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原田, 憲一 ; Harada, Kenichi
概要:
原発性胆汁性肝硬変(PBC)は胆管細胞アポトーシスによる胆管消失を特徴とする自己免疫疾患で、病因として細菌感染症の関与が想定されている。我々はヒト培養胆管細胞を樹立し、アポトーシスの分子基盤および自然免疫の関与について解析した。その結果、胆
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管細胞はToll様受容体(TLR)のうち、少なくともTLR1〜TLR6を有していた。また、主要な細菌性のpathogen-associated molecularpatterns(PAMPs)であるリポポリサッカライド(LPS)刺激では有意な細胞死は誘導されなかったが、蛋白合成抑制状熊の胆管細胞では細菌性PAMPsが直接アポトーシスを誘導しうることが示された。さらに細菌性PAMPsに対する抗アポトーシス効果の一つとしてNF一κB依存性のHIAP-1発現亢進が重要であることが示唆された。一方、ウイルス関連のPAMPs(合成2本鎖RNA(Poly I:C))刺激では、転写因子であるNF-κBやinterferon regulatory factor-3(IRF-3)の活性化と共に、アポトーシス誘導分子であるTRAILの発現亢進と胆管細胞アポトーシス誘導が見られた。さらに、TLR4などを介した細菌性PAMPsに対する自然免疫応答は、持続的な刺激にてトレランスが誘導されたが、Poly I:Cに対するトレランスは誘導されず、2本鎖RNAが存在する限り自然免疫応答が持続した。以上の結果より、胆管細胞は自然免疫応答にてアポトーシスによる自らの細胞死を誘導することができ、微生物(特に2本鎖RNAウイルス)の関与が想定されている胆管消失疾患の病態形成に直接関与していることが示唆された。<br />Biliary epithelial cells possess the essential components of the innate immune system consisting of Toll-like receptors (TLRs) which recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) such as lipopolysaccharide (LPS). LPS is known to cause cell injury including apoptosis. We established human intrahepatic biliary epithelial cells (HIBECs) and examined the PAMPs-induced apoptosis in HIBECs. The distinct induction of apoptosis was not found by the treatment with any bacterial PAMPs, but in the condition of an inhibition of NF-KB-dependent protein synthesis, HIBECs undergo apoptosis by PAMPs in the manner of caspase-dependence. In contrast, stimulation with polyinosinic-polycytidylic acid (poly(I:C), a synthetic analog of viral dsRNA) induced the activation of transcription factors (NF-KB and interferon regulatory factor 3) and the production of interferon-β1 (IFN-β1) as potent antiviral responses in HIBECs. Moreover, poly(I:C) up-regulated the expression of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and both poly(I:C) and TRAIL reduced the viability of cultured human HIBECs by enhancing apoptosis. In conclusion, bacterial and viral PAMPs could induce the apoptosis in human biliary epithelial cells as a result of the biliary innate immune response, supporting the notion that biliary innate immunity is directly associated with the pathogenesis of cholangiopathies in biliary diseases such as primary biliary cirrhosis.<br />研究課題/領域番号:18590326, 研究期間(年度):2006–2007<br />出典：「原発性胆汁性肝硬変の胆管細胞アポトーシスにおける自然免疫の関与」研究成果報告書 課題番号18590326 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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笠原, 善仁 ; Kasahara, Yoshihito
概要:
活性酸素のアポトーシスにおける重要性を活性酸素の産生欠如が主病因である慢性肉芽腫症(CGD)患児由来細胞を用い検討し,Fas誘導性アポトーシスにおける活性酸素の意義を検討した。正常ヒト由来細胞は抗Fas抗体の添加によりアポトーシス誘導を受け
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るのに対し、CGD由来細胞は抗Fas抗体の点かによりアポトーシス誘導を受けるのに対し、CGD由来細胞では僅かであった。カタラーゼを添加することにより産生されるH_2O_2を分解すると濃度依存性に抗Fas抗体のアポトーシス増強作用は抑制され,一方、CGD由来細胞をH_2O_2存在下で培養するとFas誘導性アポトーシスの増強が認められた.FasあるいはFasリガンドの遺伝子変異による自己免疫疾患モデル1prgldマウスと類似した肝脾腫リンパ節腫大、汎血球減少,溶血性貧血,高γグロブリン血症等の臨床像を呈するヒト自己免疫性リンパ球増殖症候群の兄妹例においてFas誘導製アポトーシスを解析したところ,患児由来細胞においては全くFas誘導性アポトーシスが認められなかった.Western blot解析にて異常Fas抗原分子が同定され,遺伝子解析の結果,Fas intron7におけるT→C置換により患児由来のFas抗原はdeathdomainを含む細胞内部分を欠如すること,さらにこの遺伝子異常は母親由来であることが判明した.患児及び母親の末消血においてTCRαβ+CD4-CD8-T細胞の増加が認められた.Fas抗原を介したアポトーシスの生体内での免疫学的恒常性における重要性が示唆された.<br />1) The involvement of reactive oxygen intermediates in Fas-mediated apoptosis was investigated using cells from patients with chronic granulomatous disease (CGD) that have no ability of reactive oxygen intermediates production. Although the treatments with anti-Fas antibody induced apoptosis of cells from normal subjects, cells from CGD were resistant to anti-Fas antibody. Catalase significantly inhibited Fas-mediated apoptosis of normal cells, on the other hands hydrogen peroxides induced apoptosis of CGD cells.2) Fas-mediated apoptosis was estimated in two siblings with autoimmune lymphoproliferative syndrome characterized with hepatosplenomegaly, lymphadenopathy, pancytopenia, hyper-gammagloblinemia, which is similar to clinicalmanifestations of lpr or gld mouse that have mutations of Fas or Fas ligand gene. Cells from two patients showed reduced Fas-induced apoptosis and smaller abnormal Fas protein was detected by western blot analysis. The T to C point mutation of intron 7 in patients Fas gene was detected and Fas antigen of patients lacks intracellular portion including death domain by this mutation TCRalphabeta+CD4-CD6- T cells were increased in blood I patients and analysis of family showed that mother has a same Fas mutation. These results indicated significance of Fas-mediated apoptosis in immunological homeostasis n vivo.<br />研究課題/領域番号:08670862, 研究期間(年度):1996-1997<br />出典：「Fas誘導性アポトーシス細胞死における活性酸素の意義」研究成果報告書 課題番号08670862(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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須田, 貴司 ; Suda, Takashi
概要:
1)新鮮ヒト抹消血T細胞は、抗Fas抗体で死なないことから、Fas刺激に非感受性であるとされてきた。しかし我々は、新鮮ヒト末梢血T細胞中のFas陽性分画は、可溶型Fasリガンドには非感受性であるが、膜型Fasリガンドにより傷害されることを見
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出した。興味深いことに、ヒト末梢血T細胞をいったんコンカナバリンAで活性化すると、抗Fas抗体、可溶型、膜型Fasリガンドのいずれにも感受性になった。この結果は、T細胞のFasリガンド感受性は活性化状態により変化することを示すと同時に、膜型と可溶型Fasリガンドは生体内で異なる役割を果たしている可能性を示唆する。2)アロ骨髄細胞と脾細胞移植によるマウス急性致死性移植片対宿主病(GVHD)モデルにおいて、パーフォリンとFasリガンドが関与していること、致死性にはFasリガンドの関与が大きいことをアロ脾細胞のドナーとして、Fasリガンドの突然変異であるgldマウスおよびperforin遺伝子欠損マウスを用いることにより明らかにした。また、急性致死性GVHDを誘導したマウスに抗Fasリガンド中和抗体を投与することにより、著明な延命効果が得られた。3)Fasリガンドが好中球に富む炎症細胞(腹腔浸出細胞)に対し、アポトーシスと同時にIL-1βconverting enazyme(ICE)非依存性にIL-1βの活性化と放出を誘導し、炎症を促進することを見出した。このFasリガンドの炎症誘導活性は膜型Fasリガンドにより媒介され、天然の可溶型Fasリガンドにはそのような活性は検出されなかった。<br />1) It has been said that freshly isolated human peripheral blood T (hPBT) cells are resistant to Fas-mediated apoptosis, because they are resistant to anti-Fas antibody treatment. However, we found that the Fas positive fraction of hPBT is killed by the membrane-bound form but not the soluble form of Fas ligand (FasL). While, hPBT activated by concanavalin A in vitro became sensitive to both membrane-bound and soluble FasL. Thus, FasL-sensitivity of T cells changes depending on a activation status of T cells, and that membrane-bond and soluble FasL may play distinctive roles in animals.2) Using a murine models of acute graft-versus-host disease (GVHD) after allogeneic bone marrow transplantation, we demonstrated that both FasL and perforin, the major effector molecules of cytotoxic T lymphocytes, are involved in this disease, and that FasL rather than perforin was associated with lethality. Administration of FLIM58 reduced the weight loss and mortality caused by GVHD. Our results demonstrated that neutralizing agents for FasL are therapeutic for lethal GVHD.3) We demonstrated that Fas ligand (FasL) introduced in tumor cells induces a massive infiltration of neutrophils, when the tumor cells are transplanted in peritoneal cavity of syngeneic mice. We also found that the FasL induces in inflammatory cells activation and release of IL-1β, which can explain the inflammatory activity of FasL. In addition, IL-1β converting enzyme (ICE), which is essential for LPS-induced IL-1β activation is not essential for the FasL-induced one. This activity was found to be mediated by membrane-bound but not natural soluble Fas ligand.<br />研究課題/領域番号:10470090, 研究期間(年度):1998-1999<br />出典：「Fasリガンドの生理的、病理的役割の解析」研究成果報告書 課題番号10470090 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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向田, 直史 ; Mukaida, Naofumi
概要:
1)原癌遺伝子Pim-3に関する研究マウス肝癌発癌モデルにおける前癌と癌病変を、ディファレンシャル・ディスプレイ法を用いて解析した結果、正常肝組織では発現が認められない、セリン/スレオニン・キナーゼ活性を保有する原癌遺伝子Pim-3の発現が
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選択的に亢進していることを見出した。ヒト肝癌組織でも同様にPim-3の発現の亢進を認めた。さらにヒト肝癌細胞株でPim-3の恒常的な発現が認められた上に、Pim-3発現をsiRNA法にて抑制すると、肝癌細胞株のアポトーシスが誘導された。Pim-3は、肝臓のみならず、膵臓・大腸などの内胚葉由来臓器でも正常状態では発現が認められないのに対して、これらの臓器の前癌から癌病変部位において発現が亢進していた。ヒト膵癌細胞株ならびにヒト大腸癌細胞株においても、Pim-3の恒常的な発現とともに、好アポトーシス分子であるBadが112番目のセリン残基がリン酸化された不活型として存在している上に、Pim-3と共局在していた。Pim-3の発現をsiRNA法にて抑制すると、Badの112番目のセリン残基のリン酸化が減弱するとともに、抗アポトーシス分子であるBc1-XLの発現も低下し、細胞のアポトーシスが誘導された。以上の結果から、Pim-3は肝臓・膵臓・大腸などの内胚葉由来臓器においてアポトーシスを抑制することによって癌化に関与していること、さらに癌化に伴って発現が亢進するがんマーカーとしての挙動を示すことも示唆された。2)ケモカインの癌の進展・転移過程での役割の解析ジエチルニトロサミン投与による肝癌発症モデルでは、発癌の初期過程で、CCL3-CCR1系が抑制的に働くのに対して、後期では血管新生を誘導することで促進的に働くことを見出した。さらに、肝転移モデルでは、CCL2-CCR2系がIto細胞の活性化→血管新生を促進することで、肝転移を促進することを見出した。<br />1)Aberrant expression of a proto-oncogene with serine/threonine kinase activity; Pim-3, in malignant lesions of endoderm-derived organs. We compared gene expression patterns in pre-malignant and malignant lesions in murine hepatocarinogenesis model, by using fluorescent differential display method. As a result, we observed that a proto-oncogene with serine/threonine kinase activity, Pim-3 was aberrantaly expressed in pre-malignant and malignant lesions, but not normal hepatic tissues. Similar observations were obtained also on human hepatocellular carcinoma (HCC) and normal liver tissues. Pim-3 was constitutively expressed in human HCC cell lines and the inhibition of Pim-3 expression by short interfering RNA induced the apoptosis of human HCC cell lines. Pim-3 was not detected in other endoderm-derived organs such as pancreas and colon, but its expression was enhanced in the pre-malignant lesions and malignant lesions of these organs. In both human pancreatic cancer and colorectal can cer cell lines, Pim-3 was constitutively expressed and a pro-apoptotic molecule, Bad was co-localized with Pim and was phosphorylated at 112-Ser, which represents its inactive form. The inhibition of Pim-3 expression by short interfering RNA reduced the phosphorylation of Bad at 112-Ser and the expression of an anti-apoptotic molecule, Bcl-XL and eventually enhanced the apoptosis. These observations suggest that aberrant expression of Pim-3 can contribute to carcinogenesis in endoderm-derived organs, including liver, pancreas, and colon, by inhibiting apoptosis and that Pim-3 can be a novel tumor marker to detect pre-malignant and malignant lesions of these organs.2)Roles of chemokines and hepatocarcinogenesis and liver metastasis We observed that a chemokine, CCL3 and its receptor, CCR1, can inhibit the carcinogenesis in the early phase of murine hepatocarcinogenesis induced by diethylnitrosamine administration but that the CCL3-CCR1 axis can promote carcinogenesis of the same hepatocarcinogenesis, by inducing angiogenesis. We further demonstrated that another chemokine, CCL2 and its receptor, CCR2, can promote liver metastasis by activating hepatic stellate cells (Ito cells) and eventually accelerating neovascularization.<br />研究課題/領域番号:16390163, 研究期間(年度):2004-2006<br />出典：「微小転移巣での発現遺伝子群の包括的解析に基づく、新規がんマーカーの検索」研究成果報告書 課題番号16390163 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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大熊, 勝治 ; Ohkuma, Shoji
概要:
本研究は、新規H^+/CΓシンポーターであるプロジギオシン類のアポトーシス誘導機構解明に当たり、これまで殆ど注目されてこなかったオートファジーの役割を、体細胞遺伝学的・分子生物学的に明らかにしようとした。先ず、(1)プロジギオシン類のアポト
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ーシス誘導機構を、オートファジーに注目して解明、動物細胞オートファジー関連遺伝子の同定を目指し、(2)CHO細胞を用いてオートファジー突然変異体を単離、(3)酵母オートファジー関連遺伝子の動物細胞ホモローグを単離、(4)オートファジーに伴って発現量の変動する遺伝子・蛋白資を同定。動物細胞オートファジー関連遺伝子が単離された暁には、(5)アポトーシスに伴うオートファジー関連遺伝子の動態を解明、(6)アポトーシスにおけるオートファジー関連遺伝子機能を、トランスフェクタント(ドミナント・ネガティブ体の強制発現等を含む)作成を通じて解明。平行して、(7)各種癌細胞に対する、H^+/Γシンポーターのアボトーシス誘導型制癌剤の可能性を追及、した。先ず、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いて、Wortmannin,3-methyladenine他の各種選択的阻害剤を用いて解明する系を確立した。次に"プロジギオシン類H^+/CΓシンポーターの、オートファジー・アポトーシス制御における働きを、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いて、蛍光を指標として生化学的・細胞生物学的に解析した。同時に、細胞内pH測定を通じて、H^+/Cγシンポーターのどのような活性が関与するかを解析した。その結果、PC12細胞の分化誘導とアポトーシス誘導にはオートファジー自体は関与していないことが示唆された(日本薬学会発表)。また、体細胞分子遺伝学的にオートファジー変異体の単離を目指して、CHO細胞を用いて実験系を確立した。今後、(毒素等を利用した)細胞生存率と、強制発現させたGFP蛋白質の分解異常を指標とし、フローサイトメトリー・セルソーター法を主に使い、動物細胞のオートファジー変異体を選択したい。リソソーム膜融合反応に必要なシンタキシン・ホモローグの単離・同定には成功しているが、それがオートファゴソームとリソソームの膜融合に必須であるか否かは決定出来ていない。酵母遺伝子のヒトホモログ釣りは成功し、オルガネラをGFP標識したCHO細胞を用いてドミナントネガテイブ体を作成し、その遺伝子産物の動物細胞オートファジーにおける役割を解明した(投稿準備中)。また、一次元・二次元電気泳動法等を用いて、オートファジーに伴い量的に変動する蛋白質を単離・同定。現在、各種処理で誘導されるタンパク質に差を見い出している(投稿準備中)。更に、種々の合成化合物について、H^+/CΓシンポーターとして満たすべき構造を検討している。ヌードマウスに移植した膵癌由来細胞に対して、プロジギオシン類似体H^+/CΓシンポーターも制癌効果を示すことを見い出している(投稿準備中)。<br />In this project, we have investigated the role of autophagy in the induction of neurite outgrowth (NOG), growth inhibition and apoptosis by a new type of H^+/CL^- symporting antibiotics like prodigiosins.We found the followings: (1) Prodigiosins, like bafilomycins, inhibited pancreatic cancer transplanted into nude mice. (2) Prodigiosins also induced apoptosis and NOG in RNA_-, protein-syntheses, and serine/threonine kinase-dependent manners, and K_-252_<a-> or A_-kinase-independent manners, but induced apoptosis differently from NOG in its in-sensitivity to tyrosine phosphates inhibitors. (3) E-58591, a prodigiosin-like tambjamine antibiotics, also showed H^+/CL^- symport activity and strongly inhibited spleen cell immune responses, gastric acid secretion and inhibited osteoclastosis and induced NOG at higher concentrations. (4) We have succeeded in the synthesis of affinity probe for concanamycins (analogs of bafilomycins) and showed concanamycin-induced NOG from outside of plasma membranes. (5) 3-Methyladenine, and inhibitor against autophagy, did not induce apoptosis in the presence of serum, suggesting little participation of autophapy on the bafilomycin-induced apoptosis. (6) We isolated human-homologs of autophagy-related genes from HeLa cells. They showed cell death of CHO in the absence of amino acid- or serum-free medium. (7) We established a system to look into degradation of GFP-labeled organelles (mitochondria and peroxisomes). (8) We showed that apoptosis and NOG was not induced by pH-differences between inside and outside of cells, because they were not induced by NH_4Cl. (9) Prodigiosins also strongly and reversibly uncoupled (H^+/K^+) ATPase-dependent proton-translocation from rabbit gastric mucosa. (10) We have succeeded in the cloning, proton pump-dependent ATP synthesis, and determation of operon structure of V-ATPase from a eubact rium (Thermus termophilus).<br />研究課題/領域番号:11470483, 研究期間(年度):1999-2001<br />出典：「新規H^+/Cl^-シンポーターによるオートファジー・アポトーシス制御機構」研究成果報告書 課題番号11470483(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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大熊, 勝治 ; Ohkuma, Shoji
概要:
本研究では,バフィロマイシン類やプロジギオシン類等の、空胞系プロトンポンプ(V-ATPase)を阻害する物質による,細胞の増殖阻害、分化・アポトーシスの誘導機構等を明らかにするともに、細胞増殖阻害と分化・死誘導に必須な構造、並びにプロトン輸
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送阻害機構の解明を目指している。先ず、バフィロマイシン類は神経突起伸展(NOG)とともにアポトーシスを誘導するが、情報伝達経路は両反応で異なっており、両反応とも新たなRNA合成及び蛋白質合成を必要とし、MAPキナーゼ/セリン・スレオニンフォスファターゼ、チロシンキナーゼに依存し、一方K-252a阻害されず、A-キナーゼに非依存性であるが、アポトーシス誘導はチロシンホスファターゼ、アラキドン酸カスケード、カルモジュリンキナーゼ等に非依存性である点で、NOG誘導と異なっていた。しかし、in vivoでは空胞系プロトン・ポンプを阻害するプロジギオシンや、tambjamineグループのBE-18591もH^+/Cl^-シンポート活性を示し、かつNOGやアポトーシス誘導活性があるが、H^+/Cl^-シンポート活性で一律に説明することは出来なかった。と言うのは、H^+/Cl^- symporter活性を示すtetrapyrroleは、増殖阻害・細胞死誘導作用はあるがNOG作用は示さなかったからである。また、V-ATPase阻害剤によるPC12細胞のNOG、アポトーシス誘導、細胞増殖阻害活性等にpHは関係していない。というのは、NOG誘導活性のないデストラキシンBもデストラキシンEと同様にリソソームのpHを上昇させるからである。なお、プロジギオシンもヌードマウスに移植した癌細胞の増殖を抑制する。一方、バフィロマイシン類は移植血管細胞の増殖をも阻害することを発見した。このことは、動脈硬化発現にプロトン・ポンプが関係していることを示唆しており、興味深い。一方、真性細菌である高度好熱菌V-ATPaseの遺伝子を同定することが出来た。operon構造を取ってい研究しやすいので、今後、この系を使ってV-ATPaseのプロトン輸送機構等を明らかにしたいと考えている。現在、V-ATPaseの回転について検討中である、なお、プロトン・ポンプ阻害活性のある「コンカナマイシン結合フォトアフィニティープローブ」の作成についに成功した。コンカナマイシン結合タンパク質の同定が可能になったので、今後、同じ原理で「コンカナマイシン結合アクリルアミド結合体」等を合成し細胞内に入らないことを確認した上で、細胞膜に作用してこのような効果が出るのか否かを確認したい。なお、プロジギオシン類はブタ胃粘膜の(H^+-K^+)ATPaeのプロトン・ポンプ活性をも可逆的に阻害することを発見している。<br />In this project, we have investigated the mechanism of incuction of neurite outgrowth (NOG), cell differentiation, growth inhibiton and apoptosis by inhibitors against V-ATPases, such as bafilomycin, concanamycins and prodigiosins, and the mechanism of proton transport in V-ATPases.We found that (1) V-ATPase inhibitors like bafilomycin induced apoptosis and NOG in new RNA-, protein-syntheses, and serine/threonine kinase-dependent mannaer, and K-252a- or A-kinase-independent manner, but they are different from each other : apoptosis-induction is different from NOG-induction in its insensitivitiy in tyrosin-phosphatase, arachidonate-cascade or Calmodulin-kinase independent manner, (2) apoptosis and NOG are also induced by prodigiosins but they are not induced by its H^+/Cl^- symporting activities, and (3) apoptosis or NOG is not induced by pH-differences between inside and outside of cells, because they are not induced by NH_4Cl, (4) We have succeeded in the synsesis of concanamycin A-photoaffinity probes active in V-ATPase-inhibition. (5) Prodigiosins are H^+/Cl^- symporters that uncoupled ATPases like F-, V-, P-ATPase and electron transport activity, in which prodigiosins inhibited proton-transport but no ATP hydrolysis (or electron transport) activiteis. Prodigiosins also strongly and reversibly uncoupled (H^+/K^+) ATPase-dependent proton-translocation from hog gastric mucosa. (6) We have succeeded in the cloning, proton-pump dependent ATP synthesis, and determation of operon structure of V-ATPase from a eubacterium (Thermus termophilus).<br />研究課題/領域番号:10557221, 研究期間(年度):1998-2000<br />出典：「V-ATPase 阻害剤をリード化合物とする細胞死誘導型新規制癌剤の探索」研究成果報告書 課題番号10557221(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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大熊, 勝治 ; Ohkuma, Shoji
概要:
我々は、細胞の増殖・分化・アポトーシスに対する空胞系酸性顆粒の寄与を,bafilomycin A_1の他、プロジギオシン類やデストラキシン等の空胞系プロトンポンプ阻害剤を用いて明らかにするとともに、これら阻害剤のプロトン輸送阻害機構の解明を
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目指した。その結果、(1)デストラキシンBとEは、ともにリソソームのプロトンポンプを阻害し、リソソーム内pHを上昇させたが、PC12細胞の分化誘導作用はデストラキシンEにのみ認められた。(2)プロジギオシン類は、そのH^+/Cl共輸送活性によりプロトンポンプを脱共役する、新規H^+/Cl symporterであることを初めて明らかにすることが出来た。また、(3)bafilomycin A_1同様、ブロジギオシン類も神経突起伸展(NOG)を誘導することを発見した。(4)そこで、両プロトンポンプ阻害剤によるNOG誘導作用の特徴を検討したところ、ともに新たなRNA及び蛋白質合成を必要とし、MAPキナーゼ、セリン・スレオニンホスファターゼ、チロシンキナーゼ、チロシンホスファターゼ、カルモジュリン、ホスフォリパーゼA_2依存性であるが、trkチロシンキナーゼやAキナーゼには非依存性である等、両情報伝達経路は酷似していることが判明した。(5)また、tambjamineグループのBE-18591もH^+/Cl symporter活性を示し、免疫抑制や、NOG・アボトーシス誘導作用を示すことを見い出した。(6)ところが、同じH^+/Cl symporterでも、tetrapyrroleは増殖阻害・細胞死誘導作用はあるがNOG作用は示さなかった。以上の結果より、pH変化やプロトンポンプ活性自身は、少なくともNOG誘導の直接の引き金にはなっていないと結論した。<br />In this research project, we have studied the machanism of (1) inhibition of cell growth, (2) induction of cell differentiation, and (3) induction of apoptosis, by V-ATPase inhibitors like bafilomycins, prodigiosins and destruxins, as well as the mechanims of inhibition of proton translocation by these inhibitors.We found (1) that both destrauxin-B and -E inhibited lysosomal proton pump, but only destruxin-E induced induced neurite out growth (NOG) of PC12 cells., (2) that prodigisins uncoupled various proton pump activities due to their H ^+ /Cl symport activity, (3) that prodigiosins, like bafilomycin A ^<1'> induced neurite out growth (NOG), and (4) that the prodigiosin-induced NOG, like bafolomycin-induced one, required de novo synthesis of new messenger RNA as well as protein synthesis, was sensitive to the inhibitors of MAP kinases, serine/threonine phosphatases, tyr-kinases, tyr-phosphatases, calmidulin and phospholipase A ^<2' > but resistant to inhibitors of trk tyrosine kinase and protein kinase A.BE-18591, a tambjamine group antibiotics, also behaved as H ^+ /CU symporters and inhibited hog gastric proton pump, inhibit *cid secretion by gastric parietal cells, inhibited osteoclast differentiation, suppressed proliferation of immune lymphocytes, and induced both NOG and apoptosis, suggesting that the variety of biological activities displayed by these H ^+ /C1 symporters may be due to their H ^+ /C1 symport activity. However, tetrapyrrole, another H ^+ /CV symporter, did not induced NOG.From these results, we conclud that the effect of V-ATPase inhibitors on the intracellular pH does not participate in the variety of biological activities (including induction of NOG) displayed by these compounds.<br />研究課題/領域番号:09672220, 研究期間(年度):1997-1998<br />出典：「V-ATPase 阻害剤による分化・細胞死誘導機構」研究成果報告書 課題番号09672220 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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白土, 明子 ; Shiratsuchi, Akiko
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />生体内で生じた除去すべき細胞にはアポトーシスが誘導され,食細胞による食食により生体から排除される。また,細菌やウイルス,およびこれらに感染細胞も食細胞の攻撃で排除される。本研究は,1)精巣セルトリ細胞
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による精子形成貪食が導く精子形成支持機構,2)Toll様受容体の病原微生物排除への役割の解明,そして3)インフルエンザウイルス感染細胞のマクロファージによる貪食の意義の解明を目的として行われ,以下の成果を得た。1)貪食を行ったセルトリ細胞が産生する精子形成支持因子の解析:ラットセルトリ細胞のプロテオーム解析より精子形成支持因子候補タンパク質を同定した。この分子が貪食依存に遺伝子転写レベルで発現誘導されることを見いだすとともに,セルトリ細胞で選択的に遺伝子欠損させたノックアウトマウスを作成中であり,精子形成進行への役割が解明される。2)Toll様受容体を介する細菌感染時の細胞性自然免疫調節:マクロファージに貪食された黄色ブドウ球菌は,TLR2-JNK経路の活性化を介して活性酸素産生を抑制し,宿主免疫を逃れて生き延びることを見いだした。これは,宿主免疫系を利用した微生物の生き残り戦略と考えられる。3)インフルエンザウイルス感染細胞によるマクロファージ活性化因子の産生:ヒトインフルエンザウイルス感染細胞は,アポトーシスに依存して,マクロファージの貪食能を活性化する因子を産生することを見いだした。この因子はタンパク質性であるが,新たなタンパク質合成を必要とせずに作り出されるとわかった。<br />1) Mechanism and role of SR-BI-mediated apoptotic spermatogenic cells by Sertoli cells in the testis. After phagocytosis of apoptotic spermatogenic cells, testicular somatic Sertoli cells produced unknown factor(s) by which spermatogenic cells could differentiate into spermatozoa. To identify the factor, we selected one candidate protein by proteome analysis of Sertoli cells and identified its primary structure. We found that the expression of the factor was stimulated in transcriptional level during phagocytosis. We have been generating knockout mice of the factor, and we are going to examine the role of the factor on spermatogenesis in mice.2) Role of TLR-JNK pathway on bacterial survival in macrophages Staphylococcus aureus induced JNK phosphorylation in mouse peritoneal macrophages depending on toll-like receptor TLR2. This activation of INK pathway caused inhibition of superoxide production in the macrophages, and this allowed engulfed S. aureus to survive in the macrophages.3) Role of phagocytosis of influenza virus-infected cells by macrophages Influenza virus-infected cells produced macrophage-activating factor that enhance macrophage phagocytosis of virus-infected cells depending on both virus infection and apoptosis. This factor would be heat-labile material since it lost the activity after heat-treatment.<br />研究課題/領域番号:18570123, 研究期間(年度):2006 – 2007<br />出典：「食細胞による死細胞および微生物の貪食機構と意義」研究成果報告書 課題番号18570123（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-18570123/185701232007kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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| 9.
論文 |
論文
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立花, 修 ; Tachibana, Osamu
概要:
金沢大学医学部<br />神経膠芽腫の壊死巣は大壊死巣(large necrosis)と小壊死巣(pseudopallisading)に分類される。本腫瘍における異なる壊死巣の機序が同定できれば、これを利用した治療の開発に結び付く可能性が考
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えられる。2種類の壊死巣形成機構とdeath receptor/death ligandの解析により、この機序を利用して治療に結び付けることを目指し、壊死原因遺伝子の解析をおこなった。神経膠芽腫の手術摘出材料10例において、小壊死巣と大壊死巣をそれぞれ認める5例づつを選び、壊死誘発遺伝子発現細胞の局在をTUNEL法、免役組織化学療法を用いて検討した。あわせて、RT-PCR法を用いて、TRAIL、DR4、DR5、DcR2、DcR3のmRNAの発現を検討した。抗体はFADD、Fas-L、TRAIL、DR4、DR5、DcR1、DcR1、DcR2、プロカスパーゼ3、活性型カスパーゼ3、プロカスパーゼ9、チトクロームCおよびPARPに対する抗体を使用した。結果はFADD、Fas-L、TRAIL、チトクロームCおよびPARPが全症例において、壊死巣とは関係なく大部分の腫瘍細胞に発現がみられた。DR4は血管内皮細胞に発現がみられた。DcR1、DcR2、プロカスパーゼ9は一部の症例で腫瘍細胞に発現がみられた。DR5は大壊死巣の周囲の腫瘍細胞に発現がみられ、プロカスパーゼ3および活性型カスパーゼ3は小壊死巣の周囲の細胞に発現がみられTUNEL陽性のアポトーシスをきたした細胞と使い関係を示した。DR5とTRAIL発現細胞の局在は、FasとFas-Lの局在の関係と極めて類似していた。小壊死巣におけるカスパーゼ3、特に活性型の発現は、本形態学特徴と極めて強い関係を示した。以上より、神経膠芽腫の組織学特徴である小壊死巣と大壊死巣は、異なった機構により発生すると考えられた。すなわち、大壊死巣は周囲の腫瘍細胞がdeath receptroであるFas、DR5を発現しており、小壊死巣はカスパーゼ3の活性により特徴づけられるものと考えられた。<br />In the present study, I assesed the expression of death receptor, including Fas/APO-1 (CD95), DR4, and DR5, death ligand (Fas ligand, TRAIL), and decoy receptor, and its relation to necrosis phenotype in glioblastomas. I previously reported that Fas expression is predominantly induced in perinecrotic glioma cells, suggesting that Fas induction is associated with apoptosis and necrosis formation, a histological hallmark of glioblastomas. In this study, DR5 expression is induced in large necrosis, like Fas expression. Fas L and TRAIL were expressed in glioblastoma cells. Caspase-3 overexpression and activated appears to correlate with small necrosis area. These results suggested that necrosis phenotype in glioblastoma were different cell death pathway, and small necrosis was dependent to caspase-3 activation and large necrosis dependent to death receptors.<br />研究課題/領域番号:10671288, 研究期間(年度):1998 – 1999<br />出典：「ヒト悪性神経膠腫における壊死誘発遺伝子標的治療の基礎的研究」研究成果報告書 課題番号10671288（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-10671288/106712881999kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作成
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| 10.
論文 |
論文
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西條, 清史 ; Saijoh, Kiyoshi
概要:
中枢神経の特定の核に局在する蛋白がなぜその核に局在するのか,或いはどのような条件下で局在が起こるのかを検索した。アデノシン受容体サブタイプのうちA2Aが上丘に局在することで視覚入カを増強する形で制御されていること,近年中枢神経の生存促進因子
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であることが報告されたセレノプロテインPの遺伝子構造を解析し,発現調節に重金属関連転写因子や,インターフェロン関連転写因子を始めとする炎症関連因子が関わっていること,実験的近視眼では近視進展にともない一酸化窒素合成酵素mRNAの特定のサブタイプにのみ発現抑制が観察されること,神経組織以外でも線維芽細胞が骨芽細胞化することで硫酸トランスポーターに遺伝子発現の変化が生じることや被虐待児症候群患児において免疫担当細胞の機能低下が起こっていることなどを報告した。さらに,神経中毒を引き起こすような化学物質の影響を評価するために,実際の作業現場での健康影響を評価する一方,アルキル化酢酸の膜流動性変化に対する構造活性相関を明らかにし,ニトリル化合物が特定の神経細胞にアポトーシスを誘導することを見出し,ニトリル中毒時の行動異常発生機序の一部を明らかにした。現在アポトーシス力スケードのどの部位が標的であるかを検索中である。このことは分子生物学的なアプローチが産業衛生を実践していくうえでも有効であることを示しており,今後とも社会医学への貢献の基盤としたい。さらに,このようなアプローチは神経研究のみに有効なばかりでなく,癌特有の遺伝子発現を知るためにも有用であり,多段階発癌機構を明らかにしたり,癌悪性度の評価や腫瘍マーカーの検索に利用できると考え応用を試みている。<br />In order to elucidate the mechanisms why gene expression was regulated not only in a region-specific manner but also in a stimuli-specific manner, gene regulation of several proteins which were enriched in specific brain region was examined. Adenosine receptor subtype A2a was enriched in superior colliculs and its activation caused enhancement in visual input. Analysis of gene structure of selenoprotein RHO.which was recognized to be a survival elongation factor of neuron, displayed that its expression was regulated by metal-responsive-elements, interferon-related-elements, etc. Form-deprivation myopia caused differential regulation in nitric oxide synthase (NOS) gene in retina, namely, down regulation in iNOS and bNOS mRNAs but not F in eNOS mRNA.Aside from neurons, alteration in gene regulation was investigated, i.e., diastrophic dysplasia su1fate transporter was cloned because it was up-regulated in association with osteoblastic differentiation, while MHC-II antigens were down-regulated in lymphocytes of abused children. On the other hand, such molecular biological approach was applied to occupational health, especially, in order to elucidate neuronal toxicity of several chemicals. Anesthetic activity of alkyl acetates were associated with their hydrophobicity, namely their availability to change membrane fluidity. In case of nitriles which displayed neuronal toxicity, including behavioral abnormality, their toxicity involved in apoptosis to specific neurons. We are now investigating which apoptotic cascade is a major target to nitriles. Moreover, we are applying such approach to investigation in cancer-specific gene expression in order to clarify the mechanism of cancer progression, to estimate malignancy of each cancer, etc.<br />研究課題/領域番号:09670353, 研究期間(年度):1997-1998<br />出典：「中枢神経に局在する蛋白の遺伝子発現を司る核蛋白の同定と機能解析」研究成果報告書 課題番号09670353 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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