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村松, 正道 ; 喜多村, 晃一 ; リャン, グオシン
概要:
我々はこれまで、活性化B細胞に特異的に発現する遺伝子Activation-induced cytidine deaminase (AID)を単離し、次にAIDが抗体遺伝子の2つの遺伝子改編（クラススイッチ組換えとsomatic hyperm
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utation）のトリガーとなる事を示してきた。すなわち、生体が抗原刺激を受けた際、B細胞が活性化されAIDを新規に発現誘導し、AIDが抗体遺伝子にDNA切断を誘導する。S領域のDNA切断はクラススイッチ組換えにつながり、AIDが可変領域に作用するとsomatic hypermutationが起こる。実際、変異によりAIDの機能不全が起こると常染色体劣性遺伝の液性免疫不全症である高IgM症候群となる事がわかっている。その後の解析より、AIDによる抗体遺伝子座改編システムは、B細胞による獲得免疫の根幹を形成するメカニズムであるのみならず、そのシステムの些細なほころびが発がんのリスクとなる事もわかってきた。ここではAIDと発がんの関連に関する研究の一端を紹介する。 もう一つのトピックとしてAIDにまつわる新たな展開を紹介したい。AIDは、DNAやRNA上の塩基を修飾し塩基の遺伝情報を改変する活性を持つDNA/RNA deaminaseの１員である。この一群のdeaminaseは遺伝情報を再編集し生体の様々な局面に関わっている事が少しずつ明らかになってきた。AIDに最も近いdeaminaseメンバーであるAPOBEC3は、ここ数年HIVウイルスにhypermutationを導入することでHIVを不活性化する自然免疫のeffecter分子として注目されている。HIV以外のウイルスでも、このdeaminaseの働きが相次いで報告されている。AIDも含むdeaminaseの自然免疫における役割を考察する。
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白崎, 尚芳 ; Shirasaki, Takayoshi
概要:
金沢大学医薬保健研究域保健学系<br />iIFNλ4の機能的役割や臨床学的意義について検討した。(1) 肝動注化学療法奏効例12例の肝組織IFNλ4の発現は非奏効例8例のIFNλ4発現より有意に高発現を示した。(2) IFNλ4は他のIF
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Nとは異なり非常に強い抗腫瘍活性を示すことを明らかにした。また、IFNλ4により特異的に誘導される遺伝子群を同定した。(3) これまでの解析からIFNλ4特異的なレセプターの存在が示唆された。その新規候補レセプターとしてレセプターA及びBが新規レセプターであることを同定した。(4) NOD-SCIDマウスを用いたxenograftモデルにてIFNλ4が抗腫瘍効果を示すことをin vivoで確認した。<br />Molecular mechanisms and the biological, clinical significance of IFNλ4 is poorly understood.(1) We examined the expression of IFNλ4 in patients’ samples and evaluated its clinical significance. Hepatic IFNλ4 expression is related to the response to the chemotherapy to advanced HCC. (2) We revealed that IFNλ4 has functional roles quite different from other IFNs. We revealed that IFNλ4 has a strong anti-viral activity and has a strong anti-tumor activity. We identified IFNλ4-dependent gene expression patterns that support the specific phenotype of IFNλ4. (3) We identified new IFNλ4 receptors; A and B. Detailed signaling pathway down streaming of receptor A and B are now under investigating. (4) Anti-tumor activity of IFNλ4 in vivo was evaluated by using xenograft model to NOD-SCID mice. IFNλ4 expressing HepG2 cells established significant small tumors compared to the control tumors or IFNλ3 expressing tumors.<br />研究課題/領域番号:16K21058, 研究期間(年度):2016-04-01 – 2019-03-31
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村松, 正道 ; Muramatsu, Masamichi
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />前年度は、実験材料として樹立したB型肝炎ウイルス(HBV)を構成的に発現するヒト肝細胞株に不具合が見つかったのでやむなく本年度まで研究継続した。HBV株の樹立を再度行ない、これまでの知見を確認した。ま
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ずはDNA編集酵素APOBEC3G(およびそのファミリー)をこの細胞株に強制発現させると、ウイルスの複製が抑制された。抑制は、キャップシド内の逆転写のレベルで起こっていた。またこの際、キャップシド内に存在するHBV DNAに高頻度突然変異を見いだした。この高頻度突然変異は、ほとんどG-to-A変異であり、マイナス鎖DNAが逆転写された際にAPOBEC3GがDNA上のCのアミノ基を加水分解したことを示唆した。さらに培地中に分泌されたウイルス粒子内のHBV DNAでも同様の知見を得た。肝炎病態では、治療手段としてあるいは免疫系活性化の結果として、局所環境でインターフェロンが分泌される可能性がある。そこでこの細胞株にインターフェロンを投与し細胞を刺激すると、内在性APOBEC3Gが発現誘導され、強制発現の際に酷似するウイルス複製抑制と高頻度変異を観察した。またDNAデアミナーゼが作るC-to-U変異は塩基除去修復系酵素UNG感受性であると考えられるので、UNGの活性を阻害した環境で、ウイルス複製と高頻度変異を見たところ、ウイルス複製はUNG活性の有無でさほど違いは無かったが高頻度変異は増強した。以上の知見から慢性のB型肝炎の際にはAPOBEC3Gなどのデアミナーゼが発現しウイルス複製は若干抑制する一方でウイルスゲノム多様性は増悪し、さらに除去修復系活性が下がるとウイルス多様性は増強する事が見いだされた。この事はDNAデアミナーゼが慢性化の一つの原因であるウイルス多様性を増強し間接的に発ガンに寄与する可能性を示唆している。<br />研究課題/領域番号:20012018, 研究期間(年度):2008 – 2009
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村上, 清史 ; Murakami, Seishi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />B型肝炎ウイルスX蛋白(HB_x)の生物の機能を解明するため、HB_xが活性化型H-Ras導入による不死化ヒト初代細胞のoncogene-induced senescence (OIS)に拮抗して細胞を
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形質転換する能力の解析(村上、中本)と、HB_xに拮抗する宿主因子RMPの生物的機能をfly系で解析(小泉)を進めると共に、レトロウイルス挿入ライブラリーによるマウスのがん化の標的部位の探索(鈴木)を行った。得られた主な結果は、1)不死化ヒト正常線維芽(BJ)細胞系でのHB_xのOIS克服能は、HB_xがp53経路とpRb経路を抑制する結果と示唆された。HB_x形質転換促進能には、aa74-94とaa111-131の2配列が必須であり、aal-49が付加的な役割を示した。ジーンチップ解析では、HB_xと活性型Rasが共発現した不死化BJ細胞で、不死化BJ細胞に比較し、アポトーシス関連因子やMAPキナーゼシグナル伝達経路など細胞周期と細胞増殖に関与する因子と、SPCなど癌遺伝子関連因子の発現亢進が認められた。2)hTERT導入不死化ヒト初代肝細胞株(TTNT-16)を用いた解析でも、HB_xは活性化型H-RasによるOISを克服能を示し、細胞の形質転換を促進した。3)ショウジョウバエでfRMPとRPB5との関係を解明するため、RPB5 RNAiトランスジェニック(15系統)を作成した。GAL4誘導下でfRMPとRPB5 RNAiが眼成虫原基全体で発現する系で、fRMPとRPB5トランスジェニックRNAiの両方で、通常より小さなサイズの複眼形成が観察され、BrdU標識実験で視神経産生幹細胞の減少が観察された。しかし視神経分化には顕著な異常が観察されなかった。両遺伝子のRNAiが類似の表現型を示す結果は、両者の機能的な相関を示唆した。分化後の視神経でGMR GAL4による両者のRNAi誘導は、共に複眼形成に顕著な異常を惹起しなかった。fRMPとRPB5の発現が、神経幹細胞増殖時に重要な役割を果たすが、神経分化時には必ずしも重要ではないことを示唆するこれらの結果は、RNA polymerases量の減少或いは未集合RPB5の持つ未知機能によるものと推定される。<br />研究課題/領域番号:18012018, 研究期間(年度):2006 – 2007<br />出典：「B型肝炎ウイルスX蛋白の転写修飾機能と細胞形質転換能促進」研究成果報告書 課題番号18012018（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18012018/)を加工して作成
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中本, 安成 ; Nakamoto, Yasunari
概要:
金沢大学附属病院<br />慢性ウイルス肝炎からの発がんを誘導する責任遺伝子を同定することを目的に、マウスモデルにおいて発がん率の異なる肝組織の遺伝子発現プロファイルを比較することによって候補遺伝子を選択した。肝発がんモデルは、B型肝炎ウイ
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ルス(HBV)トランスジェニックマウスにウイルス抗原特異的な免疫反応を誘導することによって、17ヵ月間の経過の中で慢性肝炎から異形性を伴った前がん状態を経て90%以上のマウスに肝細胞がん(肝がん)を発症する実験系を確立している。慢性肝炎の誘導に関しては、これまで報告した肝障害分子であるFasリガンド(FasL)の関与に加えて、リンパ球分画におけるCD8+ Tリンパ球が深く関与しており、発がん率(発がんポテンシャル)を亢進していることが分かった。これらの検討で得られた発がん率の異なる前がん状態(非腫瘍部)の肝組織について、遺伝子発現プロファイルを比較することにより、発がん率の変化に応じて352遺伝子(1.7%)の発現が有意に変動することが分かった(P<0.05)。なかでも、細胞死・増殖因子に関する遺伝子群の変動が4.7%と最も高率であった。さらに、発がんに関連する候補遺伝子の1例として、セリン・スレオニンキナーゼpim-3の解析を行うことによって、細胞増殖を促進しアポトーシス(細胞死)を抑制して肝がんの進展に関与していることが示唆された。<br />研究課題/領域番号:16021216, 研究期間(年度):2004<br />出典：「慢性肝炎が誘導する発がん関連遺伝子の同定」研究成果報告書 課題番号16021216（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16021216/)を加工して作成
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大野, 博司 ; Ohno, Hiroshi
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />ポリオウイルスは腸管上皮から初期感染するが、その際ポリオウイルス受容体(PVR)を必要とする。PVRには膜結合型(α、δ)、分泌型(β、γ)のアイソフォームが存在し、前者が感染に重要と考えられる。.ポリ
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オウイルスはPVRと結合して細胞内に取り込まれること、PVRとの結合に伴いウイルス粒子の構造変化が起こることがわかっている。そこでPVRα、PVRδを種々の細胞に遺伝子導入し、抗PVR抗体の細胞内取り込みを検討したところ、いずれにおいてもPVRα、PVRδに結合した抗体は細胞表面にとどまり取り込みは認められないことから、細胞膜上のPVRはそこに安定して発現し、構成的エンドサイトーシスは受けないことが明らかとなった。したがって、ウイルスとの結合によりPVR自身にも何らかの(構造)変化が誘導される結果ウイルス粒子とともにエンドサイトーシスされると考えられる。また、PVRαおよびPVRδの腸管感染における役割を検討する目的でPVRα、PVRδの両者(Tg25)あるいはPVRαのみ(Tg55)を発現するトランスジェニックマウスにポリオウィルスを経口、あるいは麻酔下に開腹して小腸に直接投与した。経口投与では□□□□、□□□□ともに感染は見られなかったが、腸管内投与ではTg25において感染が認められた。小腸における免疫染色の結果、PVRはTg25では粘膜上皮細胞の主として管腔側に局在するのに対しTg55では基底膜側に強い発現が認められており、このPVRの発現部位の違いが感染性の違いに関係すると考えさらに検討中である。<br />研究課題/領域番号:15019032, 研究期間(年度):2003<br />出典：「ポリオウイルス感染におけるポリオウイルス受容体サブタイプおよびM細胞の役割の検討」研究成果報告書 課題番号15019032（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-15019032/)を加工して作成
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喜多村, 晃一 ; Kitamura, Koichi
概要:
AID/APOBEC蛋白質はHBVをはじめとする様々なウイルスDNAにC-to-U変換を誘導しウイルスを不活化するというモデルが提唱されている。本研究では核内cccDNAに着目し、DHBVモデルを用いてAID、APOBEC3G及び修復因子U
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NGの作用を検討した。その結果、APOBEC3Gはこれまで知られていたウイルス粒子内DNAよりも高頻度なcccDNA変異導入活性を持つこと、AIDとUNGが協働してcccDNAを切断していることを示した。これらは抗ウイルス活性であると同時に宿主細胞核内の変異導入活性及びHBV DNA断片の存在を示唆しており発がん機構解明においても重要な知見であると考える。<br />Recent studies have revealed that AID/APOBEC cytidine deaminase family members can induce C-to-U hypermutation on viral genome and restrict replication of various types of virus including HBV. Uracil residues in DNA are removed by base excision repair (BER) enzyme, uracil DNA glycosylase (UNG) when cytidine deamination is occurred in host genome.Here, we investigated whether uracil residues were removed by UNG from HBV and DHBV DNAs using in vitro cell culture system. When UNG activity was inhibited by the expression of UNG inhibitory protein (UGI), the APOBEC3G-mediated hypermutation of HBV nucleocapsid DNA was enhanced. The enhanced hypermutation by APOBEC3G and UGI was also observed in DHBV cccDNA, which was more frequent than in nucleocapsid DNA. We also found that overexpression of chicken AID caused hypermutation and reduction of DHBV cccDNA levels. These results indicate that UNG excises uracils from viral genome deaminated by AID/APOBEC protein during or after cccDNA formation.<br />研究課題/領域番号:23790780, 研究期間(年度):2011-2013
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喜多村, 晃一 ; Kitamura, Koichi
概要:
慢性B型肝炎ではHBVを完全に除去できれば肝硬変、肝がんへの進行が止まるが、既存の治療法では血中HBV量を減少させることはできても、ウイルスの核内フォームであるcccDNAが細胞に維持されたままである。抗ウイルス因子として知られるAPOBE
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C3GをはじめとするAID/APOBECファミリーがHBVにおいても発現誘導されウイルスゲノムへ変異を導入することが報告されている。本研究では核内の塩基除去修復因子であるUNGがこの変異をcccDNAの段階で修復している可能性を示した。<br />Human APOBEC3 proteins are reported to be antiviral factors and catalyze C-to-U conversion on hepatitis B virus (HBV) DNA by cytosine deamination. Extensive G-to-A hypermutation on plus-strand of HBV DNA has been observed from APOBEC3G-expressing hepatoma cells. We investigated whether UNG also process the hypermutated HBV genome with base excision activity. We found that the UNG inhibition caused accumulation of hypermutation in nuclear cccDNA and decrease of cytoplasmic rcDNA level. Sequencing analysis showed that some of these cccDNA mutations resulted in nonsense codons within viral polymerase coding region. These results suggest that the BER pathway triggered from nuclear UNG repairs the viral DNA mutations introduced by the antiviral APOBECs.<br />研究課題/領域番号:21790654, 研究期間(年度):2009-2010
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山田, 外史
概要:
本研究は,一般的な電磁アクチュエータとは異なる巨大な応力の発生できる超磁歪アクチュエータで構成したキャビテーション発生装置を用い,キャビテーションによるパルスパワー,酸化チタン添加によるラジカル発生による酸化分解作用により,ウイルス・大腸菌
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を不活性化・殺菌することを目的とした。まず,キャビテーションによるパルスパワーならびにラジカルの発生を検証し,細菌やウイルスの殺菌・不活性化について実験的,定量的に確認した。また,浄化対象液を循環させながら処理する機構を考案し,その装置を用いたウイルス・大腸菌の不活性化・殺菌評価を行った。<br />Giant magnetostrictive actuators have the potential to produce huge amounts of stress and minute strokes unlike electromagnetic actuators using magnetic excitation. We propose the powerful generation of cavitation in a water medium driven by the actuator. The collapse of cavitation generates a pulse shock wave and also brings about radicals generated by the addition of titanium oxide. The research has demonstrated the generation of cavitation and radicals based on the method of methylene blue testing, and the destructive influence of both viruses and bacteria have been identified. We also observed the biological conditions of the cell to check biological effects after sterilization. We proposed a new apparatus for a cyclical system that is aimed at large capacity, which we evaluated by using qualitative arithmetic.<br />研究課題/領域番号:22656067, 研究期間(年度):2010–2011
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原田, 憲一 ; Harada, Kenichi
概要:
胆道閉鎖症の病態形成における2本鎖RNAウイルスに対する自然免疫の関与について検討した。2本鎖RNA刺激にて胆管細胞の上皮間葉移行(EMT)が誘導され、また患児の肝外胆管ではEMTを示唆する表現型の変化を認め、硬化性閉塞性胆管炎の発生機序と
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して胆管細胞EMTが示唆された。また、NK機能不全を有するCD56^-CD16^+NK細胞が胆道閉鎖症患児の肝組織中で増加しており、ウイルス感染に対するNK機能不全が病態発生の宿主因子として関与している可能性が示唆された。<br />Biliary innate immunity for double-stranded RNA virus was examined in the histopathogenesis of biliary atresia (BA). Epithelial-mesenchymal transition (EMT) of biliary epithelial cells induced by the stimulation with double-stranded RNA and EMT-like phenotypic changes of extrahepatic bile ducts in BA are closely associated with the histogenesis of sclerosing obliterative cholangitis. Moreover, the increased number of an unique subset of NK cells, CD56^-CD16^+NK cells was found in portal tracts of BA, suggesting that NK dysfunction against virus infection might be a host factor associated with pathogenesis of BA.<br />研究課題/領域番号:20590338, 研究期間(年度):2008–2010
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