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柴田, 幹大 ; Shibata, Mikihiro
概要:
金沢大学ナノ生命科学研究所<br />本研究は、生体分子のナノ動態を撮影できる高速原子間力顕微鏡（高速AFM）と、単粒子解析法やディープラーニングによる画像解析を融合し、タンパク質部位の揺らぎ・構造変化を定量化できる画像解析システムの構築を
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目指した。具体的には、高速AFM動画にMotionCor2を適用し、サブナノメートルの精度で約200枚のAFM画像をドリフト補正することに成功し、その積算画像を得た。積算画像では、タンパク質の動きの少ない部位は空間分解能が向上する一方、揺らぎの大きな部位は分解能が下がり、これを利用してタンパク質内のどの部位が、どの程度の揺らぎを持つのかを定量化することが可能となった。<br />High-speed atomic force microscopy (HS-AFM) is a unique technique to capture a nano-dynamics of biomolecules under the near physiological conditions. The purpose of this study is to build the image analysis which is capable to quantify fluctuation and structural changes of proteins by combining with single-particle analysis and deep learning. Specifically, we applied MotionCor2 to HS-AFM movies of proteins. As a result, we succeeded in drift-correcting about 200 AFM images with a sub-nanometer accuracy and obtained the integrated image. In the integrated image, the spatial resolution is improved in the part where the protein has a little fluctuation, while the resolution is decreased in the part where the fluctuation is large. Thus, this new combined method allows us to quantify a fluctuation of proteins.<br />研究課題/領域番号:18K19287, 研究期間(年度):2018-06-29 – 2020-03-31<br />出典：「高速原子間力顕微鏡と高度画像解析の融合による近原子分解能AFM画像への挑戦」研究成果報告書 課題番号18K19287（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-18K19287/18K19287seika/)を加工して作成
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柴田 , 幹大 ; Shibata, Mikihiro
概要:
金沢大学ナノ生命科学研究所<br />CaMKIIは脳の神経細胞に存在し、記憶の形成に重要な役割を果たす。CaMKIIは12量体を形成し、Ca2+の高頻度刺激を積算（記憶）することができるため、多量体構造の中に“記憶の分子メカニズム”が隠さ
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れていると考えられてきたが、その詳細は不明であった。本研究は、CaMKIIに高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を適用し、CaMKIIのハブドメインが信号を積算するために強力な分子集合能力を持つこと、キナーゼドメインが１２量体構造を制御すること、さらに、２つを繋ぐリンカー部分の柔軟性が、CaMKIIの活性化に重要であることを実験的に示し、記憶の分子メカニズムの一端を明らかにした。<br />CaMKII is enriched in neurons and plays an important role for learning and memory. Because CaMKII forms 12-mer holoenzyme that responds to the frequency of the activating signal of Ca2+, an assembly of CaMKII oligomers could be a key element of a molecular mechanism of learning and memory. However, there is no direct evidence that a formation of CaMKII oligomer relates to a memory mechanism.HS-AFM movies of CaMKII showed solid structures and fluctuated globular structures. By using truncated CaMKII, solid and globular structures were assigned to hub and kinase domains, respectively. Interestingly, 14-mer ring structures were observed in the truncated CaMKII, while 12-mer structures were observed in full-length CaMKII. These results suggest that hub domain has a strong assemble ability, while kinase domain regulates an oligomeric structure of CaMKII. Furthermore, HS-AFM revealed that a flexibility of a linker region is important for the activation of CaMKII.<br />研究課題/領域番号:16K18523, 研究期間(年度):2016-04-01 – 2018-03-31
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
金沢大学理工研究域物質化学系<br />我々が世界に先駆けて開発した高速原子間力顕微鏡をタンパク質などの生体高分子の機能ナノ動態撮影に実用化する上で障害となる装置上の問題点を発見・解決するとともに、特定の試料対象に対してその基板への固定法な
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どを開発し、高速原子間力顕微鏡をタンパク質の新しい研究手段にすることを本研究は目指している。対象試料をモータータンパク質系に絞って研究を進めてきた。モータータンパク質(ダイニンC、ミオシンV)が単独に在る場合には、マイカ表面を改変せず、また、溶液条件を特別なものにしなくとも、これらの蛋白質は緩やかにマイカ表面に吸着し、分子内のかなりの部分がマイカ表面から自由であった。従って、ATPase反応にともなう構造変化を比較的容易にイメージングできた。ダイニンCでは、ストークとヘッド部はATPの影響が見られないのに対して、ステム部はATP存在下で2つの位置を行ったり来たりする様子が観察された。その頻度はATPターンオーバー時間にほぼ等しく、ステムの運動がATPase反応に共役していることは明らかである。ミオシンVのATPase活性は極めて低いので、構造形態変化を繰り返し捉えることは難しい。そこで、Caged-ATPに紫外線を照射しATPを放出する前後をイメージングする方法でATPase反応にカップルした構造形態変化を捉えた。紫外線照射後素早く頭部が大きく屈曲し、1-2秒の内にもとのまっすぐな形態に戻った。装置の改良により、ATP存在下でアクチンフィラメントとミオシンVが弱く相互作用する系についても、系を乱すことなく、イメージングすることが可能になった。現在この系に集中して、ミオシンVの動的挙動の研究を進めている。ダイニンCとマイクロチュービュルが共存する系については未だ着手していない。<br />研究課題/領域番号:14654071, 研究期間(年度):2002 – 2003<br />出典：「タンパク質の分子機能動態及び場のリアルタイムイメージングを目指して」研究成果報告書 課題番号14654071（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14654071/)を加工して作成
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論文 |
論文
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
(a) We manufactured an atomic force microscope that was able to be scanned faster and less susceptible to drift than ord
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inary AFM apparatuses. This AFM was attached to an epiluminescence fluorescence microscope. To show the high performance of our AFM apparatus we tried to obtain high resolution images of myosin heads (subfragment-1) in aqueous solution. The images revealed fine structures that was comparable to those in an atomic model of S1 derived from x-ray crystallography of S1. In the AFM images we were able to see the ATP binding site as well as the large cleft at the tip of S1. These results proved that our AFM apparatus was on the level of the greatest in the world. (b) We performed a study preparatory to the development of a high-speed AFM in which one image would be acquired within 30msec. We designed and manufactured a high-speed scanner and attained high-speed imaging where one image was obtained within 150msec. By way of experiment we produced an AFM that employed a displacemant detection system suitable for high-speed imaging. We also examinds methods for preparing cantilevers that were suitable for a high-speed AFM.From these preparative studies we were able to secure a scaffolding for the development of the video-rate AFM. (c) To measure bimolecular interaction force at a truly single molecular level we developed a method to capture a single molecule of protein at the apex of a cantilever tip. Using this method we succeeded in quantifying the force field exerted between a single molecule of heavy meromyosin (HMM) and actin. Using this new technology we also discovered that ATP binding to HMM heads induced vibratile structural changes in HMM heads.<br />1.従来のAFM装置より高速に走査でき、ドリフトの影響を受けにくいAFMを製作し、これを蛍光顕微鏡に組み込んだ。この装置の高い性能を示すために、液中にあるミオシン頭部(S1)の像を高い分解能で得ることを試みた。X線結晶解析で得られているS1の原子モデルと細かい点まで比較できるほどの解像度の高い像を得ることができた。ATP結合部位や頭部先端にあるクレフトまで観察することができ、世界最高レベルのAFMであることを実証した。2.将来AFMをビデオレートにまで高速化するための準備研究を行った。高速走査できるスキャナーを設計・製作し、1画像を150msecで撮れる走査速度を実現した。高速AFMに適した変位検出法を採用したAFMを試作した。また、高速走査に適したカンチレバ-作製法の検討を行った。これらの研究により最終的な高速化を図るための足がかりを掴むことができた。3.真に1分子レベルで分子間相互作用を計測するために、カンチレバ-探針先端に蛋白質1分子を捕捉する方法を開発した。これによって、ミオシンのサブフラグメント(HMM)1分子とアクチン間に働く力の場の諸性質を定量化することに成功した。更に、HMMがATPに結合したあとに振動する構造変化がHMM頭部に起こることを発見した。<br />研究課題/領域番号:06558099, 研究期間(年度):1994–1996<br />出典：「生物研究用走査型プローブ顕微鏡の製作」研究成果報告書 課題番号06558099 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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