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成田耕造著
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図書 |
図書
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水島昭二編
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図書 |
図書
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浜口浩三著
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図書 |
図書
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成田耕造著
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論文 |
論文
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柴田, 幹大 ; Shibata, Mikihiro
概要:
金沢大学ナノ生命科学研究所<br />本研究は、生体分子のナノ動態を撮影できる高速原子間力顕微鏡（高速AFM）と、単粒子解析法やディープラーニングによる画像解析を融合し、タンパク質部位の揺らぎ・構造変化を定量化できる画像解析システムの構築を
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目指した。具体的には、高速AFM動画にMotionCor2を適用し、サブナノメートルの精度で約200枚のAFM画像をドリフト補正することに成功し、その積算画像を得た。積算画像では、タンパク質の動きの少ない部位は空間分解能が向上する一方、揺らぎの大きな部位は分解能が下がり、これを利用してタンパク質内のどの部位が、どの程度の揺らぎを持つのかを定量化することが可能となった。<br />High-speed atomic force microscopy (HS-AFM) is a unique technique to capture a nano-dynamics of biomolecules under the near physiological conditions. The purpose of this study is to build the image analysis which is capable to quantify fluctuation and structural changes of proteins by combining with single-particle analysis and deep learning. Specifically, we applied MotionCor2 to HS-AFM movies of proteins. As a result, we succeeded in drift-correcting about 200 AFM images with a sub-nanometer accuracy and obtained the integrated image. In the integrated image, the spatial resolution is improved in the part where the protein has a little fluctuation, while the resolution is decreased in the part where the fluctuation is large. Thus, this new combined method allows us to quantify a fluctuation of proteins.<br />研究課題/領域番号:18K19287, 研究期間(年度):2018-06-29 – 2020-03-31<br />出典：「高速原子間力顕微鏡と高度画像解析の融合による近原子分解能AFM画像への挑戦」研究成果報告書 課題番号18K19287（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-18K19287/18K19287seika/)を加工して作成
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論文 |
論文
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柴田 , 幹大 ; Shibata, Mikihiro
概要:
金沢大学ナノ生命科学研究所<br />CaMKIIは脳の神経細胞に存在し、記憶の形成に重要な役割を果たす。CaMKIIは12量体を形成し、Ca2+の高頻度刺激を積算（記憶）することができるため、多量体構造の中に“記憶の分子メカニズム”が隠さ
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れていると考えられてきたが、その詳細は不明であった。本研究は、CaMKIIに高速原子間力顕微鏡(高速AFM)を適用し、CaMKIIのハブドメインが信号を積算するために強力な分子集合能力を持つこと、キナーゼドメインが１２量体構造を制御すること、さらに、２つを繋ぐリンカー部分の柔軟性が、CaMKIIの活性化に重要であることを実験的に示し、記憶の分子メカニズムの一端を明らかにした。<br />CaMKII is enriched in neurons and plays an important role for learning and memory. Because CaMKII forms 12-mer holoenzyme that responds to the frequency of the activating signal of Ca2+, an assembly of CaMKII oligomers could be a key element of a molecular mechanism of learning and memory. However, there is no direct evidence that a formation of CaMKII oligomer relates to a memory mechanism.HS-AFM movies of CaMKII showed solid structures and fluctuated globular structures. By using truncated CaMKII, solid and globular structures were assigned to hub and kinase domains, respectively. Interestingly, 14-mer ring structures were observed in the truncated CaMKII, while 12-mer structures were observed in full-length CaMKII. These results suggest that hub domain has a strong assemble ability, while kinase domain regulates an oligomeric structure of CaMKII. Furthermore, HS-AFM revealed that a flexibility of a linker region is important for the activation of CaMKII.<br />研究課題/領域番号:16K18523, 研究期間(年度):2016-04-01 – 2018-03-31
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論文 |
論文
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内橋, 貴之 ; Uchihashi, Takayuki
概要:
金沢大学理工研究域数物科学系<br />昨年度までに開発した高速AFMインタラクティブモードの応用研究を進めた。具体的には、インタラクティブモードによりクラミドモナス鞭毛の軸糸微小管を部分破壊し、それによる微小管の崩壊を観察することで、微小
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管内部の結合タンパク質が微小管の構造を安定化していることを明らかにした。また、超分子ポリマーの部分切断と再重合過程や酸化還元酵素であるペルオキシレドキシンの高分子複合体の構造解析に関する研究にも応用した。これらにより、インタラクティブモード高速AFMがタンパク質の分子動態の操作だけでなく、分子複合体の部分破壊を利用した堅さ計測や構造解析に利用できることがわかった。分子動態の観察によって分子の柔らかさと機能の関係を明らかにすべく、分子シャペロンClpBのイメージングを行った。ATPの結合と加水分解に依存したClpB六量体リング構造の柔軟な形状変化が観察された。様々な変異体解析により、六量体リング構造の切断と回復などのダイナミックな構造変化がClpBシャペロン機能に重要であることを明らかにした。<br />研究課題/領域番号:26102515, 研究期間(年度):2014-04-01 – 2016-03-31
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| 8.
論文 |
論文
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内橋, 貴之 ; Uchihashi, Takayuki
概要:
金沢大学理工研究域数物科学系<br />昨年度までに開発した高速AFMインタラクティブモードの応用研究を進めた。具体的には、インタラクティブモードによりクラミドモナス鞭毛の軸糸微小管を部分破壊し、それによる微小管の崩壊を観察することで、微小
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管内部の結合タンパク質が微小管の構造を安定化していることを明らかにした。また、超分子ポリマーの部分切断と再重合過程や酸化還元酵素であるペルオキシレドキシンの高分子複合体の構造解析に関する研究にも応用した。これらにより、インタラクティブモード高速AFMがタンパク質の分子動態の操作だけでなく、分子複合体の部分破壊を利用した堅さ計測や構造解析に利用できることがわかった。分子動態の観察によって分子の柔らかさと機能の関係を明らかにすべく、分子シャペロンClpBのイメージングを行った。ATPの結合と加水分解に依存したClpB六量体リング構造の柔軟な形状変化が観察された。様々な変異体解析により、六量体リング構造の切断と回復などのダイナミックな構造変化がClpBシャペロン機能に重要であることを明らかにした。<br />研究課題/領域番号:26104514, 研究期間(年度):2014-04-01 – 2016-03-31
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論文 |
論文
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長尾, 秀実 ; Nagao, Hidemi
概要:
金沢大学理工学域数物科学系<br />X線構造解析により酸化型アズリン(Az)と還元型シトクロムc551(Cyt)の構造が知られている。各立体構造にプロトンを付加し、各活性部位付近の必要パラメータを各活性部位類似のクラスターモデルを用いて密
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度汎関数法(UB3LYP/6-31G^<**>/ESP)により見積もった。これらの立体構造を用いてAz_<ox>-Cyt_<red>複合体構造最適化をZDOCKプログラムパッケージおよび独自開発プログラムで予測した。これらの座標データから3つの複合体モデルを作成した。(1)水素結合を含む静電相互作用エネルギーを最小にしたモデル。(2)疎水性相互作用エネルギー最小にした構造。(3)活性部位の電荷分布をAz_<red>-Cyt_<ox>型にしたモデル。これら3通りのモデルよるタンパク質複合体の溶液内での安定性を溶媒和自由エネルギー計算に評価した。計算した構造エネルギーに溶媒和自由エネルギー,エントロピーを加えることで新しく定義したタンパク質の自由エネルギーの計算結果は活性部位の電荷分布をAz_<red>-Cyt_<ox>型にしたモデルが最も低い値を示した。結合自由エネルギーの評価には、複合体を形成する前のAz_<ox>単体の構造とCyt_<red>単体の構造における溶媒和エネルギー,構造エネルギー,エントロピーを評価し、タンパク質複合体の自由エネルギーとの差から評価した。Az_<ox>, Cyt_<red>単体と複合体の自由エネルギーの差は-107kcal/mol、構造エネルギーの差は-47kcal/mol、エントロピーの差は31kcal/molとなった。これらの結果から結合自由エネルギーの値は-123kcal/molであることが示され、タンパク質複合体の結合自由エネルギーには溶媒和自由エネルギーが大きく寄与していることがこれらの計算結果から示された。<br />研究課題/領域番号:20038018, 研究期間(年度):2008 – 2009
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論文 |
論文
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長尾, 秀実 ; Nagao, Hidemi
概要:
金沢大学自然科学研究科<br />X線構造解析により知られている酸化型アズリン(Az_<ox>)と還元型シトクロム(Cyt_<red>)の立体構造を用いてAz_<ox>-Cyt_<red>複合体構造最適化をZDOCKプログラムパッケージおよ
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び独自開発プログラムで予測した。Amber力場と活性部位付近の量子化学計算で見積もられた力場を用い、5854個のTIP5P水分子を加えた系を300K、NVTアンサンブル条件下でシミュレーションした。シミュレーションによりAz_<ox>-Cyt_<red>複合体安定構造を見いだした。ドッキングサイトは二つの部分に分けられ、いずれの部分もターン構造中にあり、水素結合で強く結合しAz_<ox>-Cyt_<red>複合体を形成していることがわかった。本研究により複合体に関わる水素結合部位が明確に示された。次にAz_<ox>-Cyt_<red>複合体ダイナミックスを考察した。会合前後でCyt_<red>タンパク質振動が大きく変わっていることが見いだせた。またドッキングサイトではAz_<ox>とCyt_<red>との協調的振動モードが現れ、タンパク質構造変化のみならず、振動主成分変化が観測された。還元型アズリン(Az_<red>)は空気中酸素により酸化され結晶化が容易ではない。Az_<red>-Cyt_<ox>複合体構造決定もまた、空気中酸素による複合体酸化が起こるため現在のところ実験で決定するのは容易ではない。そこでAz_<red>-Cyt_<ox>複合体における各活性部位付近の電荷分布を用いた構造緩和シミュレーションを行った。Amber力場と活性部位付近の量子化学計算で見積もられた力場を用い、6204個のTIP5P水分子を加えた系を300K、NVTアンサンブル条件下でシミュレーションした。構造緩和後、複合体安定構造を見いだした。Az_<red>-Cyt_<ox>複合体ドッキングサイトはAz_<ox>-Cyt_<red>複合体のものとほぼ一致していることを見いだした。またDynamical Cross Correlation MapによりAz_<red>のαヘリックスとCyt_<ox>のほぼ全体が強く動的相関を持つことが見いだされた。一般にタンパク質ターン構造部分はB因子(RMSF)が最も大きく、次にαヘリックス部分が大きい。本研究結果からターン構造部分にドッキング部位があり、AzとCytのドッキングによりターン構造部分の運動が束縛される。そしてαヘリックス部分へのエネルギー移動が示唆される。<br />研究課題/領域番号:19029014, 研究期間(年度):2007<br />出典：「タンパク質複合体構造とダイナミックスの理論的研究」研究成果報告書 課題番号19029014（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-19029014/)を加工して作成
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論文 |
論文
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
金沢大学理工研究域物質化学系<br />我々が世界に先駆けて開発した高速原子間力顕微鏡をタンパク質などの生体高分子の機能ナノ動態撮影に実用化する上で障害となる装置上の問題点を発見・解決するとともに、特定の試料対象に対してその基板への固定法な
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どを開発し、高速原子間力顕微鏡をタンパク質の新しい研究手段にすることを本研究は目指している。対象試料をモータータンパク質系に絞って研究を進めてきた。モータータンパク質(ダイニンC、ミオシンV)が単独に在る場合には、マイカ表面を改変せず、また、溶液条件を特別なものにしなくとも、これらの蛋白質は緩やかにマイカ表面に吸着し、分子内のかなりの部分がマイカ表面から自由であった。従って、ATPase反応にともなう構造変化を比較的容易にイメージングできた。ダイニンCでは、ストークとヘッド部はATPの影響が見られないのに対して、ステム部はATP存在下で2つの位置を行ったり来たりする様子が観察された。その頻度はATPターンオーバー時間にほぼ等しく、ステムの運動がATPase反応に共役していることは明らかである。ミオシンVのATPase活性は極めて低いので、構造形態変化を繰り返し捉えることは難しい。そこで、Caged-ATPに紫外線を照射しATPを放出する前後をイメージングする方法でATPase反応にカップルした構造形態変化を捉えた。紫外線照射後素早く頭部が大きく屈曲し、1-2秒の内にもとのまっすぐな形態に戻った。装置の改良により、ATP存在下でアクチンフィラメントとミオシンVが弱く相互作用する系についても、系を乱すことなく、イメージングすることが可能になった。現在この系に集中して、ミオシンVの動的挙動の研究を進めている。ダイニンCとマイクロチュービュルが共存する系については未だ着手していない。<br />研究課題/領域番号:14654071, 研究期間(年度):2002 – 2003<br />出典：「タンパク質の分子機能動態及び場のリアルタイムイメージングを目指して」研究成果報告書 課題番号14654071（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14654071/)を加工して作成
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| 12.
論文 |
論文
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國嶋, 崇隆 ; Kunishima, Munetaka
概要:
トリアジンを含む脱水縮合剤は水やアルコール中でもアミドを合成できる上に,様々な官能基の導入が容易であるという点で特に優れている。本課題では,これらの特性を利用して,水を含む均一系の種々の溶媒,ポリマー,界面,タンパクなど,多様な反応場での反
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応を検討した。その結果,従来法と比べて簡便な化学変換反応の開発や,膜やタンパク質などの生体分子の機能解析に役立つ新技術を開発することに成功した。<br />Dehydrocondensing reagents composed of 1,3,5-triazine are superior to other related reagents because they allow synthesizing amides in aqueous solvents or in alcohols, in addition, a diversity of functional groups can be readily introduced into the chlorotriazine ring. In this research project, we examined reactions using such useful triazine reagents in various reaction fields including aqueous or non-aqueous homogeneous solvents, polymers, interfaces, and proteins. As a result, we succeeded in developing several new chemical transformation methods, and new technologies available for functional analysis of biomolecules such as membranes or proteins.<br />研究課題/領域番号:20390007, 研究期間(年度):2008-2010
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| 13.
論文 |
論文
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
分子・細胞で起こるダイナミックな現象を高解像で直接可視化できる高速原子間力顕微鏡を世界に先駆けて完成させた。その結果、いくつかの機能中のタンパク質分子の動的構造変化や動的分子プロセス、生きた細胞で起こる動的現象を撮影することに成功し、この新
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規顕微鏡の有効性、革新性を実証した。<br />I have accomplished, ahead of the world, the development of a high-speed atomic force microscope that can directly visualize dynamic phenomena occurring in molecules and cells at high resolution. Consequently, dynamic structural changes and molecular processes of proteins in action as well as dynamic phenomena occurring in live cells have been successfully filmed. Thus, the usefulness and innovative power of this new microscope have been demonstrated.<br />研究課題/領域番号:20221006, 研究期間(年度):2008-05-12 – 2013-03-31
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論文 |
論文
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
(a) We manufactured an atomic force microscope that was able to be scanned faster and less susceptible to drift than ord
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inary AFM apparatuses. This AFM was attached to an epiluminescence fluorescence microscope. To show the high performance of our AFM apparatus we tried to obtain high resolution images of myosin heads (subfragment-1) in aqueous solution. The images revealed fine structures that was comparable to those in an atomic model of S1 derived from x-ray crystallography of S1. In the AFM images we were able to see the ATP binding site as well as the large cleft at the tip of S1. These results proved that our AFM apparatus was on the level of the greatest in the world. (b) We performed a study preparatory to the development of a high-speed AFM in which one image would be acquired within 30msec. We designed and manufactured a high-speed scanner and attained high-speed imaging where one image was obtained within 150msec. By way of experiment we produced an AFM that employed a displacemant detection system suitable for high-speed imaging. We also examinds methods for preparing cantilevers that were suitable for a high-speed AFM.From these preparative studies we were able to secure a scaffolding for the development of the video-rate AFM. (c) To measure bimolecular interaction force at a truly single molecular level we developed a method to capture a single molecule of protein at the apex of a cantilever tip. Using this method we succeeded in quantifying the force field exerted between a single molecule of heavy meromyosin (HMM) and actin. Using this new technology we also discovered that ATP binding to HMM heads induced vibratile structural changes in HMM heads.<br />1.従来のAFM装置より高速に走査でき、ドリフトの影響を受けにくいAFMを製作し、これを蛍光顕微鏡に組み込んだ。この装置の高い性能を示すために、液中にあるミオシン頭部(S1)の像を高い分解能で得ることを試みた。X線結晶解析で得られているS1の原子モデルと細かい点まで比較できるほどの解像度の高い像を得ることができた。ATP結合部位や頭部先端にあるクレフトまで観察することができ、世界最高レベルのAFMであることを実証した。2.将来AFMをビデオレートにまで高速化するための準備研究を行った。高速走査できるスキャナーを設計・製作し、1画像を150msecで撮れる走査速度を実現した。高速AFMに適した変位検出法を採用したAFMを試作した。また、高速走査に適したカンチレバ-作製法の検討を行った。これらの研究により最終的な高速化を図るための足がかりを掴むことができた。3.真に1分子レベルで分子間相互作用を計測するために、カンチレバ-探針先端に蛋白質1分子を捕捉する方法を開発した。これによって、ミオシンのサブフラグメント(HMM)1分子とアクチン間に働く力の場の諸性質を定量化することに成功した。更に、HMMがATPに結合したあとに振動する構造変化がHMM頭部に起こることを発見した。<br />研究課題/領域番号:06558099, 研究期間(年度):1994–1996<br />出典：「生物研究用走査型プローブ顕微鏡の製作」研究成果報告書 課題番号06558099 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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論文 |
論文
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安藤, 敏夫 ; Ando, Toshio
概要:
金沢大学新学術創成研究機構ナノ生命科学研究所<br />三つの課題に取り組んだ。課題1では、既に確立した高速AFMを利用して多様な蛋白質系で起こる動的プロセスを観察し、機能メカニズムに迫るとともに、従来技術では困難な天然変性蛋白質の構造解析
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が高速AFMで可能であることを実証した。課題2では、振動を起こさずに広域を高速走査する技術やイメージング中に試料を操作可能なインターラクティブ高速AFMを開発し、その有効性を実証した。また、カンチレバー走査方式の高速AFMと蛍光顕微鏡との複合機を開発し、蛍光像と高速AFM像の同時取得を実現した。課題3では、非接触観察可能な走査型イオン伝導顕微鏡の高速化に向け要素技術を開発し、約100倍の高速化に成功した。<br />We worked on three subjects. In subject 1, we elucidated the functional mechanism of various protein systems by observing their dynamic processes using high-speed AFM (HS-AFM) that we had established before. Besides, we demonstrated that HS-AFM can analyze the structure of intrinsically disordered proteins that are difficult to analyze with conventional methods. In subject 2, we developed fast/wide-area scanning techniques without generation of unwanted vibrations and an interactive HS-AFM technique that can manipulate the sample during imaging. The usefulness of these new techniques were demonstrated. In addition, we developed cantilever-scan type of HS-AFM combined with fluorescence microscopy, and thereby, made it possible to capture HS-AFM and fluorescence images simultaneously. In subject 3, we developed high-speed scanning ion conductance microscopy that can image the sample without contact with the sample. The imaging speed reached a level 100-times faster than before.<br />研究課題/領域番号:24227005, 研究期間(年度):2012-04-01 - 2017-03-31
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論文 |
論文
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村越, 道生 ; Murakoshi, Michio
概要:
細胞膜電位コントロールデバイスを開発し，これを用いてプレスチンを発現させた培養細胞の電気特性計測及び単離細胞膜表面の微細構造観察を試みた．その結果，デバイス基板の微小孔（直径約2 um）上に，細胞をポジショニングすることに成功し，細胞膜表面
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の詳細構造の可視化にも成功した．さらに，デバイス基板の微小孔上に，人工脂質膜を作製することを試み，脂質膜形成後にギガオームシールが形成されることが確認された．このことは，当該デバイスで脂質膜中に再構成したタンパク質の変形挙動を可視化できる可能性を示唆している．今後，得られた知見を基に，プレスチンの変形挙動の可視化に取り組む．<br />A cell membrane potential control device was developed. Using this device, the microstructure and electrophysiological properties of prestin-expressing culture cells were investigated. A cell was successfully positioned on a micropore of the device (about 2 um in diameter) and the microstructure of the cell surface was visualized. In addition, an artificial lipid bilayer was created on the micropore, resulting in the formation of a gigaohm seal. These results suggest that it may be possible to visualize protein reconstituted in the lipid bilayer by using this device. Based on these findings, further research to visualize the conformational change of prestin will be performed.<br />研究課題/領域番号:24791739, 研究期間(年度):2012-04-01 - 2014-03-31
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論文 |
論文
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内橋, 貴之 ; Uchihashi, Takayuki
概要:
金沢大学理工研究域数物科学系<br />室温から約45℃の温度制御可能な高速AFMシステムを開発した。実際に、41度で固相から液相に相転移する脂質二重膜(DPPC)を用いて高温観察の評価を行い、相転移温度以上で膜の流動性が増加し脂質二重膜の
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形状が変化する様子を確認できた。温度制御システムを使って、べん毛の輸送タンパク質の一部であるFliIの観察を行ったところ、モノマーから六量体形成していく過程やFliI六量体の構造が変化する様子も観察できた。シアノバクテリアの概日周期タンパク質であるKaiCとKaiAの結合解離過程の温度依存性の測定にも成功した。<br />We have developed variable-temperature high-speed atomic force microscopy (VT-HS-AFM) with which the experimental temperature can be controlled ranging from a room temperature to around 40 ℃. The performance of VT-HS-AFM was confirmed by observation of fluidity of DPPC lipid bilayer with the phase-transition temperature of 41℃ from gel phase to liquid crystal phase. We applied the VT-HS-AFM system to observation of a flagellar protein, FliI, which is an ATPase with the activity optimum temperature over 40℃. HS-AFM images captured oligomerization processes of the FliI monomers to the hexamer and also conformational changes of the oligomers. Also we observed temperature dependent interaction between KaiC and KaiA which are proteins responsible to the circadian rhythm of Cyanobacteria.<br />研究課題/領域番号:15H03540, 研究期間(年度):2015-04-01 - 2018-03-31
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論文 |
論文
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内橋, 貴之 ; Uchihashi, Takayuki
概要:
高速原子間力顕微鏡(AFM)によってタンパク質の凝集を解く分子シャペロンClpBの構造ダイナミクスを観察した。ClpB６量体リングの形状がATP濃度依存的に大きく揺らぐことを見出した。このリング構造の揺らぎがClpBの脱凝集活性に寄与してい
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ることを示唆する結果が得られた。高速AFM/蛍光顕微鏡複合機の性能を向上し、高速AFMと蛍光顕微鏡で一分子の同視野かつ同時観察が可能となった。回転モータータンパク質であるV1-ATPaseにおいて回転軸であるDFサブユニットがなくても、回転子リング内でATP加水分解によるサブユニットの構造変化が協同的に一方向へ伝搬していくことを明らかにした。<br />We observed conformational dynamics of a molecular chaperone ClpB which disaggregates denatured proteins. We found that the hexameric ring of the TClpB dynamically changes between symmetric, asymmetric and broken ring. Also it was indicated that the dynamic fluctuation of the ring structure is essential for the chaperon activity of ClpB.We also improved combined system high-speed AFM and fluorescent microscopy. The combined system enabled simultaneous single-molecule imaging with high-speed AFM and fluorescence microscopy. We succeeded in observing processive movement of enzymatic chitinase with fluorophores along a chitin fibril and further conformational change of F1-ATPase and binding/dissociation of fluorescent-ATP analogue. We have applied high-speed AFM to investigate cooperative conformational change of V1-ATPase without the shaft (DF subunit). We found that conformational change of the A subunit propagates unidirectionally in the hexameric ring even without the shaft.<br />研究課題/領域番号:24241048, 研究期間(年度):2012-04-01 - 2015-03-31
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論文 |
論文
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大貝, 和裕 ; Ogai, Kazuhiro
概要:
本研究では、褥瘡（いわゆる床ずれ）が治った後、再びその部位で褥瘡が発生するか否かを、皮膚のタンパク質を分析することで判断できるかを検討した。タンパク質の分析として、電気泳動によるパターン分析と、サンプル中にあるタンパク質を一斉に解析するプロ
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テオームを実施予定であった。タンパク質を一斉に解析する方法については確立できた。この方法を用いて分析を行う予定であったところ、COVID-19の流行により実験自体が一時停止してしまった。その後、電気泳動によるバンドパターン比較により再発する人としない人のパターン差異を見いだすことには成功したものの、そのタンパク質の詳細については現在も分析中である。<br />In this study, we investigated whether it is possible to predict pressure ulcer (so-called bedsore) recurrence in the area after they have healed by analyzing skin proteins. For the protein analysis, we planned to use pattern analysis by electrophoresis and proteome for all detectable proteins in the sample. The method for comprehensive analysis of proteins has been established. We had planned to conduct the analysis using this method, but the experiment itself was temporarily stopped due to the COVID-19 epidemic. After that, we succeeded in finding the difference in patterns between those who had recurrence and those who did not by comparing band patterns by electrophoresis, but the details of the proteins are still under analysis.<br />研究課題/領域番号:18K10142, 研究期間(年度):2018-04-01 - 2021-03-31<br />出典：「網羅的スキンブロッティング法による「褥瘡予測タンパク質」の探索と臨床応用」研究成果報告書 課題番号18K10142（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-18K10142/18K10142seika/）を加工して作成
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論文 |
論文
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小出, 寛 ; Koide, Hiroshi
概要:
金沢大学医学系研究科<br />平成12年度は,コンディショナル活性型STAT3(STAT3-ER)を恒常的に発現するES細胞株を用い、STAT3を活性化したES細胞と活性化していないES細胞の間で発現量が異なる遺伝子を、サブトラクション法
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やマイクロアレイ法によって探索した。またES細胞をLIF存在下で培養した場合と非存在下で培養した場合の間で発現量の異なる遺伝子についても、同様の方法で探索した。その結果、LIFやSTAT3の標的遺伝子と思われる候補遺伝子を多数見いだした。平成13年度には、これらの候補遺伝子のうち、embryonic ectodem development (eed) 、ならびにzinc-finger protein(zfp)57に注目して研究を進めた。まずノーザンブロット法を用いて、2つの遺伝子がLIF存在下では発現し、LIF非存在下では発現が低下していることを確認した。さらにZfp57については、未分化状態維持に必要であることが知られているOct-3/4と結合することを見い出した。またHEK293細胞を用いてレポーターアッセイを行った結果、Oct-3/4の標的遺伝子であるRex-1の発現をOct-3/4とZfp57が協同的に誘導することが判明した。一方、Eedはヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)と複合体を形成することが報告されている。HDACは様々な遺伝子の発現抑制に関与することが知られているので、EedとHDACが共同してなんらかの遺伝子の発現を抑制している可能性があった。そこでES細胞をHDAC阻害剤で処理したところ、LIF存在下でも分化が誘導された。このことから、HDACによる分化誘導因子の発現抑制にEedが関与している可能性がある。興味深いことに、EedがRex-1とも結合することを見い出した。以上の結果からOct-3/4とSTAT3の標的分子であるZfp57によって誘導されたRex-1がSTAT3標的分子EedやHDACと結合して、ES細胞の分化誘導因子の発現を抑えることによって、ES細胞の未分化状態が維持されている可能性が考えられた。<br />STAT3 is a transcriptional factor that is involved in self-renewal of embryonic stem (ES) cells. To identify target genes of STAT3 in the self-renewal, we searched for a gene(s) that shows higher expression in undifferentiated ES cells than in differentiated ES cells by using subtraction method and DNA microarray, and found several candidate genes. Of them, we focused our attention on the following two genes.1. zinc-finger protein (zfp) 57 Oct-3/4, a pluripotent stem cell-specific transcription factor, plays a critical role in the self-renewal of ES cells. Several evidences suggest that gene expression via Oct-3/4 requires an unidentified co-factor(s). We found that Zfp57 is expressed during the self-renewal of ES cells, while its expression is reduced upon differentiation. By co-immunoprecipitation assay, it was also found that Zfp57 interacts with Oct-3/4. Furthermore, Zfp57 enhanced the transcriptional activity of Oct-3/4 towards the promoter of rex-1, an Oct-3/4 target gene, in human embryonic kidney 293 cells. Our data suggest that Zfp57, a target of STAT3, is one of the Oct-3/4 co-factors, and raise the possibility that this protein may cooperate with Oct-3/4 in induction of Rex-1, which in turn may play an important role in the self-renewal of ES cells.2. Embryonic ectoderm development (eed) Recent studies revealed that gene expression is tightly associated with acetylation of histone, which is controlled by histone acetyltransferases and histpne deacylases (HDACs). Bed, a member of the polycomb family, is known to bind with HDAC. We found that Bed is one of the downstream molecules of STATS. Treatment of ES cells with trichostatin A, an HDAC inhibitor, led to the initiation of differentiation, suggesting that histone acetylation is involved in regulation of the self-renewal. Interestingly, we found that Bed forms a complex also with Rex-1. Since deacylation ofhistone generally results in repression of gene expression, these results suggest the possibility that the Eed・Rex-1・HDAC complex may maintain the undifferentiated state of ES cells by suppressing the expression of a differentiation-inducing gene(s).<br />研究課題/領域番号:12680669, 研究期間(年度):2000 – 2001<br />出典：「ES細胞の多分化能を維持する転写因子STAT3の標的遺伝子群の探索」研究成果報告書 課題番号12680669（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12680669/ ）を加工して作成
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図書 |
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城, 宜嗣 ; 青野, 重利 ; 齋藤, 正男
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