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論文 |
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柴田 , 幹大 ; Shibata, Mikihiro
概要:
金沢大学ナノ生命科学研究所<br />CaMKIIは脳の神経細胞に存在し、記憶の形成に重要な役割を果たす。CaMKIIは12量体を形成し、Ca2+の高頻度刺激を積算（記憶）することができるため、多量体構造の中に“記憶の分子メカニズム”が隠さ
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れていると考えられてきたが、その詳細は不明であった。本研究は、CaMKIIに高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を適用し、CaMKIIのハブドメインが信号を積算するために強力な分子集合能力を持つこと、キナーゼドメインが１２量体構造を制御すること、さらに、２つを繋ぐリンカー部分の柔軟性が、CaMKIIの活性化に重要であることを実験的に示し、記憶の分子メカニズムの一端を明らかにした。<br />CaMKII is enriched in neurons and plays an important role for learning and memory. Because CaMKII forms 12-mer holoenzyme that responds to the frequency of the activating signal of Ca2+, an assembly of CaMKII oligomers could be a key element of a molecular mechanism of learning and memory. However, there is no direct evidence that a formation of CaMKII oligomer relates to a memory mechanism.HS-AFM movies of CaMKII showed solid structures and fluctuated globular structures. By using truncated CaMKII, solid and globular structures were assigned to hub and kinase domains, respectively. Interestingly, 14-mer ring structures were observed in the truncated CaMKII, while 12-mer structures were observed in full-length CaMKII. These results suggest that hub domain has a strong assemble ability, while kinase domain regulates an oligomeric structure of CaMKII. Furthermore, HS-AFM revealed that a flexibility of a linker region is important for the activation of CaMKII.<br />研究課題/領域番号:16K18523, 研究期間(年度):2016-04-01 – 2018-03-31
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内橋, 貴之 ; Uchihashi, Takayuki
概要:
金沢大学理工研究域数物科学系<br />昨年度までに開発した高速AFMインタラクティブモードの応用研究を進めた。具体的には、インタラクティブモードによりクラミドモナス鞭毛の軸糸微小管を部分破壊し、それによる微小管の崩壊を観察することで、微小
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管内部の結合タンパク質が微小管の構造を安定化していることを明らかにした。また、超分子ポリマーの部分切断と再重合過程や酸化還元酵素であるペルオキシレドキシンの高分子複合体の構造解析に関する研究にも応用した。これらにより、インタラクティブモード高速AFMがタンパク質の分子動態の操作だけでなく、分子複合体の部分破壊を利用した堅さ計測や構造解析に利用できることがわかった。分子動態の観察によって分子の柔らかさと機能の関係を明らかにすべく、分子シャペロンClpBのイメージングを行った。ATPの結合と加水分解に依存したClpB六量体リング構造の柔軟な形状変化が観察された。様々な変異体解析により、六量体リング構造の切断と回復などのダイナミックな構造変化がClpBシャペロン機能に重要であることを明らかにした。<br />研究課題/領域番号:26102515, 研究期間(年度):2014-04-01 – 2016-03-31
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内橋, 貴之 ; Uchihashi, Takayuki
概要:
金沢大学理工研究域数物科学系<br />昨年度までに開発した高速AFMインタラクティブモードの応用研究を進めた。具体的には、インタラクティブモードによりクラミドモナス鞭毛の軸糸微小管を部分破壊し、それによる微小管の崩壊を観察することで、微小
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管内部の結合タンパク質が微小管の構造を安定化していることを明らかにした。また、超分子ポリマーの部分切断と再重合過程や酸化還元酵素であるペルオキシレドキシンの高分子複合体の構造解析に関する研究にも応用した。これらにより、インタラクティブモード高速AFMがタンパク質の分子動態の操作だけでなく、分子複合体の部分破壊を利用した堅さ計測や構造解析に利用できることがわかった。分子動態の観察によって分子の柔らかさと機能の関係を明らかにすべく、分子シャペロンClpBのイメージングを行った。ATPの結合と加水分解に依存したClpB六量体リング構造の柔軟な形状変化が観察された。様々な変異体解析により、六量体リング構造の切断と回復などのダイナミックな構造変化がClpBシャペロン機能に重要であることを明らかにした。<br />研究課題/領域番号:26104514, 研究期間(年度):2014-04-01 – 2016-03-31
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内橋, 貴之 ; Uchihashi, Takayuki
概要:
金沢大学理工研究域数物科学系<br />室温から約45℃の温度制御可能な高速AFMシステムを開発した。実際に、41度で固相から液相に相転移する脂質二重膜(DPPC)を用いて高温観察の評価を行い、相転移温度以上で膜の流動性が増加し脂質二重膜の
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形状が変化する様子を確認できた。温度制御システムを使って、べん毛の輸送タンパク質の一部であるFliIの観察を行ったところ、モノマーから六量体形成していく過程やFliI六量体の構造が変化する様子も観察できた。シアノバクテリアの概日周期タンパク質であるKaiCとKaiAの結合解離過程の温度依存性の測定にも成功した。<br />We have developed variable-temperature high-speed atomic force microscopy (VT-HS-AFM) with which the experimental temperature can be controlled ranging from a room temperature to around 40 ℃. The performance of VT-HS-AFM was confirmed by observation of fluidity of DPPC lipid bilayer with the phase-transition temperature of 41℃ from gel phase to liquid crystal phase. We applied the VT-HS-AFM system to observation of a flagellar protein, FliI, which is an ATPase with the activity optimum temperature over 40℃. HS-AFM images captured oligomerization processes of the FliI monomers to the hexamer and also conformational changes of the oligomers. Also we observed temperature dependent interaction between KaiC and KaiA which are proteins responsible to the circadian rhythm of Cyanobacteria.<br />研究課題/領域番号:15H03540, 研究期間(年度):2015-04-01 - 2018-03-31
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内橋, 貴之 ; Uchihashi, Takayuki
概要:
高速原子間力顕微鏡(AFM)によってタンパク質の凝集を解く分子シャペロンClpBの構造ダイナミクスを観察した。ClpB６量体リングの形状がATP濃度依存的に大きく揺らぐことを見出した。このリング構造の揺らぎがClpBの脱凝集活性に寄与してい
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ることを示唆する結果が得られた。高速AFM/蛍光顕微鏡複合機の性能を向上し、高速AFMと蛍光顕微鏡で一分子の同視野かつ同時観察が可能となった。回転モータータンパク質であるV1-ATPaseにおいて回転軸であるDFサブユニットがなくても、回転子リング内でATP加水分解によるサブユニットの構造変化が協同的に一方向へ伝搬していくことを明らかにした。<br />We observed conformational dynamics of a molecular chaperone ClpB which disaggregates denatured proteins. We found that the hexameric ring of the TClpB dynamically changes between symmetric, asymmetric and broken ring. Also it was indicated that the dynamic fluctuation of the ring structure is essential for the chaperon activity of ClpB.We also improved combined system high-speed AFM and fluorescent microscopy. The combined system enabled simultaneous single-molecule imaging with high-speed AFM and fluorescence microscopy. We succeeded in observing processive movement of enzymatic chitinase with fluorophores along a chitin fibril and further conformational change of F1-ATPase and binding/dissociation of fluorescent-ATP analogue. We have applied high-speed AFM to investigate cooperative conformational change of V1-ATPase without the shaft (DF subunit). We found that conformational change of the A subunit propagates unidirectionally in the hexameric ring even without the shaft.<br />研究課題/領域番号:24241048, 研究期間(年度):2012-04-01 - 2015-03-31
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