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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
ペプチドトランスポーターを利用した選択的な抗がん剤デリバリーの可能性を検証する目的で以下の検討を行った。1.ヒト小腸オリゴペプチドトランスポーターhPEPT1 cDNAをHeLa細胞に遺伝子導入し強制発現細胞(HeLa-hPEPT1)を得、
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その輸送活性を確認した。2.HeLa-hPepT1を背部皮下に移植した担がんマウス(Balb/c nu/nu)に、ベスタチンおよび[3H]カルノシンを投与し組織移行性を検討した結果、細胞間液のみ分布する[14C]イヌリンの値と比べ有意に高く、両ペプチドが腫瘍細胞内に蓄積することが示された。3.in vitroでのベスタチンに対する感受性の変化をMTT法により検討したところ、HeLa-hPEPT1細胞については2.2μg./ml似上の濃度において顕著な増殖抑制効果がみられた。in vivo実験として担がんマウスにベスタチン(0.5mg/kg)を28日間経口投与した結果、HeLa-hPEPT1を移植した腫瘍の増殖はmock細胞の腫瘍に比べて顕著に抑制された。4.ヒト由来の各種株化腫瘍細胞25株について、ペプチドトランスポーター遺伝子の発現量をリアルタイム定量PCR解析した結果、PEPT1の発現量はML-1細胞、NakajimaおよびCaco-2に顕著な発現が見られた。PEPT2は殆どの細胞に発現が見られた。各細胞のペプチド取り込み活性と比較した結果、トラスポーター発現量と輸送活性とが必ずしも一致しないことから、新規のペプチドトランスポーターの存在が示唆された。5.がん細胞に発現するOCTN、OATP等のトランスポーターのクローニングならびに機能特性解析、体内動態制御への利用法についての検討も行った。6.腫瘍細胞の増殖に関与するアミノ酸トランスポーターLAT1およびLAT2が、血液脳関門を形成する脳毛細血管内皮細胞にも発現すること明らかにした。<br />In the present study, we studied feasibility of drug delivery using oligopeptide transporter which expressed in some tumor cell lines. During this study period, we obtained following findings.1. A stable cell line which over expresses human oligopeptide transporter PEPT1 was established by transfecting hPEPTl cDNA into HeLa cells. Its transport actiyity was confirmed by measuring glycylsarcosine and termed the cell line HeLa-hPEPT1.2. Nude mice (Balb/c nu/nu mice) inoculated with HeLa-hPEPT1 bared tumor within several weeks. In these mice, I.v. injected an anti-tumor drug bestatine, and dipeptide carnosine were accumulated in the hPEPT1-expressing tumors.3. HeLa-hPEPT1 was more sensitive to bestatine than parent HeLa cell line by in vitro MTT assay. Tiimor growth of HeLa-hPEPT1 in nude mice was strongly suppressed by oral dose of bestatine to the mice, while that of HeLa inoculated mice was not affected.4. Messenger RNA expression levels of known oligopeptide transporters that is PEPT1 and PEPT2 were quantitatively analyzed by the real time PCR in iridivisual 25 tumbf lines. Among them ML-1, Nakajima and Caco-2 cells expressed PEPT1in high level on the other hand, PEPT2 expression was observed majority of cell lines examined. Comparing mRNA expression and transport activity profiles, we found little correlation between them. Therefore, existence ofnovel transporter that represents the uptake of peptides has been suggested.5. Molecular cloning of CDNA of organic cation transporter OCTNs and OATPs were performed and some of which were expressed in tumor cell lines.6. We have proved that expression of amino acid transporter LAT1 and LAT2, which play roles in tumor growth, in the blood-brain barrier.In conclusion, detailed characterization of many kinds of transporters which expressed in tumors will provide us valuable information to establish method for tumor specific delivery of drugs.<br />研究課題/領域番号:12557204, 研究期間(年度):2000-2001<br />出典：「ペプチド輸送系の組織特異的発現と分子認識多様性を利用した腫瘍選択的薬物デリバリー」研究成果報告書 課題番号12557204 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
本研究は、薬物の体内動態に影響を与えるトランスポーター群の多様な薬物構造認識・輸送機構を小腸、腎臓、肝臓、脳などの特定臓器に焦点を当て、臓器レベル、細胞レベル、オルガネラレベル、分子レベル、遺伝子レベルで解明し、薬物動態の臓器普遍性または臓
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器特異性を明確にすることを目的として、1)PEPT1、OCTN1、OCTN2、NPT1等について、各トランスポーター発現細胞における詳細なin vitroでの分子構造認識・輸送特性を明らかにした。2)有機アニオン系、有機カチオン系、ペプチド系等の薬物に対して生体に備わった物質輸送、蓄積、排泄機構の組織、細胞および細胞膜レベルでの検討を行った。3)それらのin vivo、in vitro実験の情報を元にした新規トランスポーター群(mOCTN1,mOCTN2,mOCTN3,OATP-B、OATP-C、OATP-D、OATP-E)のクローニングに成功した。4)クローニングしたトランスポーターに対する抗体の作成とそれを用いた組織内および極性細胞における細胞内局在性を明らかにするとともに、発現細胞を作成してその輸送特性を明らかにし、生体の種々生体物質および薬物輸送における役割について検討した。5)血液脳関門の持つ輸送機構の詳細を明らかにするため、不死化ラット脳毛細血管内皮細胞株を確立し、種々トランスポーターの機能発現を確認した。中枢移行性の少ない種々ニューキノロン抗菌薬やH1-アンタゴニストの輸送機構とABCトランスポーターの関与を明らかにした。6)OCTN2やOATP-C等のSNPsの機能特性を明らかにした。7)トランスポーターを発現するアデノウイルスベクターを構築し、本組換えウイルスをラットおよびマウスに投与することによって肝臓や血液脳関門に新たな薬物輸送活性を付与することに成功した。本研究によっていくつかの薬物の体内動態に及ぼすトランスポーターの意義が明確にされた。本研究の成果は、今後、合理的な医薬品の分子設計の提言し、臓器標的化を指向したドラッグデリバリーシステムの開発に役立てて行く必要がある。<br />The author' s research on transporter-mediated pharmacokinetics focuses on the molecular functional characteristics of drug transporters including oligopeptide transporter, monocarboxylic acid transporter, anion transporter, organic cation transporters, organic cation/carnitine transporters (OCTNs) and the ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and MRP2. We have successfully demonstrated that the transporters play important roles in the influxes and/or effluxes of drugs in intestinal and renal epithelial cells, hepatocytes and brain capillary endothelial cells that form the blood-brain barrier. In the systemic carnitine deficiency (SCD) phenotype mouse model, juvenile visceral seatosis (jvs) mouse, a mutation in the OCTN2 gene was found. Furthermore, several types of mutation in human SCD patients were found, demonstrating that OCTN2 is a physiologically important carnitine transporter. OCTNs transport not only carnitine but also various organic cationic drugs in a sodium-independent manner. It is suggested that OCTNs are multifunctional transporters for the uptake of carnitine into tissue cells and at the same time for the elimination of intracellular organic cationic drugs. In this research term, novel cDNA of organic anion transporters i.e., OATP-B, OATP-D and OATP-E have been isolated and functionally characterized. Furthermore, single nucleotide polymorphism of OATP-B, OATP-C and OCTN2 in the Japanese population was analyzed. Although more data should be collected, such information will enable us to establish ultimate drug delivery system.<br />研究課題/領域番号:12307057, 研究期間(年度):2000-2002<br />出典：「薬物トランスポーター群の分子認識・輸送の多様性に基づいた臓器移行性の制御」研究成果報告書 課題番号12307057 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
本研究では、薬物や生理的物質の体内動態に関わるトランスポーターの同定・機能解析を目的とした。得られた第一の成果は、新規に遺伝子クローニングに成功したOCTNトランスポーターファミリーの薬物ならびに生理的基質としてのカルニチン輸送解析である。
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本研究では、特にヒト及びマウスOCTN2の遺伝子クローニングを行い、その組織分布性や機能特性から生理的役割として脂肪酸代謝に重要なカルニチントランスポーターであることを実証した。すなわち、カルニチン欠乏症状を示すjvsマウスならびに臨床医の協力を得て得られた患者におけるOCTN2遺伝子解析によって、OCTN2遺伝子変異が直接的にカルニチン欠乏症と関連していることを示すことに成功した。さらに、OCTNはカルニチンとともに有機カチオンも輸送することが示された。しかも、カルニチンはナトリウムイオン依存的に、有機カチオン輸送はナトリウムイオン非依存的に輸送する多機能的トランスポーターであることが示された。本研究成果は、全身性カルニチン欠乏症の原因遺伝子の同定という、生理的・医学的に極めて意義のある研究成果となった。特にカルニチン欠乏症は小児においては致死的あるため、その遺伝子診断など臨床的に極めて有用な情報を提供する基礎研究成果となった。その他には、血液脳関門で働くモノカルボン酸トランスポーターMCT1の機能発現の実証、元来リン酸トランスポーターとしてクローニングされたNpt1がアニオン性薬物を輸送しその腎・肝排泄に関わること、キノロン系抗菌薬の臓器移行・排泄にはMRP2やP-糖蛋白質を含む複数のトランスポーターが関与していること等の結果が得られた。これら薬物輸送に働くトランスポーターの同定、機能解析、発現部位の同定、および薬物速度論的なトランスポーターの役割の解析研究は、トランスポーターを利用した薬物動態制御法の可能性を強く示すものである。<br />Various transporters that mediate membrane transport of drugs as well as physiological compounds were clarified by molecular cloning of the genes and their functional analysis by gene expression systems. The obtained results are as follows :1. Novel transporter family OCTNs were molecularly cloned and their transport functions were analyzed by transfection of the gene to HEK293 cells. Human and mouse OCTN2 transported physiologically important carnitine in a sodium dependent manner. JVS mice that show systemic carnitine deficiency(SCD) syndrome had a mutation in OCTN2 gene with loss of carnitine transport function. Furthermore, various mutations in OCTN2 gene were identified in patients who show the SCD syndrome. From these results, it was clarified that OCTN2 is a physiologically important camitine transporter and its mutation leads to the SCD. Interestingly, OCTN2 and its isoform OCTN1 transported organic cations in a sodium independent manner. Accordingly, OCTNs are unique transporters which have are multifunctionality by transporting carnitine and organic cations in the distinct mechanisms.2. Molecular characterization of the transporter for monocarboxylic acids at the blood-brain barrier (BBB) was performed. Monocarboxylic acid transporter MCT-1 gene was expressed at the BBB and was found to play important role in the transport of organic weak acids by the in vitro cultured cells and in vivo studies.3. Multiple efflux mechanisms for new quinolone antibacterial agent were found to be expressed at the BBB. They are P-glycoprotein and unknown transporters sensitive to anionic compounds. These multiple efflux transporters seem to restrict the brain distribution of quinolones and other drugs, resulting in a low distribution into the central nervous system.These lines of studies provide new insight of the siginificance of membrane transporters and new strategy to control disposition of drugs by focusing on the transporters function present in various tissues.<br />研究課題/領域番号:10470510, 研究期間(年度):1998-1999<br />出典：「薬物のトランスポーター介在輸送に基づいた臓器移行性の制御」研究成果報告書 課題番号10470510 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学大学院自然科学研究科<br />本研究では、薬物や生理的物質の体内動態に関わるトランスポーターの同定・機能解析を目的とした。得られた第一の成果は、新規に遺伝子クローニングに成功したOCTNトランスポーターファミリーの薬物ならびに生理
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的基質としてのカルニチン輸送解析である。本研究では、特にヒト及びマウスOCTN2の遺伝子クローニングを行い、その組織分布性や機能特性から生理的役割として脂肪酸代謝に重要なカルニチントランスポーターであることを実証した。すなわち、カルニチン欠乏症状を示すjvsマウスならびに臨床医の協力を得て得られた患者におけるOCTN2遺伝子解析によって、OCTN2遺伝子変異が直接的にカルニチン欠乏症と関連していることを示すことに成功した。さらに、OCTNはカルニチンとともに有機カチオンも輸送することが示された。しかも、カルニチンはナトリウムイオン依存的に、有機カチオン輸送はナトリウムイオン非依存的に輸送する多機能的トランスポーターであることが示された。本研究成果は、全身性カルニチン欠乏症の原因遺伝子の同定という、生理的・医学的に極めて意義のある研究成果となった。特にカルニチン欠乏症は小児においては致死的あるため、その遺伝子診断など臨床的に極めて有用な情報を提供する基礎研究成果となった。その他には、血液脳関門で働くモノカルボン酸トランスポーターMCT1の機能発現の実証、元来リン酸トランスポーターとしてクローニングされたNpt1がアニオン性薬物を輸送しその腎・肝排泄に関わること、キノロン系抗菌薬の臓器移行・排泄にはMRP2やP-糖蛋白質を含む複数のトランスポーターが関与していること等の結果が得られた。これら薬物輸送に働くトランスポーターの同定、機能解析、発現部位の同定、および薬物速度論的なトランスポーターの役割の解析研究は、トランスポーターを利用した薬物動態制御法の可能性を強く示すものである。<br />Various transporters that mediate membrane transport of drugs as well as physiological compounds were clarified by molecular cloning of the genes and their functional analysis by gene expression systems. The obtained results are as follows :1. Novel transporter family OCTNs were molecularly cloned and their transport functions were analyzed by transfection of the gene to HEK293 cells. Human and mouse OCTN2 transported physiologically important carnitine in a sodium dependent manner. JVS mice that show systemic carnitine deficiency(SCD) syndrome had a mutation in OCTN2 gene with loss of carnitine transport function. Furthermore, various mutations in OCTN2 gene were identified in patients who show the SCD syndrome. From these results, it was clarified that OCTN2 is a physiologically important camitine transporter and its mutation leads to the SCD. Interestingly, OCTN2 and its isoform OCTN1 transported organic cations in a sodium independent manner. Accordingly, OCTNs are unique transporters which have are multifunctionality by transporting carnitine and organic cations in the distinct mechanisms.2. Molecular characterization of the transporter for monocarboxylic acids at the blood-brain barrier (BBB) was performed. Monocarboxylic acid transporter MCT-1 gene was expressed at the BBB and was found to play important role in the transport of organic weak acids by the in vitro cultured cells and in vivo studies.3. Multiple efflux mechanisms for new quinolone antibacterial agent were found to be expressed at the BBB. They are P-glycoprotein and unknown transporters sensitive to anionic compounds. These multiple efflux transporters seem to restrict the brain distribution of quinolones and other drugs, resulting in a low distribution into the central nervous system.These lines of studies provide new insight of the siginificance of membrane transporters and new strategy to control disposition of drugs by focusing on the transporters function present in various tissues.<br />研究課題/領域番号:10470510, 研究期間(年度):1997-1998<br />出典：「薬物のトランスポーター介在輸送に基づいた臓器移行性の制御」研究成果報告書 課題番号10470510 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
金沢大学薬学部<br />本研究では、薬物や生理的物質の体内動態に関わるトランスポーターの同定・機能解析を目的とした。得られた第一の成果は、新規に遺伝子クローニングに成功したOCTNトランスポーターファミリーの薬物ならびに生理的基質としての
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カルニチン輸送解析である。本研究では、特にヒト及びマウスOCTN2の遺伝子クローニングを行い、その組織分布性や機能特性から生理的役割として脂肪酸代謝に重要なカルニチントランスポーターであることを実証した。すなわち、カルニチン欠乏症状を示すjvsマウスならびに臨床医の協力を得て得られた患者におけるOCTN2遺伝子解析によって、OCTN2遺伝子変異が直接的にカルニチン欠乏症と関連していることを示すことに成功した。さらに、OCTNはカルニチンとともに有機カチオンも輸送することが示された。しかも、カルニチンはナトリウムイオン依存的に、有機カチオン輸送はナトリウムイオン非依存的に輸送する多機能的トランスポーターであることが示された。本研究成果は、全身性カルニチン欠乏症の原因遺伝子の同定という、生理的・医学的に極めて意義のある研究成果となった。特にカルニチン欠乏症は小児においては致死的あるため、その遺伝子診断など臨床的に極めて有用な情報を提供する基礎研究成果となった。その他には、血液脳関門で働くモノカルボン酸トランスポーターMCT1の機能発現の実証、元来リン酸トランスポーターとしてクローニングされたNpt1がアニオン性薬物を輸送しその腎・肝排泄に関わること、キノロン系抗菌薬の臓器移行・排泄にはMRP2やP-糖蛋白質を含む複数のトランスポーターが関与していること等の結果が得られた。これら薬物輸送に働くトランスポーターの同定、機能解析、発現部位の同定、および薬物速度論的なトランスポーターの役割の解析研究は、トランスポーターを利用した薬物動態制御法の可能性を強く示すものである。<br />Various transporters that mediate membrane transport of drugs as well as physiological compounds were clarified by molecular cloning of the genes and their functional analysis by gene expression systems. The obtained results are as follows :1. Novel transporter family OCTNs were molecularly cloned and their transport functions were analyzed by transfection of the gene to HEK293 cells. Human and mouse OCTN2 transported physiologically important carnitine in a sodium dependent manner. JVS mice that show systemic carnitine deficiency(SCD) syndrome had a mutation in OCTN2 gene with loss of carnitine transport function. Furthermore, various mutations in OCTN2 gene were identified in patients who show the SCD syndrome. From these results, it was clarified that OCTN2 is a physiologically important camitine transporter and its mutation leads to the SCD. Interestingly, OCTN2 and its isoform OCTN1 transported organic cations in a sodium independent manner. Accordingly, OCTNs are unique transporters which have are multifunctionality by transporting carnitine and organic cations in the distinct mechanisms.2. Molecular characterization of the transporter for monocarboxylic acids at the blood-brain barrier (BBB) was performed. Monocarboxylic acid transporter MCT-1 gene was expressed at the BBB and was found to play important role in the transport of organic weak acids by the in vitro cultured cells and in vivo studies.3. Multiple efflux mechanisms for new quinolone antibacterial agent were found to be expressed at the BBB. They are P-glycoprotein and unknown transporters sensitive to anionic compounds. These multiple efflux transporters seem to restrict the brain distribution of quinolones and other drugs, resulting in a low distribution into the central nervous system.These lines of studies provide new insight of the siginificance of membrane transporters and new strategy to control disposition of drugs by focusing on the transporters function present in various tissues.<br />研究課題/領域番号:10470510, 研究期間(年度):1998 – 1999<br />出典：「薬物のトランスポーター介在輸送に基づいた臓器移行性の制御」研究成果報告書 課題番号10470510（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-10470510/104705101999kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作成
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