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村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
テロメラーゼは抗がん剤研究の有力な標的である。本年度、FLAG標識hTERT発現HeLa細胞のヒトテロメラーゼ複合体とhTERTと相互作用するヌクレオリンの生物的機能の解析(村上)、hTERT発現による不死化ヒト初代細胞系の解析(本多)、更
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に細胞の増殖・分化などに重要な役割を担う受容体型チロシンキナーゼの解析(善岡)を行った。得られた主な結果は、1)HeLa細胞にFLAG-hTERTを導入して得られた活性型組み換え型テロメラーゼは、昆虫細胞系2成分発現ヒトテロメラーゼ複合体と類似して、分子篩法で2種類の複合体(IとII)に分画された。Hsp90を含まず、Hsp90阻害剤に耐性の複合体Iと、Hsp90を含む後者の複合体IIは、Hsp90阻害剤に感受性を示し内在性及びFLAG標識hTERTは共に不安定であった。また内因性hTERTとFLAG-hTERTの大半は複合体Iに分布した。ヌクレオリンが複合体Iに含まれ、複合体IIには殆ど含まれない。これらの結果は、細胞内で異なる2種類の活性型テロメラーゼ複合体が存在し、テロメラーゼの異なる局在或いは活性型テロメラーゼの異なる機能を示唆した。2)hTERT発現レトロウイルスベクターをヒト正常線維芽(BJ)細胞に感染させ、hTERT発現細胞が不死化した細胞株を樹立した。ジーンチップ解析では、hTERT導入不死化BJ細胞ではBJ細胞に比較し、細胞増殖、細胞周期に関与する因子の発現亢進が認められた。3)hTERTと特異的に相互作用するヌクレオリンは、C型肝炎ウイルス(HCV)複製に必須であることが、ヌクレオリン結合性を消失したHCV NS5B変異を持つHCVサブレプリコン系ではHCV複製が全く起きないことと、RNAi法でヌクレオリン発現が低下した細胞では、HCV複製が大きく低下する結果により示された。<br />Since telomerase activity is barely detectable in primary cells but clearly detected in cancerous cells, telomerase has been considered to be a strong candidate of the targets to cancer treatment In the fiscal year, we concentrated in several experiments including purification and characterization of recombinant human telomerase complex, and biological function of the specific interaction of nucleolin and hTERT recovered from a HeLa cell line stably expressing FLAG-hTERT (Murakami), analyses of human primary cells immortalized by hTERT (Honda), and the tyrosine kinases of receptor type which play critical odes in cell proliferation and differentiation (Yoshioka). The followings are the main conclusions of the experiments.1) The partially purified active telomerase complexes comprise two different complexities, complex I (around 680 kDa), and complex II (around 400 kDa), that are quite alike to those that can be recovered firm the insect cells co-expressing FLAG-hTERT and hTERC. The com plex I does not contain Hsp90 and is resistant to Hsp90 inhibitors, whereas complex II contains Hsp90 and is sensitive to Hsp90 inhibitors. Human TEAT in the complex II is rather unstable during incubation in vim and in ring. Such unstable property was not observed with the complex I. Since MG132, a specific proteasome inhibitor, but not MG133, a negative control, stabilized hTERT in the complex Z strongly suggesting that hTERT in the complex If is under degradation pathway under the control of proteasome. The two different complexities of human telomerase seem to imply two different entities of active telomerase in different subcellular localization or its different functions. 2) We have established a cell line of the human primary fibroblasts(BJ cells) stably expressing hTERT, and we compared expression profiles of RI cells and the KJ cells immortalized by MERE Some genes involving in cell cycle progression and cell proliferation were evidently expressed higher in the immortalized 131-hTERT than these in in the primary cells. 3) Nucleolin, one of the specific interacting partners of hTERT can bind to Hepatitis C Virus (HCV) NS5B, RNA-dependent RNA replication of HCV. We evaluated the role of the specific interaction of nucleolin and NS5B in HCV replication. The HCV subreplicon system has been applied for the address We found that the HCV subreplicons harboring alanine substitution mutations or mutation at the residue(s) either one of two critical sequences within NS5B both of which are necessary for the nucleolin-binding could not replicate at all in a transient HCV replication system in HepG2 ml/s., although the wild replicon could support efficient HCV. By introducing transiently RNAi of nucleolin, that down regulated expression of nucleolin by half to one third, reduced HCV evidently reduced HCV replication using the HCV subreplicon system. Taken together, the specific interaction of nucleolin and NS5B is critical for HCV replication.<br />研究課題/領域番号:17390091, 研究期間(年度):2005-2007<br />出典：「テロメラーゼの細胞内局在と活性制御」研究成果報告書 課題番号17390091 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
HCVの持続感染の遮断が肝がん発症のリスクを低下させると期待される。RNA依存RNA合成酵素(RdRP)であるNS5BはHCV複製遮断の有力な標的である。NS5Bに集約型(Cm)及び置換型(Pm)変異を導入しRdRP活性の検討を行い、RdR
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P活性に必須な5残基を新たに報告した。本研究では、RdRP活性と構造の研究を進め、NS5Bと相互作用するHCV NS5Aと宿主蛋白ヌクレオリンのRdRP活性への影響と、in vitroで得られた知見がHCV複製に与える影響を解析し、以下の成果を得た。1)NS5Bがオリゴマー化することを見い出し、Cm変異解析によりオリゴマーに必須な2残基は、活性中心より離れたRdRP活性に必須な2残基と一致した。これはRdRP活性にオリゴマー化が必須であることを示した。2)NS5BとNS5Aの特異的結合を見い出し、NS5Bの4配列とNS5Aの2つの領域が相互作用に必要である。精製NS5Aは少量でRdRP活性を促進し、多量でRdRP活性を阻害した。3)我々は、ヌクレオリンとNS5B相互作用を見い出し、2蛋白の相互作用領域を限定した。この結合がNS5Bの細胞内局在に影響を与えた。4)MILE HCV RNAレプリコン系を用いて解析した結果、RdRP活性に必須な5アミノ酸残基がHCV複製に必須であった。5)HCV RNAレプリコン系にNS5AのNS5B結合領域にCm或はPmを導入した解析で、NS5B結合変異NS5AではHCV複製が起きず、NS5AとNS5Bとの相互作用がHCV複製に必須であることを強く示唆した。6)ヌクレオリンとNS5Bの相互作用の影響をHCV RNAレプリコン系で検討した。ヌクレオリン結合領域にCm或はPmを持つレプリコンは、HCV複製が起きないか極端に低下していた。SiRNA法でヌクレオリン発現が一時的に低下した細胞では、Hcv複製が1/3-1/4程度に低下した。<br />Eradication of HCV persistent infection may prevent or delay incidence of hepatocellular carcinoma. HCV NS5B is RdRP that is a strong target to eradicate HCV replication. In hope to find novel strategies, we had identified 5 residues of NS5B critical for RdRP activity by introducing clustered alanine substitution (Cm) and point alanine substitution. This grant aims to get further insight of structure and function of RdRP enzyme, to characterize NS5B-interacting partners, NS5A and a host factor nucleolin, and finally to evaluate these interactions and mutations of NS5B on HCV RNA replication using a HCV RNA replicon system. Followings are the results we obtained.1)Oligomer formation of NS5B was observed and two residues were defined by scanning the Cm and Pm libraries to be critical for oligomer formation. Interestingly the two residues are among the residues indispensable for RdRP activity, strongly suggesting that oligomeric interaction might be prerequisite for RdRP activity. 2)Speci fic interaction between NS5B and NS5A was found. The critical regions of the two factors for the interaction were mapped, 3)We found NS5B truncated at C-terminal was enriched in nucleoli. Nucleolin was defined to the interacting factor with NS5B. The NS5B-binding fragments did not affected much RdRP activity, although the interaction affected the subcellular localization of NS5B. 4)We evaluated whether the critical 5 residues for RdRP in vitro are indispensable for HCV replication using MlLE HCV RNA replicon. Actually all the residues are absolutely required for HCV replication. 5)Using HCV replicon harboring mutations of NS5A that are defective in NS5B-binding, we evaluated the role of the NS5A-NS5B interaction in HCV replication. Cm mutants and some Pm mutants within the regions necessary for NS5B-binding could not support HCV replication, strongly suggesting the importance of the inter action. 6)We evaluated the interaction of nucleolin and NS5B in the HCV RNA replicon system. Cm mutant of NS5B defective in nucleolin-binding could not support efficient HCV replication. Transient knock-down of nucleolin with siRNA greatly reduced the G418-forming foci, strongly suggesting that the interaction of nucleolin and NS5B is critical for HCV replication.<br />研究課題/領域番号:14370054, 研究期間(年度):2002-2004<br />出典：「C型肝炎ウイルス(HCV)複製酵素(NS5B)と製御因子NS5Aの機能解析」研究成果報告書 課題番号14370054 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
HCVの持続感染の遮断が肝がん発症のリスクを低下させると期待される。HCVは宿主とは異なるRNA複製過程があり、RNA依存RNA合成酵素(RdRP)であるNS5BはHCV複製遮断の有力な標的である。HCV複製の阻止を目標に、HCVNA5Bの
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構造と機能の検討を行った。我々は、1)集約型と点置換アラニン変異を系統的に導入し、NS5BのRdRP活性に必須である5アミノ酸残基を新たに特定した。RdRP活性には鋳型結合能は要求せず、鋳型/primer結合能を要求した(Hepatol., 2001)。2)NS5Bがhomomericにオリゴマー化することを見い出し、オリゴマーに必須な2残基を特定した。各種置換変異による解析から、この2残基の交換が可能である結果を得た(J.Biol Chem., 2002)。3)NS5BとNS5Aの特異的結合を見い出し、集約型アラニン置換変異NS5Bによる解析から4配列がNS5A結合に必要な領域と限定し、NS5AがNS5BのRdRP活性を修飾することを見い出した(J.Biol.Chem., 2002)。4)ヌクレオリンと全長型NS5Bの膜構造での共局在を見い出した。相互作用はヌクレオリンのC端側の領域と、NS5Bでは2つの領域に限定された。ヌクレオリン結合欠損のNS5Bの変異で、全長NS5Bとヌクレオリンの共局在は観察されなかった(J.Biol.Chem., in press, 2003)。HCV複製の阻害剤開発の新たなデザインとして、NS5Bのオリゴマー化、NS5Aとの相互作用、及びヌクレオリン結合領域が標的となる可能性を示唆した。今後HCVレプリコン系を用いたHCV複製の効果の比較が必要である。<br />As inhibition of HCV replication is expected to reduce or even block incidence of HCV-associated hepatocellular carcinoma, HCV NS5B, aRNA-dependent RNA polymerase, might be a strong target for drug designs to inhibit HCV replication. The main results are followings. 1) 5 residues of NS5B were newly identified to be critical for RNA-dependent RNA synthesis (RdRP) activity. 2)Two residues among them located far from the RdRP catalytic center were specified to be indispensable ones for oligomerization of NS5B. The oligomerization of NS5B was found to be prerequisite to RdRP activity of NS5B by demonstrating that the two residues are residue-specific and exchangeable for oligomerization and RdRP activities. 3)Specific interaction between NS5A and NS5B was characterized, and we found that NS5A can modulate RdRP activity through the direct interaction in vitro. 4) Nucleolin, was found to bind directly to NS5B and affected subcellular localization of NS5B when the C-terminal membrane-attachment domain was truncated. These interaction surfaces of NS5B would be putative targets for drug designs to inhibit HCV replication.<br />研究課題/領域番号:12558084, 研究期間(年度):2000-2002<br />出典：「C型肝炎ウイルスの複製酵素と複製を標的とした阻害剤のデザイン開発」研究成果報告書 課題番号12558084 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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