; Nishiuchi, Takumi
概要:
植物の環境ストレス応答には、タンパク質のリン酸化リレーでシグナルを伝達するMAPK(mitogen-activated protein kinase)カスケードが中心的な役割を担っている。MAPKカスケードでは、MAPKKK→MAPKK→M
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APKと順次リン酸化され、シロイヌナズナのMAPKK及びMAPKについては機能解明が進んでいるが、MAPKKKのほとんどは機能未知である。本研究では、シロイヌナズナのMAPKKKの１つであるMKD1により制御されるMAPKカスケードを明らかにし、赤かび病菌等の植物病原菌に対する抵抗性に重要な役割を担うことを明らかにした。<br />MAPKKK delat-1 (MKD1), a novel Raf-like MAPKKK, was isolated as a subunit of a complex including the Arabidopsis transcription factor AtNFXL1. An MKD1-dependent cascade positively regulates disease resistance against PstDC3000 and the trichothecene mycotoxin-producing fungal pathogen Fusarium sporotrichioides. MKD1 directly interacted with MKK1 and MKK5 in vivo, and phosphorylated MKK1 and MKK5 in vitro. Correspondingly, mkk1 mutant and MKK5RNAi transgenic plants showed enhanced susceptibility to F. sporotrichioides. MKD1 was required for full activation of two MAPKs (MPK3 and MPK6) by the T-2 toxin. Finally, quantitative phosphoproteomics revealed that an MKD1-dependent cascade controlled phosphorylation of a disease resistance protein, SUMOs, and a mycotoxin-detoxifying enzyme. Our findings reveal that the MKD1-MKK1/MKK5-MPK3/MPK6-dependent signalling cascade plays an important role in plant immune responses against both bacterial and fungal phytopathogens.<br />研究課題/領域番号:23580060, 研究期間(年度):2011-2013
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西内, 巧 ; Nishiuchi, Takumi
概要:
金沢大学学際科学実験センター遺伝子研究施設<br />植物表層における病原菌との相互作用に関わるタンパク質を同定するため、シロイヌナズナの葉に赤かび病菌の胞子懸濁液を滴下接種した表皮組織を用いて、ショットガンプロテオーム解析を行った。接種4
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時間後の表皮において、MAPKKK等のシグナル伝達因子やタンパク質分解に関わるタンパク質の発現量が増加していた。接種24時間後の表皮では、転写因子、PRタンパク質の発現も増加していたが、葉全体ではこれらの発現増加は見られなかった。また、赤かび病菌のエフェクター様タンパク質も多く検出されたことから、接種表皮を用いたプロテオーム解析は、植物と病原菌の相互作用に関わるタンパク質の検出に有効であることが示された。<br />The plant epidermis is the first line of plant defence against pathogen invasion and likely contains important regulatory proteins related to the plant-pathogen interaction. We performed comparative proteomic studies to identify differentially expressed proteins in the leaf epidermis challenged with fungal phytopathogen. The conidia solutions were dropped onto the Arabidopsis leaf surface and then collect the epidermal tissues from inoculated and mock treated leaves at 4 and 24 hpi. Label free quantification methods showed that proteins related to defence signaling, transcription factors, and cell wall organization were up-regulated in the inoculated leaf epidermis. More than 300 fungal proteins expressed on the Arabidopsis epidermis were also identified and about 13% of them were predicted as effector-like proteins. These results suggested that our method is useful for understanding the early expressions of plant and fungal proteins related to their interactions.<br />研究課題/領域番号:18K05642, 研究期間(年度):2018-04-01 - 2021-03-31<br />出典：「植物表皮プロテオミクスを用いた病原菌に対する侵入抵抗性の制御因子の探索と機能解析」研究成果報告書 課題番号18K05642（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-18K05642/18K05642seika/）を加工して作成
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西内, 巧 ; Nishiuchi, Takumi
概要:
金沢大学学際科学実験センター<br />局所的及び葉と葉の間の傷ストレス応答に関わるシグナルとして、植物ホルモンであるジャスモン酸(JA)が中心的な役割を担うことが知られている。JAはオクタデカノイド経路によってリノレン酸からOPDAなどの
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中間産物を経て産生される。シロイヌナズナのマイクロアレイを用いた解析から、根を傷処理し30分後に地上部で発現量が増加した遺伝子群にも、JA合成経路(オクタデカノイド経路)に関わる遺伝子やJA応答性遺伝子が多く含まれることを明らかにしていた。JAに加えてOPDAも傷応答遺伝子の発現に関与していることが示唆されているが、根を傷つけたときの地上部におけるJA量とOPDA量の経時的な変化を調べたところ、傷処理後30分にJA量が約6倍に上昇し、OPDA量は6時間後に約2倍に上昇していた。さらに、葉に傷をつけた植物の根での応答についてアレイ解析を行った結果、葉から根への器官間傷応答性を示す遺伝子は比較的少なく、顕著な応答性を示すものも少なかったが、根から葉への期間傷応答遺伝子として同定されていたJAZファミリー遺伝子がこちらにも共通して含まれていた。また、根から葉への器官間傷応答遺伝子の1つであるエチレン応答性転写因子のAtERF13について、AtERF13promoter-Luciferase形質転換体を用いて解析したところ、根を傷つけた時の地上部では約5倍以上にルシフェラーゼ活性が上昇するのに対して、葉を傷つけた時の根での応答は2倍にも満たなかったことから、AtERF13は双方向には器官商傷応答性は示さないことが明らかになった。今後、双方向の器官間傷応答性を示した遺伝子についても同様の解析を進めて行きたい。<br />研究課題/領域番号:17770031, 研究期間(年度):2005 – 2007<br />出典：「葉と根の間でのシステミックな傷応答遺伝子発現の解析」研究成果報告書 課題番号17770031（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17770031/)を加工して作成
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西内, 巧 ; Nishiuchi, Takumi
概要:
金沢大学学際科学実験センター<br />本年度は、中国の田螺山遺跡等で出土した植物遺体及び土器付着物について、イネ果実（炭化米）１粒程度のサンプル量で代謝物の分析を行う、メタボロミクスの実験系の構築を目指した。前年度から進めていた代謝物の抽
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出溶媒とUPLCによる分析条件の検討をさらに進め、中国で出土したイネ、ヒシ、ドングリの果実を用いて、破砕後にメタノールを溶媒として抽出を行い、親水性化合物も同定可能なHILICカラムを用いて、LC-MSによる分析を行った。分析の結果、ヒシやドングリでは、200種以上の代謝物が同定されたが、微生物由来と思われる代謝物も複数見られた。一方、イネで検出された代謝物は100種以下で、イネと他の2種で共通して検出された代謝物も少なかったが、イネのみで検出された代謝物には、脂肪酸や芳香族化合物等が見られた。ドングリでは、フィトセラミドとその分解産物などが特異的に検出された。ヒシのみに見られた代謝物には、アミノ酸類縁体や芳香族化合物等が含まれていた。出土したドングリについては、種同定に至っていないという問題もあるが、今後は現生果実との比較解析や出土場所の異なる試料での解析を行うことで、マーカーとなる代謝物の探索を進めたい。一方、４つの異なる土器付着物についても、植物遺体で用いた方法を一部改変して分析を行ったところ、複数の土器付着物で共通して見られる代謝物には脂肪酸が多く見られたが、魚類に多く含まれる一価不飽和脂肪酸であるイコセン酸も検出された。今後、多くの土器付着物を分析し、再現性よく検出される代謝物の中から食性復元のマーカーになるような代謝物の探索を進めて行きたい。<br />研究課題/領域番号:18H04176, 研究期間(年度):2018-04-01 – 2020-03-31<br />出典：研究課題「高感度質量分析計を用いた遺跡出土品のメタボローム解析による多様な食品利用の復元」課題番号18H04176（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PUBLICLY-18H04176/）を加工して作成
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西内, 巧 ; Nishiuchi, Takumi
概要:
金沢大学学際科学実験センター<br />多様な年代や地域で出土する動植物遺体中に残存する微量ペプチドの同定により、ヤポネシア人の動植物利用の復元を試みる。さらに歯石や土器付着物等のより複雑な試料についてもプロテオミクス解析を行うことで、ヤポ
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ネシア人の食生活や疾患を復元し、ヤポネシアへの渡来と定着の過程における食生活、疾病や動植物利用の変遷を明らかにする。<br />遺跡から出土する動物骨中のコラーゲンタンパク質は非常に安定であり、歯石中に残されたタンパク質も古代人の疾患や食生活の復元について有用な知見をもたらす。一方で、植物遺存体は、イネ果実のように経年により炭化することも多く、タンパク質の分析については実験系が確立されていない。本研究では、動物骨や歯石のプロテオーム解析に加えて、炭化米等の植物遺存体からタンパク質を抽出・精製する方法について検討を進め、質量分析計を用いたショットガンプロテオミクスを行っている。前年度に開発したアセトン沈殿によるタンパク質精製を改良した方法を用いることで、弥生時代の福岡の2遺跡と韓国の1遺跡の3種のイネ果実（炭化米）試料から、多数のペプチドを検出し、多くのタンパク質を同定することができた。同定されたタンパク質の多くは、イネ種子に特異的に蓄積していると報告されていたタンパク質であり、中でも、63kDグロブリン様タンパク質は、3遺跡全ての試料で同定され、いずれも多数のペプチド(4-12本)が検出された。イネ科には、この63kDグロブリン様タンパク質と類似なタンパク質が存在し、キビ属とは70％弱の類似性であり、異なるアミノ酸配列が多数見出されたことから、イネとキビなどの雑穀を分別できるマーカータンパク質の候補と考えられた。また、ジャポニカとインディカにおいても複数のアミノ酸が異なっており、多数のペプチドを検出できれば、判別が可能であると考えられた。また、土器付着物についても、植物遺存体を用いた上記に類似した方法を適応して解析を進めており、植物だけではなく、動物や微生物由来のタンパク質も検出されており、土器付着物のプロテオーム解析による食生活の復元に向けた実験基盤を確立することができた。<br />研究課題/領域番号:19H05345, 研究期間(年度):2019-04-01 – 2021-03-31<br />出典：研究課題「プロテオミクスで紐解くヤポネシア人の食生活の復元」課題番号19H05345（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PUBLICLY-19H05345/）を加工して作成
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