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論文 |
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榎並, 正芳 ; Enami, Masayoshi
概要:
NS1蛋白に欠損を持つ遺伝子組み換えウイルスを作成し感染細胞で解析した。dl12は、N端付近の12残基を欠失するが、温度感受性となり感染後期にすべてのウイルス蛋白の翻訳が特異的に阻害された。N110はC端側52%を欠失するが、後期蛋白の翻訳
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だけが特異的に阻害された。N110のNS1は核外輸送に欠損を持っていた。WSN株NS1蛋白に加え、N端110残基(N110)、C端190残基(C190)、及び66-77残基目の欠損(d112)蛋白を大腸菌で発現・単離した。NS1蛋郷はA,、C-、及びG-キナーゼを用いてリン酸化した。ウサギ網状赤血球ライセートにウイルス感染細胞から精製したmRNAを添加、in vitroの翻訳に於けるNS1蛋白の機能を解析した。wt-NS1はin vitro翻訳系でNPとM1の翻訳を強く促進し、NS1の翻訳は弱く促進した。いずれのキナーゼもNS1蛋白をリン酸化したが、リン酸化により翻訳促進活性は有意に増加した。N110-NS1蛋白はin vitroで翻訳を促進し、C190-NS1蛋白は翻訳促進活性が欠損していた。NS1のN端側131残基及び151残基の下流に自己切断活性を持つ17残基の2Aプロテアーゼ配列を挟んでCAT遺伝子を挿入したNS2ACATウイルスを作成した[NS(131)2ACAT及びNS(151)CAT]。NS(131)2ACATウイルスは非温度感受性で、NS(151)CATウィルスは温度感受性となり、マウスに対して高度に弱毒化された。感染細胞内ではNS1とCATの融合蛋白を発現した後、直ちに自己切断され成熟型蛋白となった。感染24時間後にはCAT蛋白の50%が培養上精中に検出された。マウス肺ではウイルスの僅かな複製とCATの発現が確認され、血中1gG抗体価の僅かな上昇が見られた。当該ウイルス感染マウスは、致死量のWSNウイルス感染に対し完全に感染防御がみられた。<br />Influenza virus NS1 protein stimulates translation of some viral proteins in vivo, Interaction among the NS1 protein, host translational initiation factors, and 5'-UTR of viral mRNA may be involved in this regulation. The NS1 protein is a phosphoprotein, however, it is not clear whether the phosphorylation is required for this activity.We have obtained some NS1 mutant viruses using our reverse genetic system. Characterization pf these viruses indicated that dl12, which deletes 12 residues near N terminus of the NS1 protein, showed temperature-sensitive phenotype and the translation of all viral proteins was interfered. N110 virus, which deletes 52% of the C-terminus of the NS1 protein, has defect in the translation of the late viral proteins. We have also analyzed the phosphorylation in the virus-infected cells by using several protein kinase inhibitors. However the phoshorylation of the NS1 protein was not significantly interfered in that system.We have then analyzed the phosphorylati on of the NS1 protein in vitro using purified A-, C-, or G-kinases. The NS1 protein was obtained by expression from plasmid DNA in E. coli and followed by affinity purification. Translational regulation by the NS1 protein was analyzed using rabbit reticulocyte lysate system in vitro. In this experiment, mRNAs were purified from WSN virus-infected MDBK cells. The NS1 protein was phosphorylated by either A-, C-, or G-kinases in vitro. Unphosphorylated NS1 protein was shown to stimulate the translation of the M1 and NP proteins. In addition, phosphorylation of the NS1 protein significantly stimulated this activity, indicating that the phosphorylation of the NS1 is not essential but important for the regulation. Relatively lower effect was observed for the translation of the NS1 using this system. We have then analyzed the NS1 mutants. The N110 NS1 was shown to stimulate the translation in vitro. C190 NS1, which deletes N-terminal 40 residues, has defect in that activity. These data together indicates that N-terminal110 residues has the functional domain enough for this activity.<br />研究課題/領域番号:10470075, 研究期間(年度):1998-2001<br />出典：「インフルエンザウイルスNS1、NS2蛋白のウイルス工学的、細胞生物学的研究」研究成果報告書 課題番号10470075(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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榎並, 正芳 ; Enami, Masayoshi
概要:
(1)インフルエンザウイルスNS遺伝子変異株を利用したインフルエンザウイルスベクター系を開発した。当該ベクター系に、CATレポーター遺伝子、HIV-1 gp41及びnef遺伝子、結核菌antigen 85A遺伝子等の導入を試み、遺伝子の発現
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と安定性を解析した。(榎並)(2)センダイウイルスベクター系を開発した。当該ベクター系にHIV-1 gp120、インフルエンザH5HA遺伝子等の導入、遺伝子の発現と安定性、抗原性を解析した。V及びC蛋白変異弱毒化ウイルスの培養細胞とマウスレベルでの分子生物学的、病理学的解析を行った。(加藤)(3)パラインフルエンザウイルスの遺伝子組換え技術(感染性cDNAクローン)を確立した。ウイルスに種々の変異を導入し解析を始めた。(伊藤)(4)遺伝子組換えインフルエンザウイルスベクターに関して、マウスとサルを用いたモデル動物実験を行った。経鼻接種、肺接種、脳内接種による、IgG、IgA抗体価、CTL誘導活性、インターフェロン活性、感染防御効果、経時的症状、解剖所見、組織切片の免疫学的、病理学的解析を行った。(黒田、佐藤、榎並)<br />(1) We have developed influenza virus vector system using NS gene mutant. We have inserted CAT reporter gene, HIV-1 gp41, nef gene, tuberculosis antigen 85A gene, and so on, and characterized these recombinant viruses. (ME)(2) We have developed Sendai virus vector system. We have inserted HIV-1 gp120 gene, influenza H5HA gene, and so on, and characterized these recombinant viruses. We have obtained V and C protein-deficient mutant viruses by genetic engineering, and characterized them in mice for pathogenicity. (AK)(3) We have developed reverse genetic system of Parainfluenza virus. We have introduced mutations into the virus using this system. (YI)(4) We have characterized influenza virus recombinants in mouse and monkey model for IgG, IgA, CTL response, interferon activity, protection. and immunological analysis of tissues. (KK, TS, ME)<br />研究課題/領域番号:09357002, 研究期間(年度):1997-1999<br />出典：「RNAウイルスベクター系の開発と実用化」研究成果報告書 課題番号09357002 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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