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白土, 明子 ; Shiratsuchi, Akiko
概要:
生体内で不要または有害となった細胞にはアポトーシスが誘導され,このような細胞は食細胞による貪食により生体から排除され,個体の恒常性が保たれている。本研究では,以下の課題について成果を得た。SR-BIを介したセルトリ細胞による精子形成貪食反応
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機構と意義アポトーシス細胞を認識したセルトリ細胞内では,MAPキナーゼp38およびERKI/IIを介する情報経路がSR-BIを介して活性化した。両経路の同時抑制により,セルトリ細胞のアポトーシス細胞およびホスファチジルセリン取込のどちらも顕著に抑制された。これより,SR-BIは細胞内情報伝達を導く貪食受容体であると示され,SR-BIを介する貪食反応にはMAPキナーゼ活性が必要と考えられた。インフルエンザウイルス感染細胞貪食の病態生理学的役割マウスに順化させたヒトA型インフルエンザウイルスをマウスに感染させると,肺組織内で感染アポトーシス細胞が食細胞に貪食されるとわかった。貪食阻害剤共存により生存率低下と炎症増加がおこると判明した。細胞貪食は,インフルエンザウイルスに対する防御に機構であることが,初めてin vivo解析で示された。貪食胞とリソソームとの融合調節機構マクロファージ内に取り込まれた標的を含む貪食胞はリソソームと融合し,標的はリソソーム内酵素群により分解される。本研究では,貪食胞とリソソーム融合を調節する細胞内情報伝達経路を探った。その結果,貪食時にMAPキナーゼ経路のp38とERKI/IIが活性化され,両者により貪食胞のリソソームへの融合が抑制されるとわかった。<br />1) Mechanism and role of SR-BI-mediated apoptotic spermatogenic cells by Sertoli cells in the testisAfter binding of phosphatidylserine on the surface of apoptotic cells, SR-BI in Sertoli cells induces phhosphorylation of MAP kinase p38 and ERKI/II. In the presence of inhibitors for p38-pathway and ERK-pathway, phagocytosis of apoptotic cells by Sertoli cells was inhibited greatly. These results showed that SR-BI, when it binds to phosphatidylserine, transmits signals to activate MAP kinase pathway, which leads to the induction of the engulfment of phosphatidylserine-exposing apoptotic cells by phagocytic cells.2) Role of phagocytosis of ineluenza virus-infected cells by phagocytesIn the lung of influenza virus-infected mice, virus-infected cells were shown in both neutrophils and alveolar macrophages. Administration of the phagocytosis inhibitors into the lung caused both the lethality in mice and the extent of inflammation in the lung were augmented in those mice. These results suggest that phagocytosis of virus-infected cells helps suppress the progress of influenza in mice.3) Regulation of phagosome-lysosome fusionMAP kinase p38-pathway and ERK-pathway were activated in macrophages after incubation with apoptotic cells, and the activity seemed to be needed to phagosome-lysosome fusion in macrophages.<br />研究課題/領域番号:16570112, 研究期間(年度):2004-2005<br />出典：「細菌貧食による要除去細胞排除の分子機構と生理学的意義」研究成果報告書 課題番号16570112 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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岡本, 成史 ; Okamoto, Shigefumi
概要:
金沢大学医薬保健研究域保健学系<br />インフルエンザAウイルス（IAV)と肺炎レンサ球菌などのレンサ球菌との複合感染は、その感染症を重症化させることが知られている。一方、病原性が弱い細菌と考えられている口腔レンサ球菌も病原性の強い他のレ
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ンサ球菌とゲノム相同性が高いことが知られ、口腔レンサ球菌とIAVとの複合感染による病原性が重症化の可能性が考えられる。本研究では、インフルエンザウイルスと口腔レンサ球菌のひとつであるStreptococcus sanguinis との複合感染により肺炎による症状の重症化が認められることを明らかにし、その原因としてIAV感染細胞でのgp96発現上昇とそれによる細菌の細胞への付着能増強が示唆された。<br />Superinfection with influenza A virus (IAV) and streptococci such as Streptococcus pneumoniae is known to cause severe infection. On the other hand, it is known that oral streptococci considered to be a low-pathogenic bacteria have high genomic homology with other pathogenic streptococci, thus, it is possible that superinfection with oral streptococci and IAV leads to invasive infections.In this study, we showed that superinfection with IAV and one of the oral streptococci, Streptococcus sanguinis occurs severe pneumonia. It is suggested that the severe disease is caused that the enhanced gp96 expression in IAV-infected alveolar epithelial cells induces enhanced adhesion of S. sanguinis to the IAV-infected cells.<br />研究課題/領域番号:26462806, 研究期間(年度):2014-04-01 - 2017-03-31
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榎並, 正芳 ; Enami, Masayoshi
概要:
NS1蛋白に欠損を持つ遺伝子組み換えウイルスを作成し感染細胞で解析した。dl12は、N端付近の12残基を欠失するが、温度感受性となり感染後期にすべてのウイルス蛋白の翻訳が特異的に阻害された。N110はC端側52%を欠失するが、後期蛋白の翻訳
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だけが特異的に阻害された。N110のNS1は核外輸送に欠損を持っていた。WSN株NS1蛋白に加え、N端110残基(N110)、C端190残基(C190)、及び66-77残基目の欠損(d112)蛋白を大腸菌で発現・単離した。NS1蛋郷はA,、C-、及びG-キナーゼを用いてリン酸化した。ウサギ網状赤血球ライセートにウイルス感染細胞から精製したmRNAを添加、in vitroの翻訳に於けるNS1蛋白の機能を解析した。wt-NS1はin vitro翻訳系でNPとM1の翻訳を強く促進し、NS1の翻訳は弱く促進した。いずれのキナーゼもNS1蛋白をリン酸化したが、リン酸化により翻訳促進活性は有意に増加した。N110-NS1蛋白はin vitroで翻訳を促進し、C190-NS1蛋白は翻訳促進活性が欠損していた。NS1のN端側131残基及び151残基の下流に自己切断活性を持つ17残基の2Aプロテアーゼ配列を挟んでCAT遺伝子を挿入したNS2ACATウイルスを作成した[NS(131)2ACAT及びNS(151)CAT]。NS(131)2ACATウイルスは非温度感受性で、NS(151)CATウィルスは温度感受性となり、マウスに対して高度に弱毒化された。感染細胞内ではNS1とCATの融合蛋白を発現した後、直ちに自己切断され成熟型蛋白となった。感染24時間後にはCAT蛋白の50%が培養上精中に検出された。マウス肺ではウイルスの僅かな複製とCATの発現が確認され、血中1gG抗体価の僅かな上昇が見られた。当該ウイルス感染マウスは、致死量のWSNウイルス感染に対し完全に感染防御がみられた。<br />Influenza virus NS1 protein stimulates translation of some viral proteins in vivo, Interaction among the NS1 protein, host translational initiation factors, and 5'-UTR of viral mRNA may be involved in this regulation. The NS1 protein is a phosphoprotein, however, it is not clear whether the phosphorylation is required for this activity.We have obtained some NS1 mutant viruses using our reverse genetic system. Characterization pf these viruses indicated that dl12, which deletes 12 residues near N terminus of the NS1 protein, showed temperature-sensitive phenotype and the translation of all viral proteins was interfered. N110 virus, which deletes 52% of the C-terminus of the NS1 protein, has defect in the translation of the late viral proteins. We have also analyzed the phosphorylation in the virus-infected cells by using several protein kinase inhibitors. However the phoshorylation of the NS1 protein was not significantly interfered in that system.We have then analyzed the phosphorylati on of the NS1 protein in vitro using purified A-, C-, or G-kinases. The NS1 protein was obtained by expression from plasmid DNA in E. coli and followed by affinity purification. Translational regulation by the NS1 protein was analyzed using rabbit reticulocyte lysate system in vitro. In this experiment, mRNAs were purified from WSN virus-infected MDBK cells. The NS1 protein was phosphorylated by either A-, C-, or G-kinases in vitro. Unphosphorylated NS1 protein was shown to stimulate the translation of the M1 and NP proteins. In addition, phosphorylation of the NS1 protein significantly stimulated this activity, indicating that the phosphorylation of the NS1 is not essential but important for the regulation. Relatively lower effect was observed for the translation of the NS1 using this system. We have then analyzed the NS1 mutants. The N110 NS1 was shown to stimulate the translation in vitro. C190 NS1, which deletes N-terminal 40 residues, has defect in that activity. These data together indicates that N-terminal110 residues has the functional domain enough for this activity.<br />研究課題/領域番号:10470075, 研究期間(年度):1998-2001<br />出典：「インフルエンザウイルスNS1、NS2蛋白のウイルス工学的、細胞生物学的研究」研究成果報告書 課題番号10470075(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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榎並, 正芳 ; Enami, Masayoshi
概要:
(1)インフルエンザウイルスNS遺伝子変異株を利用したインフルエンザウイルスベクター系を開発した。当該ベクター系に、CATレポーター遺伝子、HIV-1 gp41及びnef遺伝子、結核菌antigen 85A遺伝子等の導入を試み、遺伝子の発現
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と安定性を解析した。(榎並)(2)センダイウイルスベクター系を開発した。当該ベクター系にHIV-1 gp120、インフルエンザH5HA遺伝子等の導入、遺伝子の発現と安定性、抗原性を解析した。V及びC蛋白変異弱毒化ウイルスの培養細胞とマウスレベルでの分子生物学的、病理学的解析を行った。(加藤)(3)パラインフルエンザウイルスの遺伝子組換え技術(感染性cDNAクローン)を確立した。ウイルスに種々の変異を導入し解析を始めた。(伊藤)(4)遺伝子組換えインフルエンザウイルスベクターに関して、マウスとサルを用いたモデル動物実験を行った。経鼻接種、肺接種、脳内接種による、IgG、IgA抗体価、CTL誘導活性、インターフェロン活性、感染防御効果、経時的症状、解剖所見、組織切片の免疫学的、病理学的解析を行った。(黒田、佐藤、榎並)<br />(1) We have developed influenza virus vector system using NS gene mutant. We have inserted CAT reporter gene, HIV-1 gp41, nef gene, tuberculosis antigen 85A gene, and so on, and characterized these recombinant viruses. (ME)(2) We have developed Sendai virus vector system. We have inserted HIV-1 gp120 gene, influenza H5HA gene, and so on, and characterized these recombinant viruses. We have obtained V and C protein-deficient mutant viruses by genetic engineering, and characterized them in mice for pathogenicity. (AK)(3) We have developed reverse genetic system of Parainfluenza virus. We have introduced mutations into the virus using this system. (YI)(4) We have characterized influenza virus recombinants in mouse and monkey model for IgG, IgA, CTL response, interferon activity, protection. and immunological analysis of tissues. (KK, TS, ME)<br />研究課題/領域番号:09357002, 研究期間(年度):1997-1999<br />出典：「RNAウイルスベクター系の開発と実用化」研究成果報告書 課題番号09357002 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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榎並, 正芳 ; Enami, Masayoshi
概要:
インフルエンザウィルスの遺伝子はマイナス鎖RNAと3種類のウイルスポリメラーゼ蛋白質、NP蛋白質が結合したRNP構成を形成し、感染細胞の核内で複製する。感染後期にRNPは細胞質へ移行し、ウイルス構造蛋白質と共に細胞表面で集合しウイルス粒子に
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取り込まれる。本研究では、ウイルスの粒子形成機構(ウイルス集合機構)を解明する事を目的とする。昨年度はウイルスM1蛋白質と膜蛋白質の相互作用と集合における機能に焦点を絞り解析を行った。本年度は、ウイルスRNPの核外輸送におけるウイルスNS1蛋白質の役割と機能構造の解析に焦点を絞った。ウイルス感染細胞内ではNS1蛋白質は核内でRNPに結合し細胞質内では遊離の状態で存在していた。NS1蛋白質はウイルス蛋白質中感染細胞内で最も強くリン酸化を受ける蛋白質である。種々のリン酸化酵素阻害剤6種類による、NS1蛋白質リン酸化の阻害を解析したところ、cGMP依存性蛋白質リン酸化酵素阻害剤H8による特異的阻害が確認された。またリン酸化阻害による、NS1蛋白質のRNPへの結合も阻害された。種々の部位特異的変異を持つウイルスを作成し解析する事は有力な手段である。これまでは限られた遺伝子にのみ変異の導入が可能であった。ウイルス粒子から単離したRNPを任意の遺伝子に対するcDNAとRNaseHで処理し、cDNAから試験管内で再構成したRNPと共に細胞に導入することにより様々な変異ウイルスを作成する技術を開発した。NS1蛋白質への変異導入により、これまで報告されていたNLS2(核移行シグナル2)及びeffectorドメインを含むC端側半分を削除してもウイルスは増殖し、必須ではない事が明らかとなった。<br />1) Influenza virus genome presents in RNP (ribonucleoprotein) complexes consists of eight spicies of negative-strand RNAs and PB1, PB2 PA and NP proteins. The genome replicates in the nucleus of the infected cells, which was exported to the cytoplasm and incorpolated to the virion together with structural proteins in the late phase of infection. In the present study, mechanism of virus assembly was investigated.2) The M1 protein was involved in the nuclear-export of the RNP.3) Interaction of the cytoplasmic tail of the HA and NA with the M1 was shown and it was important for the virus assembly.4) Inhibitor for cGMP-dependent protein kinase specifically inhibited the phosphorylation of the NS1 prtein as well as it's RNP-binding in vivo.5) We have developed a novel protocol to isolate influenza transfectant containing mutationsin the NS genome. The RNP,which was isolated from influenza virion, was treated with RNase H in the presence of NS cDNA.This was co-transfected to the cells together with in vitro-reconstituted NS RNPs. We have successfully isolated several NS mutants.<br />研究課題/領域番号:07670339, 研究期間(年度):1995-1996<br />出典：「インフルエンザウィルスの粒子形成機構」研究成果報告書 課題番号07670339 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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白土, 明子 ; Shiratsuchi, Akiko
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />アポトーシス細胞表層には貪食目印分子が出現し、食細胞はこれに対する特異的受容体を使ってアポトーシス細胞を貪食する。今年度は、目印分子ホスファチジルセリン(PS)とその受容体SR-BIを介した貪食反応機
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構と、新規貪食関連分子の解析を行った。1)ラット精巣セルトリ細胞に発現するSR-BIは、アポトーシス精子形成細胞表層のPSを認識して貪食反応を誘起する。様々な領域を欠いたSR-BI発現CHO細胞の貪食能解析より、SR-BIの509アミノ酸残基のうち、予想細胞外領域に位置する105-144番目、155-191番目を含む両領域がアポトーシス細胞結合に必要であること、また後者はPSとの結合に関与することを示す結果を得た。さらに、卵胞刺激ホルモン添加により培養セルトリ細胞のSR-BI発現が促進したことから、貪食反応が下垂体ホルモンの制御下にあることが示唆された。2)インフルエンザウイルス感染細胞はアポトーシスを起こし、PSを介してマクロファージに貪食される。ウイルスの出芽に際して感染細胞表層に出現するウイルスコートタンパク質の貪食反応への影響を解析した。インフルエンザウイルスタンパク質のノイラミニダーゼ(NA)活性を欠く変異ウイルスを用いた解析により、NAが感染細胞のマクロファージによる貧食を促進することが示された。現在、NAが目印分子として働くのかその活性が貪食促進に必要であるのかについて解析中である。3)アポトーシス後期細胞は初期細胞に比べて効率よくマクロファージに貪食される。新規貪食目印分子を解析するため、アポトーシス細胞を抗原とするモノクローナル抗体を作成した。マクロファージの貪食阻害効果を指標に樹立したモノクローナル抗体PH2は、アポトーシス後期およびネクローシス細胞の貪食反応を選択的に阻害し、その抗原は新規貪食目印分子であると考えられた。<br />研究課題/領域番号:11780441, 研究期間(年度):2001-2005<br />出典：「貪食による不要細胞の除去機構」研究成果報告書 課題番号11780441（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11780441/ ）を加工して作成
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白土, 明子 ; Shiratsuchi, Akiko
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />生体内で生じた除去すべき細胞にはアポトーシスが誘導され,食細胞による食食により生体から排除される。また,細菌やウイルス,およびこれらに感染細胞も食細胞の攻撃で排除される。本研究は,1)精巣セルトリ細胞
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による精子形成貪食が導く精子形成支持機構,2)Toll様受容体の病原微生物排除への役割の解明,そして3)インフルエンザウイルス感染細胞のマクロファージによる貪食の意義の解明を目的として行われ,以下の成果を得た。1)貪食を行ったセルトリ細胞が産生する精子形成支持因子の解析:ラットセルトリ細胞のプロテオーム解析より精子形成支持因子候補タンパク質を同定した。この分子が貪食依存に遺伝子転写レベルで発現誘導されることを見いだすとともに,セルトリ細胞で選択的に遺伝子欠損させたノックアウトマウスを作成中であり,精子形成進行への役割が解明される。2)Toll様受容体を介する細菌感染時の細胞性自然免疫調節:マクロファージに貪食された黄色ブドウ球菌は,TLR2-JNK経路の活性化を介して活性酸素産生を抑制し,宿主免疫を逃れて生き延びることを見いだした。これは,宿主免疫系を利用した微生物の生き残り戦略と考えられる。3)インフルエンザウイルス感染細胞によるマクロファージ活性化因子の産生:ヒトインフルエンザウイルス感染細胞は,アポトーシスに依存して,マクロファージの貪食能を活性化する因子を産生することを見いだした。この因子はタンパク質性であるが,新たなタンパク質合成を必要とせずに作り出されるとわかった。<br />1) Mechanism and role of SR-BI-mediated apoptotic spermatogenic cells by Sertoli cells in the testis. After phagocytosis of apoptotic spermatogenic cells, testicular somatic Sertoli cells produced unknown factor(s) by which spermatogenic cells could differentiate into spermatozoa. To identify the factor, we selected one candidate protein by proteome analysis of Sertoli cells and identified its primary structure. We found that the expression of the factor was stimulated in transcriptional level during phagocytosis. We have been generating knockout mice of the factor, and we are going to examine the role of the factor on spermatogenesis in mice.2) Role of TLR-JNK pathway on bacterial survival in macrophages Staphylococcus aureus induced JNK phosphorylation in mouse peritoneal macrophages depending on toll-like receptor TLR2. This activation of INK pathway caused inhibition of superoxide production in the macrophages, and this allowed engulfed S. aureus to survive in the macrophages.3) Role of phagocytosis of influenza virus-infected cells by macrophages Influenza virus-infected cells produced macrophage-activating factor that enhance macrophage phagocytosis of virus-infected cells depending on both virus infection and apoptosis. This factor would be heat-labile material since it lost the activity after heat-treatment.<br />研究課題/領域番号:18570123, 研究期間(年度):2006 – 2007<br />出典：「食細胞による死細胞および微生物の貪食機構と意義」研究成果報告書 課題番号18570123（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-18570123/185701232007kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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