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篠崎, 康之 ; Shinozaki, Yasuyuki
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />本研究は，慢性腎臓病と腸管トランスポーターとの関連を，OCTN1およびその基質である食餌由来の抗酸化物質，ergothioneineに着目して検討したものである．CKDモデルマウスの小腸では，管腔側の
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細胞膜上に局在するOCTN1が減少し，ergothioneineの取り込みが低下していた．Ergothioneineが欠乏しているOCTN1ノックアウトマウスのCKDモデルでは，酸化ストレスが増大し，腎線維化が増悪することが確認された．これらの結果は，慢性腎臓病において腎臓と腸管との間に臓器連関が存在すること，および腎臓-腸管連関がCKDの進展に関与している可能性を示すものである．<br />This study examined the association between chronic kidney disease and intestinal transporter. We focused on organic cation transporter 1 (OCTN1) and its substrate, ergothioneine, which is the antioxidant material derived from diet. OCTN1 expression on the apical side of intestinal cell membrane decreased in chronic kidney disease (CKD) model mice, and the uptake of ergothioneine also decreased. In the OCTN1 knockout mice, which lacked ergothioneine, the increase of oxidative stress and exacerbation of kidney fibrosis were confirmed in CKD model. These results showed the presence of the linkage between CKD and intestinal transporter and this linkage might associate with clinical progress of CKD.<br />研究課題/領域番号:26860631, 研究期間(年度):2014-04-01 – 2016-03-31
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菊地, 晶裕 ; Kikuchi, Akihiro
概要:
金沢大学医薬保健研究域医学系<br />ミネラル(必須微量元素)は活性酸素の生産や消去と密接に関連する因子であり、それらの輸送メカニズムを分子レベルで解明することは、細胞内における活性酸素濃度の制御メカニズムを理解するために必須である。本研
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究では、X線吸収スペクトルを利用し、活性酸素の生産に関連する鉄トランスポーターの局所構造を解析する手法を確立した。さらに、活性酸素の消去に関連するセレンのトランスポーターであるセレノプロテインPをヒト血漿から高純度に精製し、その微結晶を得ることに成功した。今後の結晶構造解析によりセレンの輸送メカニズム解明が期待される。<br />A fine-tuned balance between production and scavenging of reactive oxygen species (ROS) is crucial for living cells. Since minerals (essential trace elements) can be a factorin regulation of ROS level, mechanisms of mineral transport at molecular level are essential for understanding the tuning mechanism of the ROS level in living cells. In this study, techniques for analysis of local structure around mineral using X-ray absorption spectroscopy has been established. Also, micro crystals of selenoprotein P, a selenium transporter, have been obtained. Further crystallographic study will be contributed the finding of scavenging mechanism of ROS by selenium-sites in the protein.<br />研究課題/領域番号:23790264, 研究期間(年度):2011 – 2012
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杉浦, 智子 ; Sugiura, Tomoko
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />アダプタータンパク質PDZK1が、小腸に発現する複数の吸収トランスポーター(PEPT1, OCTN2, OATP1A)のapical膜上での発現を制御し、その基質化合物の消化管吸収を制御することをin
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vivoで示した。pdzk1遺伝子欠損マウス(pdzk1^<-/->)では、小腸の吸収トランスポーターだけでなく、排出トランスポーターBCRPの発現が著しく低下し、その基質であるcimetidineの消化管吸収が増加した。このようにPDZK1は小腸に発現する取り込みおよび排出トランスポーターを制御することで、栄養物の効率的な吸収と異物からの防御を同時に行なっていると考えられる。<br />Transporter adaptor protein PDZK1regulates several influx transporters(PEPT1and OCTN2) in small intestine, and their expression on the apical membrane is diminished in pdzk1gene knockout mice(pdzk1^<-/->). In addition, we have identified that PDZK1regulates the expression of organic anion transporting polypeptide OATP1A and intestinal absorption of its substrate, estrone-3-sulfate. In the present study, we attempted to use pdzk1^<-/-> mice to functionally identify influx transporters responsible for intestinal absorption of cimetidine. Contrary to our expectation, the expression level of intestinal efflux transporter for cimetidine, BCRP, was significantly decreased in pdzk1^<-/-> mice, and plasma concentration of cimetidine after oral administration to pdzk1^<-/-> mice was higher than that in wild-type mice. Taken together, these findings demonstrate that PDZK1plays a pivotal role in the apical localization of both influx transporters and efflux transporter in small intestine.<br />研究課題/領域番号:22790152, 研究期間(年度):2010-2011
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玉井, 郁巳 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系 / 東京理科大学<br />医薬品の薬効・毒性への影響が大きい肝動態を決める、肝有機アニオン輸送体の種差に関する研究を行なった。特にOATP と呼ばれるは輸送体はヒト動物とも肝臓に複数のサブタイプが発現しており
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、種間の対応付けが不明であった。そこで、ヒトOATP とラットOatp 発現系、さらに両種からの肝細胞、ラット全身動態試験を行ない、機能的に対応する分子の同定を試みた。その結果、β-ラクタム抗生物質については、ヒトOATP1B3 とラットoatp1a4 が両種間機能的に対応する分子であることが示された。両者は遺伝子・アミノ酸配列として相同性が高くないため、動物の薬物動態データからヒト予測を行なうためには、タンパク質構造のみならず機能解析も行なう必要性を示し、今後の医薬品の開発・臨床適用における有用な知見を得ることが出来た。<br />研究課題/領域番号:19390046, 研究期間(年度):2007 – 2008<br />出典：「有機アニオン輸送体を介した薬物の肝移行性調節とその種差」研究成果報告書 課題番号19390046（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-19390046/19390046seika/)を加工して作成
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吉澤, 邦夫 ; Yoshizawa, Kunio
概要:
金沢大学附属病院<br />口腔扁平上皮癌における白金製剤の細胞内輸送能とその感受性との関連を調べることを目的に、がん浸潤様式(山本・小浜分類の由来)の由来が明確な口腔扁平上皮癌8種および病理組織切片を用いて実験に供した。In vivo に
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おける高度浸潤癌ではATP7B 発現が強く、予後不良であり、in vitro ではATP7B 発現がCDDP 排出により細胞内CDDP 蓄積量を減少させ、CDDP 抵抗性に関与していることが示唆された。<br />研究課題/領域番号:19890085, 研究期間(年度):2007 – 2008<br />出典：「口腔扁平上皮癌における白金製剤感受性と浸潤能との関連」研究成果報告書 課題番号19890085（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-19890085/19890085seika/)を加工して作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
金沢大学自然科学研究科<br />本課題では,薬物送達に有用な皮膚に注目し,ここにおいて,薬物の細胞内外の輸送を担う膜タンパク質、トランスポーター群の機能を解析し,経皮投与の可能性の拡大,皮膚の薬物トランスポーターを利用した新規薬物送達シス
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テム開発に基盤的知見を提供すること目的としている。昨年度は,皮膚におけるNSAIDsであるフルルビプロフェン透過機構に有機アニオントランスポーターが関与していることが示唆された。本年度は,代表的な排出型トランスポーターであり,皮膚においても発現が観察されているMDRIおよびMRP1に関してその検証実験を実施した。前年度同様,モデル動物としてマウスを採用し,MRPIおよびMDR1の寄与をそれぞれの遺伝子欠損マウスから採取した皮膚を用いUssing chamber法で解析した。Mrp1遺伝子欠損マウスにおいては,モデル化合物としてfluo 3を採用した際に,表皮側および真皮側の両方において排出方向の活陸低下が認められた。このことから,Mrp1は皮膚組織から薬物、異物を排除する機能を発揮していることが示唆された。一方,Mdr1遺伝子欠損マウスにおいては,ローダミン123をモデル化合物として採用した際に,表皮→真皮方向の輸送活性の低下が観察された。以上から,排出型トランスポーターが皮膚組織において機能していることが明らかとなった。近年,医薬品添加剤による薬物トランスポーターの機能阻害、促進が報告されていることから,このような知見と本課題の成果を併せることにより,皮膚を利用した新規薬物送達システムの開発に繋がるものと期待される。<br />研究課題/領域番号:18659039, 研究期間(年度):2006 – 2007<br />出典：「経皮吸収性の飛躍的向上を目指したトランスポーター分子標的化薬物デリバリー」研究成果報告書 課題番号18659039（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-18659039/)を加工して作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />本研究は、薬物輸送能を有するトランスポーター遺伝子あるいはアンチセンス配列を臓器にin vivoで導入する発現ベクターを構築し、薬物の特異的かつ能動的な組織送達が可能であるかを検証するものである。しか
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し、このためにはin vitro系における厳密な検討が必要であり、このため、本年度は、トランスポーター遺伝子発現用ベクターに代表的トランスポーターであるペプチド・トランスポーター遺伝子(PEPT1、PEPT2、HPT1)遺伝子を組み込み、これらの機能を培養細胞発現系で解析した。PEPT1はβ-ラクタム系抗生物質などの腸管取り込み輸送に大きな役割を有していると考えられるが、特にセファレキシン輸送時には、「ペプチダーゼ様活性」の存在が示唆された。PEPT1のこのようなペプチダーゼ活性は他のペプチドトランスポーター(PEPT2、HPT1)などと比して、非常に大きいものであった。このペプチダーゼ活性は、種々のペプチダーゼインヒビターによって阻害を受けた。このことは、個体(in vivo)においてPEPT1を利用した組織特異的薬物デリバリーに至適な薬物をデザインする際に重要な知見であると考えられる。これまでのところ、ペプチダーゼのような消化酵素活性を有するトランスポーター群は知られておらず、その作動機序には大きな関心が寄せられる。しかしながら、PEPT1の輸送機能およびペプチダーゼ用活性の解明は、培養細胞発現系のみでの解析系では限界であると考えられる。酵素活性がトランスポーターに由来するものか?あるいは、発現によって誘導されたものかは明確とは言えないため、今後は、これまでに我々が構築してきた発現系を利用したトランスポータータンパク質の精製・再構成および機能解析が必須と考えられ、現在、その検討に向けて準備段階にある。<br />研究課題/領域番号:16659037, 研究期間(年度):2004 – 2005<br />出典：「トランスポーター発現アデノウイルスベクターを用いた薬物の能動的組織デリバリー」研究成果報告書 課題番号16659037（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16659037/)を加工して作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />1997年に我々が発見した有機カチオントランスポーターOCTN1は、腎刷子縁膜に存在することが想定されていながらその分子的実体が未だ不明である有機カチオン輸送体と、機能的に類似していることが遺伝子発現
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系を用いた解析により示されている。しかし腎以外の臓器における機能は未だ不明である。本研究ではアデノウイルスベクターを用い、in vivoでOCTN1に対するアンチセンス遺伝子を導入することでその遺伝子発現を抑制し、OCTN1の生理的役割を評価することを目的とした。マウスあたり2.4x10^9PFUの力価で、OCTN1アンチセンスをコードしたアデノウイルスを頸静脈投与したところ、2-3日後には肝において遺伝子導入マーカーの発現が見られた。RT-PCRにより、肝にOCTN1が存在すること、および導入したアンチセンスが発現していることを確認した。一方で14日後にはGFPの蛍光は消失していた。以上よりアンチセンス一過性導入の実験系を確立することができた。この系において単離肝切片を調製しOCTN1の典型的基質であるtetraethylammonium (TEA)の取り込みを検討したところ、顕著な取り込みが観察されたもののAdmOCTN1.ASの導入により肝臓への取り込みに顕著な変化は観察されなかった。また感染2日後のマウスに放射標識TEAを投与しその胆汁排泄を検討したところ、胆汁中のTEA回収量にも有意な変化は見られなかった。一方でセンス鎖をコードしたアデノウイルスを感染させた際には、以前に肝において基質の輸送活性が認められ、今回血液脳関門においても輸送活性の上昇を認めることができた。従って、本実験系はトランスポーターの持つ生物学的活性の評価や薬物デリバリーには有用である一方で、遺伝子ノックダウンによる生理的役割解明への応用にはさらなる検討が必要であると考えられる。<br />研究課題/領域番号:14657615, 研究期間(年度):2002 – 2003<br />出典：「アンチセンス発現アデノウイルスを用いたトランスポーターの薬物体内動態制御機能評価」研究成果報告書 課題番号14657615（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14657615/)を加工して作成
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福森, 義宏 ; Fukumori, Yoshihiro
概要:
金沢大学理工研究域<br />1.N-FeoBの大量発現と抗N-FeoB抗体の作製FeoBを精製するには、高感度なアッセイ系が必要である。そこで、本年度は、抗-FeoB抗体を作製した。具体的には,FeoBのN末端ドメイン(245アミノ酸残基
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)をコードするDNA断片をPCRで増幅、PCRエラーが無いことを確認し、pET-15b vectorにクローニングした。大量発現には大腸菌BL12株を用いた。N-FeoBは封入体として発現しており、大腸菌より封入体を調製し、変性条件下でNiアフィニティクロマトグラフィにより精製した。大量発現の結果得られたN-FeoBをトロンビンで処理しHis-tag部分を取り除き、SDS-PAGEしたゲルから切り出すことで、更に精製した。得られた精製標品を抗原としてウサギに免疫した。抗体価は二重免疫拡散法とドットブロット法により測定し、アッセイに十分な抗体価をもつ抗血清が得られた。2.磁性細菌M.magnetotacticumの大量培養と膜画分の調製M.magnetotacticumを120Lの合成培地で培養し、25gの細胞を得た。細胞をフレンチプレスで破砕し遠心分離(8,000xg)によって未破砕細胞とマグネトソームを取り除き、更に、超遠心(100,600xg)し沈澱を回収することで膜画分(細胞膜と外膜を含む)を調製した。3.FeoBの検出抗N-FeoB抗体を用いてWestern blotを行い、M.magnetotacticumの膜画分からFeoBの検出を行った。その結果、73.6kDaのメジャーなバンドと2つのマイナーバンド(81.5,61.1kDa)が確認できた。メジャーなバンドの分子量はfeoB遺伝子の塩基配列から推定される分子サイズとほぼ一致した。このことから本細菌のFeoBは膜画分に存在していることが明らかになった。4.FeoBの精製(可溶化条件の検討)FeoBの精製を行う為、膜可溶化条件を検討した。可溶化効率はWestern blotによって検出したバンドをルミノイメージアナライザーによって定量し、求めた。その結果、デオキシコール酸ナトリウムが最も効率的にFeoBを可溶化できることが分かった。現在,アフィニティ、イオン交換、ゲルろ過、ハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィによりFeoBの精製を試みている。<br />研究課題/領域番号:16048211, 研究期間(年度):2004<br />出典：「磁性細菌のGタンパク質融合型鉄輸送体: 精製と再構成」研究成果報告書 課題番号16048211（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16048211/)を加工して作成
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加藤, 将夫 ; Kato, Yukio
概要:
金沢大学理工研究域<br />腎臓や小腸は外界からの低分子異物の侵入を防ぎ、かつそれらを生体から排除する一方、生体に必要な栄養物質を吸収している。これら臓器の上皮細胞アピカル側膜上には、異物を排出し栄養物質を吸収する巧妙な分子メカニズムとし
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て薬物トランスポーター群が存在する。本研究は、異物解毒と栄養吸収という双方向のベクトル輸送を司る高次の分子機構の解明を目指し、薬物トランスポーター分子内に存在する共通の分子配列を同定するとともに、その配列を認識しトランスポーターの機能を制御するアダプタータンパク質の同定を目的とした。Yeast two hybrid法および遺伝子組換え精製タンパク質を用いたpull-down法により、solute carrier superfamilyに属する薬物トランスポーター20種類のC末端と、腎臓および小腸に発現する4つのPDZドメインを有するタンパク質との相互作用を解析した結果、アピカル膜に発現する数種類のトランスポーターとの特異的相互作用を見いだした。このうち腎アピカル膜に局在するPDZタンパク質であるPDZK1存在下で、ペプチドトランスポーターPEPT2および有機カチオン/カルニチントランスポーターOCTN2の基質輸送能の亢進が認められた。特にOCTN2による基質輸送能に及ぼす促進効果は顕著であり、基質に対する親和性の変化ではなく輸送キャパシティーの約6倍の上昇により説明できた。また細胞表面に発現するOCTN2をビオチン標識とWestern blot法により定量したところ、PDZK1はOCTN2の形質膜上での発現量には影響を与えておらず、相互作用により直接輸送を制御することが示唆された。免疫共染色によりPDZK1とOCTN2は腎尿細管刷子縁膜に共局在することが示された。以上の知見は、薬物トランスポーターがアピカル膜において個々に単独で存在するのではなく、PDZタンパクを介したクラスターを形成することにより異物の排除と栄養物の吸収を担っていることを強く示唆するものである。<br />研究課題/領域番号:16048210, 研究期間(年度):2004<br />出典：「異物排出トランスポーター群の上皮細胞アピカル膜局在を制御する分子シグナル」研究成果報告書 課題番号16048210（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16048210/)を加工して作成
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加藤, 将夫 ; Kato, Yukio
概要:
金沢大学理工研究域<br />我々は、昨年度の本特定領域研究において、腎臓や小腸の上皮細胞刷子縁膜や肝臓の血液側膜に発現する薬物トランスポーター群とPDZタンパク質群との特異的な相互作用を見出すとともに、PDZタンパク質の一つであるPDZK
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1が有機カチオントランスポーターOCTN2やペプチドトランスポーターPEPT2の機能制御因子であることを見出した。本年度は、PDZタンパク質群の薬理学的意義をさらに追究するため、ともにPDZタンパク質と結合するペプチドトランスポーターPEPT1とその輸送駆動力であるH^+勾配を形成するNa^+/H^+ exchanger (NHE)3との機能的カップリング、およびPDZK1のホモログであるPDZK2によるトランスポーター機能制御について検討した。NHE3がPEPT1と同時に存在すると、PEPT1による基質輸送能が上昇し、輸送にNa依存性が見られるとともに、より高いpH条件下でも効率的な輸送の見られることを示した。このことは、PDZタンパク質との結合により両者が近接して存在することで、PEPT1によるペプチドや基質薬物輸送がより効率的に行なわれることを示唆する。一方、PDZK2はPDZK1と同様、OCTN2の輸送機能を促進したものの、PDZK1が細胞表面でのOCTN2の発現量に影響を与えないのに対し、PDZK2はOCTN2の発現量を上昇させることが示された。このことはPDZK2がOCTN2の輸送機能よりもむしろソーティングの制御に関与することを示唆する。さらに薬理学的意義を強く示唆するため、臨床応用の進められているモデル薬物として尿酸生合成阻害薬Y-700を用い、その肝細胞における輸送メカニズムを明らかにした。以上、本研究ではPDZタンパク質群のいくつかの薬理学的意義を示唆し、薬物動態において重要なタンパク質群である可能性を明らかとすることができた。<br />研究課題/領域番号:16044217, 研究期間(年度):2004-2005<br />出典：「薬物取り込み・排出トランスポーターの細胞膜ソーティングの分子機構と薬理学的意義」研究成果報告書 課題番号16044217（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16044217/)を加工して作成
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| 12.
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論文
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加藤, 将夫 ; Kato, Yukio
概要:
金沢大学理工研究域<br />消化管上皮細胞への薬物取り込み過程は、癌化学療法における消化管毒性を決定する重要因子と考えられるものの、これまでその分子メカニズムに関する検討はごくわずかであった。本研究は、塩酸イリノテカンやメソトレキサートな
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ど有機アニオン系抗癌剤に消化管毒性が問題となっている点に着目し、種々のアニオン性モデル薬物を用いた消化管取り込み機構の実体解明を目的とした。併せて消化管に発現する有機カチオントランスポーターについてもその機能特性や輸送制御機構について検討を行った。本研究により消化管上皮細胞刷子縁膜において有機アニオントランスポーターOATP-Bが機能的に発現しており、種々の有機アニオン性基質薬物を選択的に取り込むことが明らかとなった。このことは、OATP-Bが消化管上皮細胞における薬物取り込み機構の一つとして生理的役割を果たすことを示唆し、抗癌剤をはじめとする医薬品の消化管への暴露を規定する標的分子の一つである可能性を示した。消化管に発現することが報告されている有機カチオン/カルニチントランスポーターであるOCTN1に見いだされる数種類の遺伝子多型について、その輸送機能、細胞内局在さらには発現量に及ぼす影響をHEK293細胞における一過性発現系を用い解析した。その結果、日本人において見いだされた遺伝子変異の一つが、OCTN1の細胞内局在や発現量にはほとんど影響を与えないものの、その有機カチオン輸送能を大きく低下させることが示された。OCTN1遺伝子はリュウマチやクローン病との関連性が示唆されており、今回見いだされた種々の遺伝子変異と病態との関連性について検討の必要性を示した。さらに、scaffoldタンパク質であるPDZタンパク質の一部がOCTN1の輸送機能に直接影響を与える輸送制御因子であることを、OCTN1とPDZタンパク質との同時発現系を用い示した。<br />研究課題/領域番号:16023227, 研究期間(年度):2004<br />出典：「抗癌剤の消化管毒性回避を目指した小腸上皮細胞取り込み機構の分子論的解析」研究成果報告書 課題番号16023227（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16023227/)を加工して作成
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増尾, 友佑 ; Masuo, Yusuke
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金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />肝消失型薬物の一部は、血漿中からの消失が慢性腎障害時に遅延する。そこで、OATP1B1阻害作用を有する生体内化合物を探索したところ、6-OH indoleはOATP1B1を阻害した。血漿中6-OH i
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ndole濃度は、腎障害患者において、正常腎機能患者よりも血漿中濃度が高かった。この化合物によるOATP1B1阻害作用は持続的であり、プレインキュベーション時のみに添加した際にも阻害作用を有した。さらに、本化合物は、ヒト初代培養肝細胞でestrone 3-sulfateの細胞内取り込みを阻害した。本化合物は、慢性腎障害時に血液中に蓄積してOATP1B1の機能阻害を引き起こすことが示唆された。<br />Several uremic tocxins have been proposed to inhibit hepatic uptake transporters. The purpose of this study is to find possible inhibition of OATP1B1 by newly identified uremic toxins, 6-OH indole. 6-OH indole inhibited OATP1B1-mediated uptake of [3H]estrone sulfate in HEK293/OATP1B1 cells. Plasma concentration of 6-OH indole was higher in patients with severe renal failure than that in patients without renal failure. The inhibition pattern of OATP1B1 by 6-OH indole was long-lasting, since its inhibition was maintained after 6-OH indole was washed out. Also, 6-OH indole inhibited uptake of estrone sulfate in primary cultured hepatocytes without changing mRNA expression of OATP1B1. These results suggest that increase of 6-OH indole in plasma during CKD could at least partially explain the delayed elimination of OATP1B1 substrate drugs.<br />研究課題/領域番号:16K18934, 研究期間(年度):2016-04-01 - 2018-03-31
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論文 |
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増尾, 友佑 ; Masuo, Yusuke
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />一部の肝消失型薬物は、血中消失が慢性腎障害患者で遅延し、この原因として患者血漿中で蓄積する一部の尿毒素による肝膜輸送体のdirect inhibitionが報告されているが、他の尿毒素による阻害やdi
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rect inhibition以外の作用は未解明である。本研究では、p-cresyl sulfateによる肝膜輸送体OATP1B1のdirect inhibitionとindoxyl sulfateによるOATP1B1のlong-lasting inhibitionを明らかにした。本研究で明らかになった阻害作用は、慢性腎障害時におけるOATP1B1基質薬の血中消失の遅延を一部説明しうるものである。<br />Several uremic toxins have been proposed to inhibit hepatic uptake transporters. The purpose is to clarify possible long-lasting inhibition of OATP1B1 by uremic toxins. OATP1B1-mediated uptake of [3H]estrone sulfate (E3S) was examined after co-incubation or preincubation with uremic toxins in HEK293/OATP1B1 cells and primary cultured human hepatocytes. Among 21 uremic toxins, indoxyl sulfate (IS), CMPF and p-cresyl sulfate directly inhibited OATP1B1 mediated-uptake of E3S, but only IS exhibited inhibitory effect even after preincubation. Such inhibition of E3S uptake by preincubation with IS was more remarkable than that by its co-incubation, and observed in preincubation time- and concentration-dependent manners. Preincubation with IS also decreased uptake of E3S in human hepatocytes in primary culture. Overall, the long-lasting inhibition in the presence of IS could at least partially explain the delayed elimination of OATP1B1 substrate drugs during severe renal failure.<br />研究課題/領域番号:26860099, 研究期間(年度):2014-04-01 - 2016-03-31
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加藤, 将夫 ; Kato, Yukio
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />Breast cancer resistance protein (BCRP)とp-glycoprotein (P-gp)は多様な物質を細胞外へ排出する膜輸送体である。本研究では経皮投与医薬品に含まれ
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る添加剤でこれら膜輸送体を制御することを目的とした。BCRPの機能を阻害する添加剤を複数見出した。BCRPに対する阻害定数は、添加剤のオクタノール／水分配の計算値（xlogP）と相関した。見出された添加剤はBCRPによる基質の経細胞輸送や、除毛マウス皮膚に投与したrhodamine 123の真皮および血漿中への移行量を低下させた。以上より、皮膚ABC膜輸送体の添加剤による制御の可能性が示唆された。<br />Breast cancer resistance protein (BCRP) and P-glycoprotein (P-gp) are ATP binding cassette (ABC) transporters which are expressed in various organs including skin and pump out various xenobiotics compounds from the cells. The present study was designed to find excipients used in transdermal pharmaceutics which exert potential inhibition of these dermal ABC transporters with an aim to possible control of drug disposition inside the skin. We searched various excipients and found several compounds which inhibit BCRP function. Their inhibition constant for BCRP was correlated with calculated value of octanol/water partition coefficient (xlogP). One of such excipients inhibited BCRP-mediated transcellular transport of its substrate and reduced distribution of rhodamine 123 into dermis and circulating blood after transdermal administration. The present finding thus suggests possible strategy for control of dermal ABC transporter using pharmaceutical excipients.<br />研究課題/領域番号:25670011, 研究期間(年度):2013-04-01 – 2015-03-31
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崔, 吉道 ; Sai, Yoshimichi
概要:
金沢大学附属病院<br />ラット及びヒト肝細胞を用いたゲムシタビンの取り込み実験やラットの肝潅流実験、ヒト試験により、800 mg/SLV以下の投与量では、クレオシドトランスポーターENT2を介した低親和性の肝取り込みの飽和が回避でき、膵
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癌肝転移に対する術後肝動注化学療法が早期に開始できる可能性が示された。また、腎機能低下患者における抗MRSA薬リネゾリドの体内動態と血小板減少に関しては、リネゾリドおよび代謝物の血中濃度がともに腎機能障害が高度になるほど上昇し、血小板減少率も上昇する傾向が確認できた。さらに、経腸栄養剤長期投与によって小腸や肝臓のトランスポーターや代謝酵素の発現が変動することが示された。<br />We investigated hepatic uptake of gemcitabine (GEM) in rat and human. The uptake mechanism involved high- and low-affinity saturable components with Km values of micromolar and millimolar order, respectively. Our results suggested that the hepatic extraction of GEM is predominantly mediated by the low-affinity nucleoside transporter ENT2 at clinically relevant hepatic concentrations of GEM, the uptake would not be completely saturated. This is critical for hepatic arterial infusion (HAI), because saturation of hepatic uptake would result in a marked increase of GEM concentration, abrogating the advantage of HAI over i.v. administration in terms of severe adverse events. We investigated pharmacokinetics of linezorid (LZD) in rat and human. The incidence of thrombopenia was increased according to the increase of plasma concentration of LZD. We also found that long-term enteral nutrition affected that the expression of transporters and metabolic enzymes in the liver and small intestine.<br />研究課題/領域番号:23590173, 研究期間(年度):2011-04-28 – 2015-03-31
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論文
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遠藤, 良夫 ; Endo, Yoshio
概要:
金沢大学がん進展制御研究所<br />光線力学的治療（PDT）は低侵襲性のがん治療法の一つである。５-アミノレブリン酸（5-ALA）は腫瘍細胞内で光感受性物質であるプロトポルフィリンIX (PpIX) に代謝、活性化される新世代の光増感物質
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として注目されている。本研究では、5-ALAおよびPpIXの細胞膜輸送系に作用するPDT効果増強剤の開発を目指し、ヒトがん細胞を用いた感受性試験法により低分子化合物ライブラリーのスクリーニングを実施した。その結果、5-ALAと同時処理することにより細胞内PpIXが増加し、PDT効果を相乗的に増強する化合物、TX-816を見出した。今後、TX-816をリード化合物とする誘導体展開が期待される。<br />Protoporphyrin IX (PpIX)-dependent photodynamic diagnosis (PDD) and therapy (PDT) using 5-aminolevulinic acid (ALA-PDD and ALA-PDT) are widely recognized novel therapeutic strategies for the treatment of various cancers.Previously, we demonstrated that the balance between the influx of ALA through the transporter PEPT1 and the efflux of intracellular PpIX through the ABC transporter ABCG2 determines the sensitivity of cancer cells to ALA-PDT. Recently, we found that the Schiff base derivative TX-816 could significantly increase the effect of ALA-PDT. The ability of TX-816 to enhance the efficacy of ALA-PDT was markedly stronger than that of dipyridamole, which inhibits ABCG2 and equilibrative nucleoside transporters. Furthermore, TX-816 could recover the sensitivity to ALA-PDT in cancer cells with acquired resistance. These results indicate TX-816 is a potent lead compound to develop an ALA-PDT sensitizer.<br />研究課題/領域番号:23501305, 研究期間(年度):2011–2013
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加藤, 将夫 ; Kato, Yukio
概要:
トランスポーターは栄養物等を細胞内に取り込み、異物等を排出する膜タンパク質である。Oligopeptide transporter (PEPT) はジ・トリペプチドを細胞内に取り込み、腫瘍に高発現することが知られるトランスポーターである。我
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々は以前にPEPTを標的としたin vivo 腫瘍イメージングと腫瘍増殖抑制ペプチドの合成に成功した。本研究では、PEPT、PEPT と裏打ちタンパク質との相互作用、裏打ちタンパク質と他のトランスポーターとの相互作用の計3つを標的とする抗腫瘍薬の開発を目指し、その基盤となる知見を得た。<br />Transporters play pivotal roles in both uptake of nutrients and efflux of metabolites/xenobiotics in the body. Oligopeptide transporters (PEPT) function as an uptake mechanism for both dipeptides and tripeptides. PEPTs are known to be highly expressed in a certain types of cancer cells probably to maintain its extremely rapid growth by uptake of nutrients. We have previously succeeded in synthesis of both tumor-imaging substrate and anti-tumor peptides targeted to PEPTs. In the present study we aimed to establish antitumor drugs with triple targets of PEPTs and its associated proteins.<br />研究課題/領域番号:23659019, 研究期間(年度):2011-2012
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増田, 和実 ; Masuda, Kazumi
概要:
金沢大学人間社会研究域人間科学系<br />骨格筋のカルニチンは調査脂肪酸をミトコンドリアマトリックス内へ輸送する際、あるいはまた、それに引き続くβ酸化には必須の基質である。したがって、骨格筋におけるカルニチンの利用量を増加させることが生体
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(骨格筋)の脂質代謝の利便性につながるという発想は、これまで報告されたカルニチンサプリメント研究の原点となってきた。しかしながら、カルニチンサプリメントの脂質代謝への効果についてはコンセンサスのあるエビデンスはない。こうした問題の背景には、骨格筋へのカルニチン輸送機序に関する基礎研究の蓄積不足が挙げられる。本研究はこの潜在的な問題を解決するべく、骨格筋の細胞膜を隔てた基質輸送機序について検証することを目的とした。骨格筋はその細胞内で内因性にカルニチンを合成できないため、それを血液から細胞内へ取り込まなければならない。筋細胞に内在するOCTN2に注目し、筋収縮に伴ってOCTN2の分布やそれを介したカルニチン取り込み能力がどう変化するか、さらにOCTN2の発現に関与するシグナル調節機構について検証したところ、筋収縮によってOCTN2のカルニチン取り込み能力が亢進し、その背景にはOCTN2の細胞膜へのトランスロケーション機構が働いていることが明らかとなった。<br />In skeletal muscle, carnitine is essential for the translocation of long-chain fatty-acids into the mitochondrial matrix for subsequent β-oxidation Based on the concept that increased carnitine availability is beneficial to skeletal muscle metabolic process, a large amount of research was directed towards investigating the effects of carnitine supplementation on exercise performance. However, it has been debated about contribution of carnitine for energy metabolism in skeletal muscle and whether carnitine supplementation can improve physical performance in healthy subjects. In order to resolve the key issues, the present study focused on the carnitine transport mechanism across the skeletal muscle plasma membrane. Due to lack of endogenous synthesis of carnitine in myocytes, skeletal muscles need to import this molecule from blood, suggesting that muscle carnitine uptake is most likely the limiting factor to muscle carnitine availability. The specific carnitine transporter, OCTN2, is expressed in skeletal muscles and is assumed to transport carnitine into myocytes. The present study obtained several scientific evidences that carnitine uptake capacity via the OCTN2 is up-regulated during muscle contraction through the mechanisms of OCTN2 translocation from cytosol toward plasma membrane.<br />研究課題/領域番号:23650404, 研究期間(年度):2011–2012
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加藤, 将夫
概要:
トランスポーターは、薬物分子の生体膜透過に重要な役割を果たす膜タンパク質である。これまで、トランスポーターと薬効や副作用との関係を直接証明した例は乏しい。本研究は、研究代表者が明らかにしたアダプター分子とトランスポーターとの複合体形成に着日
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し、トランスポーターによる薬物動態、薬効、毒性に及ぼす役割の解明を日的とした。主な研究成果として、トランスポーターOCTNの小腸、肝臓、腎臓、心臓における役割、小腸トランスポーターの薬物吸収に及ぼす役割、アダプターPDZK1による3つの小腸取り込みトランスポーターの制御を解明した。<br />Transporters are the membrane proteins involved in permeation of drug molecules across plasma membranes. Although they are assumed to play fundamental roles in drug absorption and disposition, little information is available on their direct association with drug efficacy and toxicity. Therefore, the aim of the present study was to clarify pharmacokinetic, pharmacodynamic and toxicodynamic roles of transporters by focusing on their adaptor proteins which have already been clarified by our previous studies. As the final results of this grant, we have clarified (i) the roles of carnitine/organic cation transporters (OCTNs) in drug disposition and efficacy in small intestine, liver, kidney and heart, (ii) the roles of influx and efflux transporters in gastrointestinal drug absorption, and (iii) direct interaction and regulation of three intestinal influx transporters by an adaptor protein PDZK1.<br />研究課題/領域番号:20390047, 研究期間(年度):2008–2010
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崔, 吉道
概要:
胎盤関門の物質輸送を担うトランスポータータンパク質複合体の制御因子としてエズリンの役割を解明することを目的とした。胎盤関門細胞株TR-TBTsや妊娠ラット、エズリン遺伝子欠損マウスを用いて研究を行ったところ、エズリンは合胞体性栄養膜細胞の母
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体血側細胞膜の裏打ちタンパク質として妊娠経過に伴う胎盤の成熟と共に時期特異的に発現し、ヒポタウリン輸送系(Slc6a13)やその他の輸送系を細胞膜へ局在化させる機能を担うとともに機能調節因子として働くことが示唆された。<br />This study was aimed to clarify the regulatory role of ezrin on transporter complex (transportsome) at the placenta barrier. Our study using syncytiotrophoblast cell line TR-TBTs, pregnant rats as well as knockout mice lacking ezrin, scaffold protein that links membrane proteins to the cortical actin, have suggested that ezrin is located at the apical membrane of syncytiotrophoblasts during the course of pregnancy and works as a functional regulator in the transportsome containing a hypotaurin transporter Slc6a13.<br />研究課題/領域番号:20590158, 研究期間(年度):2008– 2010
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加藤, 将夫 ; Kato, Masao
概要:
細胞膜裏打ちタンパク質PDZKは、これまでの加藤らの検討から、多くの薬物トランスポーターと相互作用することがin vitroで示されているが、その薬物動態制御因子としての役割は全く不明であった。本研究では、2年間に渡る研究成果を基に次の結論
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を得るに至った。 1.PDZK1は薬物を輸送するトランスポーターであるPEPT1、PEPT2(いずれもペプチドトランスポーター)、OCTN1、OCTN2(いずれも有機カチオン/カルニチントランスポーター)の薬物輸送能に影響を与える制御因子であること。一方で、PDZK2は少なくともOCTN2の制御因子であること。 2.PDZK1はPET1、OCTN2、有機アニオントランスポーターOATP1Aと、小陽吸収上皮細胞または腎近位尿細管刷子縁膜表面において共局在する一方、PDZK2は近位尿細管刷子縁膜直下でOCTN2と共局在すること。 3.PDZK1が小腸の細胞膜表面におけるPEPT1、OCTN2、OATP1Aの局在に必須の因子であり、PDZK1の欠損によってこれらトランスポーターの機能および局在不全が起こること。 4.低分子量GTP結合タンパク質Rab8が、PEPT1およびグルコーストランスポーターSGLT1の小腸細胞膜表面での局在に必須であり、その遺伝子欠損は栄養吸収不全を引き起こすこと。 以上の知見は薬物を輸送するトランスポーターやひいてはトランスポーターによる薬物動態の制御因子としてのアダプター分子(PDZK1、Rab8)の役割をin vivoおよびin vitroで実証した初めての例であり、複数のトランスポーターが複数のアダプターを介したネットワークとして機能することを示し、今後の医薬品開発や臨床における適正使用において薬物動態を考える上での重要な知見である。<br />Many types of xenobiotic transporters have been identified. They generally exhibit multispecific recognition of various types of substrates, and mediate membrane permeation of therapeutic agents, thereby playing important roles in drug absorption and disposition. We have recently proposed that protein-protein interactions involving the xenobiotic transporters may affect their function, localization and expression on plasma membranes based on in vitro experimental data. So-called adaptor proteins that directly interact with the transporters include PDZ (PSD95, Dig and ZOO domain-containing proteins. This project was performed with an aim to clarify pharmacokinetic roles of such adaptor proteins in vivo. Using pdzk1 gene knockout (pdzk1^+) mice, it was found that interaction with a PDZ adaptor PDZK1 is essential for the cell-surface localization of three solute carriers, Slc15a1 (oligopeptide transporter PEPTD, S1c22a5 (carnitine/organic cation transporter OCTN2) and Slco 1a (organic ani on transporting polypeptide, OATP1A) in mouse small intestine. Electron microscopy revealed localization of PEPT1 in intracellular vesicular structures in pdzk1^+ mice. In pdzk1^+ mice, gastrointestinal absorption of cephalexin, a substrate of PEPT1 and carnitine, a substrate of OCTN2 was delayed, compared with wild mice. In addition, uptake of estrone sulfate, a substrate of OATP1A from apical membrane of small intestine was also decreased in pdzk1^+ mice. Thus, PDZK1 plays pivotal roles as a regulator of transporters, thereby affecting the absorption of substrates of those interacting transporters. Since PDZ adaptors have multiple PDZ domains in their structure, and each PDZ domain can interact with the cytosolic region of the transporters, it can be speculated that transporters are localized within networks consisting of several transporters and adaptors. We have also found that apical localization of PEPT1 and Slc5a1 (sodium/glucose cotransporter, SGLT1) was almost completely reduced in gene knockout mice for small GTP-binding protein rab8 (rab8^+). Gastrointestinal uptake across the apical membranes of glycylsarcosine, a substrate of PEPT1 and α-methylglucose, a substrate of SGLT1 was concomitantly reduced in rab8^+. Thus, our results demonstrate that rab8 is necessary for the proper localization of the two transporters and digestion of various nutrients which are the substrate of those transporters.<br />研究課題/領域番号:18590137, 研究期間(年度):2006–2007<br />出典：「薬物動態制御因子としてのトランスポーターアダプターの役割」研究成果報告書 課題番号18590137 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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加藤, 将夫 ; Kato, Masao
概要:
本研究はトランスポーターによる薬物の生体膜透過に焦点を当て、排泄過程における薬物間相互作用を試験管レベルから定量的に予測するための分子的基盤の構築を目的とした。モデル薬物として、肝排泄型である新規尿酸生合成阻害薬Y-700のヒトおよびラット
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肝細胞への取り込み機構を解析したところ、Y-700が既知のトランスポーターfamilyであるOATPとは異なる有機アニオン輸送機構によってNa依存的に取り込まれること、その分子機構の一つは胆汁酸トランスポーターNTCPであることを明らかとした。また腎排泄型のモデル薬物として新規ループ利尿薬M17055の腎皮質切片への取込み機構を解析したところ、有機アニオントランスポーターOAT1が少なくとも一部、関与することが示唆された。さらに、腎刷子縁膜トランスポーターであるPEPT2、OCTN1、OCTN2とPDZドメインを有する細胞内タンパク質(PDZK1およびPDZK2)との特異的な相互作用を見出し、PDZK1およびPDZK2が、これらトランスポーターの輸送機能や細胞内局在の制御機構として働くことを見出した。また、細胞内外のH^+勾配を利用してβラクタム系抗生物質等を輸送するペプチドトランスポーターPEPT1と、細胞内外のNa^+勾配を利用してH^+濃度勾配を供給するNa^+/H^+ exchanger(NHE)3に着目し、NHE3共存下においてPEPT1の輸送活性ならびに輸送のpHおよびNa依存性が変化することを明らかとした。以上本研究により、トランスポーター分子群のみならず、トランスポーターと直接結合しうるPDZK1等のアダプタータンパク質、さらにはアダプター分子を介してトランスポーターと相互作用しうるNHE3等の膜タンパク質など、これまで相互作用への関与が知られていなかった多くのタンパク質の、分子基盤としての重要性を提示することができた。<br />Recent progress in molecular biology has revealed predominant roles of many types of xenobiotic transporters in drug secretion into the urine and bile, leading to possible occurrence of drug-drug interaction at the excretion processes. Therefore, it is expected to predict the interaction based on in vitro experimental system. This study aimed to clarify molecular basis for the prediction of drug-drug interaction at the excretion process in liver and kidney. As model drugs that are excreted into the bile and urine, a novel uric acid generation inhibitor Y-700 and a novel diuretic M17055 were used. We have suggested involvement of Na^+-dependent organic anion transport system, other than OATP family, in hepatic uptake of Y-700, part of Y-700 uptake being mediated by bile acid transporter NTCP. We have also clarified important role of OAT1 in renal uptake of M17055. Furthermore, we have identified direct interaction of certain types of transporters, that are expressed on apical membranes in kidney and/or small intestine, with PDZ domain containing proteins PDZK family, implying that such protein-protein interaction may play a role in apical localization of the transporters. Among the PDZ proteins, PDZK1 is colocalized on apical membranes in kidney and small intestine with OCTN2, and can stimulate transport activity of several transporters including OCTN1, OCTN2 and PEPT2. Finally, we have focused on functional modulation of oligopeptide transporter PEPT1 by Na^+/H^+ exchanger (NHE) 3 that can also bind to the PDZ proteins and supply H^+ gradient that can be utilized by PEPT1 for transport activity. NHE3 affects transport activity, Na^+- and H^+- dependence of PEPT1. Thus, this study has proposed a novel concept that adaptor proteins (such as PDZK1) and other membrane proteins (such as NHE3), both having interaction potential with transporters, could be important molecular basis for prediction of drug-drug interaction at excretion processes.<br />研究課題/領域番号:16590108, 研究期間(年度):2004–2005<br />出典：「肝腎トランスポーターを介した薬物間相互作用の分子基盤」研究成果報告書 課題番号16590108 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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中西, 猛夫 ; Nakanishi, Takeo
概要:
炎症反応に重要なプロスタグランジンE2(PGE2)を認識する膜輸送体OATP2A1が間質性肺炎(肺線維症)に果たす役割を評価した。肺胞上皮細胞に強く発現するOATP2A1により肺胞腔中のPGE2が肺胞上皮を通過し組織への輸送されることが示さ
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れた。Oatp2a1機能を喪失した間質性肺炎マウスモデルでは肺胞腔中にPGE2がうっ滞し、肺組織の炎症が増悪したことから、OATP2A1機能が肺恒常性維持に重要であることが実証された。さらに、OATP2A1の機能に影響を及ぼす医薬品が同定され、低分子化合物を用いた本輸送体機能調節が可能であることが判明した。本成果は総説を含む13報の論文に報告された。<br />Expression of functional prostaglandin transporter (OATP2A1/SLCO2A1) responsible for local distribution of an inflammatory mediator, prostaglandin E2 (PGE2), was investigated in the lungs using animal and cellular models for pulmonary fibrosis. Oatp2a1 was found to be expressed at the apical membranes of type 1 alveolar epithelial cells (AT1) in the mouse lungs, and to mediate transcellular transport of PGE2 from alveolar lumen to interstitial tissues. In a bleomycin-induced pulmonary fibrosis model, PGE2 was accumulated in the alveolar cavity and interstitial pneumonia was aggravated in Slco2a1-/- mice, indicating an essential role of OATP2A1 in the lung homeostasis. Furthermore, several small compounds were fund to alter OATP2A1 function based on in vitro screening. These findings are useful to develop a therapeutic strategy to prevent the lungs from severe inflammation and fibrosis.<br />研究課題/領域番号:15H04755, 研究期間(年度):2015-04-01 - 2019-03-31
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論文
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加藤, 将夫 ; Kato, Yukie
概要:
膜輸送体は細胞膜に局在し、薬物の細胞内への取り込みや細胞内からの排出に働く。本研究は、小腸、肝臓、腎臓、血液脳関門等に発現し、多くの薬物を細胞内から細胞外へ排出する膜輸送体であるbreast cancer resistance protei
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n(BCRP)とP-glycoprotein(P-gp)に着目し、生体内に存在し、これらの基質となり、これら膜輸送体の阻害薬投与により血中濃度が変化する化合物（バイオマーカー）の特定を試みた。網羅的メタボロミクス解析によりイソフラボンの硫酸抱合体がBCRPの生体内基質に、食物由来のステロイド様化合物がP-gpの生体内基質であることが示唆された。<br />Membrane transporters are localized on plasma membranes of various cells and involved in the uptake and efflux of substrate drugs. This study focused on two drug efflux transporters, breast cancer resistance protein (BCRP) and P-glycoprotein (P-gp), both of which are expressed in the intestine, liver, kidney, and blood-brain barrier. Many drugs are pumped out by these transporters, and therefore, administration of their inhibitor drugs may lead to change in pharmacokinetics, efficacy, and/or toxicity of their substrate drugs. We have attempted to identify compounds which exist in the body, are transported by these transporters, and whose blood concentration is changed by administration of inhibitor drugs. Comprehensive metabolomics analysis has clarified that sulfate conjugates of isoflavones and food-derived steroid-like compounds are the in vivo substrates of BCRP and P-gp, respectively. We proposed the first evidence of a surrogate marker of BCRP inhibition.<br />研究課題/領域番号:18H02584, 研究期間(年度):2018-04-01 - 2021-03-31<br />出典：「構造選択的メタボロームと生合成・消失臓器解析によるABC膜輸送体生体内基質の探索」研究成果報告書 課題番号18H02584（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/report/KAKENHI-PROJECT-18H02584/18H02584seika/）を加工して作成
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論文 |
論文
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玉井, 郁巳 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />消化管において栄養物・医薬品の吸収調節に働くトランスポーターに対する食品作用ならびに食品成分の吸収機構に関する検討を行った。本研究では新たに食品ナノ粒子に着目し、ナノ粒子中に含有される高分子が作用する
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という新しいメカニズムの存在の実証を試みた。その結果、リンゴ等において100nm程度の粒形を有する粒子の存在を確認できた。Caco-2 細胞において本粒子画分は、輸送体分子のmRNAとタンパク質発現量、および活性を低下させた。また、その作用として輸送体遺伝子に対する食品由来マイクロRNAの作用であることを見出した。したがって、食品中の高分子も直接生体に作用する新しいメカニズムを示すことができた<br />Novel mechanism of food effect on human intestinal function was studied by focusing on microRNA included in food abundantly. By in vitro experiments, apple derived-nanoparticle (APNP) decreased mRNA and protein expression of intestinal transporters. 3’-UTR of transporter gene interacted with APNP. Furthermore, APNP included variable apple-derived microRNA, involvement of microRNA in this down regulation was suggested. Data-base analysis demonstrated that apple microRNA interact with the specific transporter gene. The suggested microRNA downregulated expression of the transporter gene and protein. Accordingly, since microRNA is a large molecule, it was clearly shown that food-derived large molecules such as microRNA directly affect intestinal function through nanoparticle of food, The conclusion also provides new concept of nutrients that food-derived large molecules are directly functional to affect human health.<br />研究課題/領域番号:16H05111, 研究期間(年度):2016-04-01 - 2020-03-31<br />出典：「輸送体上での食品との相互作用が及ぼす医薬品の動態・作用変動に関する研究」研究成果報告書 課題番号16H05111（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16H05111/）を加工して作成
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| 27.
論文 |
論文
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白坂, 善之 ; Shirasaka, Yoshiyuki
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系 / 東京薬科大学<br />小腸絨毛上皮モデルの構築を目的として、Transwellシステムに流路を作製し、Caco-2細胞の灌流培養を試みた。タイトジャンクション指標となるTEERは、通常の培養条件下に比べ顕
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著に高い値を示し、灌流培養法による細胞形態変化が示唆された。一方、MUCおよびCYP3A4のmRNA発現に低下傾向が示されたことから、より妥当な細胞モデルの獲得が必要と考えられた。そこでCYP3A4安定発現系の作成を試みた結果、顕著なCYP3A4発現/活性が確認された。本細胞の灌流培養による機能形態変化が期待されることから、今後、小腸絨毛上皮モデルの構築と活用を目指した発展的な研究が期待される。<br />To develop intestinal villus model, a flow channel was built in the Transwell system, and Caco-2 cells was cultured under steady flow conditions. As a result, this culture method markedly increased TEER, which shows well-formed tight junctions compared to general culture conditions, suggesting an alteration of cellular morphology. On the other hand, mRNA expressions of MUC and CYP3A4 was decreased, and it was considered necessary to obtain alternative cell models. Therefore, next, we tried to establish a CYP3A4 stable expression system. Consequently, remarkable CYP3A4 expression and activity were confirmed in the cells. Change in this cellular morphology is expected by means of cell culture method with steady flow conditions. Furthermore, it is expected that this methodology contributes to improve the prediction efficiency of in vivo intestinal drug absorption.<br />研究課題/領域番号:16K15165, 研究期間(年度):2016-04-01 – 2019-03-31
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| 28.
論文 |
論文
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白坂, 善之 ; Shirasaka, Yosyiyuki
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />ラットを用いた検討により、薬物の消化管吸収にP-gpおよびOATPが関与している可能性が示され、それらの影響に消化管部位差が存在することが示唆された。また、OATP2B1上には特徴の異なる複数の基質結
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合部位が存在することが示唆された。一方、CYP3A代謝評価ではCYP3A4のみならずCYP3A5を考慮することの重要性が、CYP2C19を介した薬物間相互作用評価では代謝物の影響を考慮することの重要性が示された。本研究成果によって、より高精度な薬物吸収性評価法を提唱するために、トランスポーター活性、代謝酵素活性ならびにそれらの消化管部位差や結合サイトなどの情報を組み込むことの重要性が示された。<br />In the present study, we aimed to clarify the site-specific contribution of transporters and metabolic enzymes to the intestinal drug absorption. The rat in situ studies with talinolol and colchicine demonstrated site-specific drug absorption presumably due to differential expression and function of OATP and P-gp. Further analysis revealed presence of multiple binding sites on OATP2B1 with different affinity for drugs. Meanwhile, microsomal studies demonstrated that CYP3A5 genotype and expression level have a significant impact on inhibitory potency for CYP3A-catalyzed drug metabolism, but that the magnitude of its effect is inhibitor-substrate pair specific. The results of the study focusing on CYP2C19 show that, although metabolites contribute to in vivo DDIs, their relative abundance in circulation does not predict their contribution to in vivo DDI risk. These findings revealed involvement of influx/efflux transporters and metabolic enzymes in the intestinal drug absorption process.<br />研究課題/領域番号:23590175, 研究期間(年度):2011 – 2013
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| 29.
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論文
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白坂, 善之 ; Shirasaka, Yoshiyuki
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />薬物の消化管吸収・排泄に働くinfluxおよびeffluxトランスポーターの薬物への作用を定量的に解析したところ、talinolol、pravastatinおよびpitavastatinなど様々な薬物
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の消化管吸収にOatpが関与している可能性が示され、さらにOatpによるそれらの輸送がP-gpにより相殺される可能性が示された。本研究成果によって、より精度の高い薬物吸収性評価法を提唱するにあたり、これら両タイプのトランスポーター活性に対する優位性・相殺性を組み込むことの重要性が示された。<br />In the present study, we aimed to clarify the contribution of OATP/Oatp and P-gp to the intestinal absorption of various drugs by means of various in vitro, in situ and in vivo experimental techniques. Trough the studies with various drugs including talinolol and pravastatin, pitavastatin, finally, this study revealed that OATP/Oatp is involved in intestinal drug absorption and the contribution of OATP/Oatp-mediated uptake was apparently attenuated by P-gp-mediated efflux in intestinal drug absorption process.<br />研究課題/領域番号:21790147, 研究期間(年度):2009 – 2010
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論文
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
生体は、要・不要なものの識別輸送によって栄養物質を効率的に取込む一方、異物に対しては防御機能を備えており、この過程にトランスポーターと代謝酵素が協調的に関わることが明らかにされつつある。しかし、生体は生体異物に対し、巧妙・多様な応答を示し、
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その複雑なメカニズムを理解するための新しいドグマの確立が要求されている。本研究では、分子認識および実体異物排除を担う分子をそれぞれ、パスポートタンパク質およびゲートウェイタンパク質と位置づけて、研究を実施した。その成果として、(1)オリゴペプチドトランスポーター・PEPT1がβ-ラクタム系抗生物質であるcephalexinに対して代謝機能を発揮することを示唆した。このことは、薬物トランスポーターが輸送機能に加え、代謝機能を協奏的に発揮し、ゲートウエイタンパク質として効率的な異物排除に寄与する可能性が示された。(2)有機カチオン/カルニチントランスポーター・OCTN2がカルニチンの消化管取り込みの分子的実体であることを明らかとし、また、H1アンタゴニストの臓器分布に寄与することが明らかとした。本研究によってインフラックストランスポーターがパスポートタンパク質として機能し、生理的・薬物動態学的に重要であることが示された。(3)薬物投与部位として有用な皮膚に注目し、解析を実施した。NSAIDsであるflurbiprofenに担体介在性取り込み機構が存在することを見出した。薬物皮膚透過における薬物トランスポーターの寄与が示されたことから、新規経皮投与薬の開発が期待される。(4)OCTNsなどのトランスポーターが膜裏打ちタンパク質による制御を受けていることを示唆した。また、新規薬物スクリーニング系を考案し、その基盤技術を構築した。本研究で得られた成果は、個体における役割解明、構造解析による分子機序解明、また、創薬への実用化などの多数の発展形態が期待される。<br />rug transporters are thought to be an important factor in drug absorption, distribution, excretion and delivery. Therefore, in this project, we studied drug transporters that act as the 'Passport' and 'Gateway' proteins in human body, and aimed to elucidate the mechanisms of substrate recognition and construct a system for high-through-put screening in drug developments.As the harvests of this project, the hydrolysis function of intestinal oligopeptide transporter, PEPT1, was suggested. The hypothesis that transporters could act as metabolic enzymes is novel one in this field, and verifying with proteoliposomes will provide beneficial findings to develop the orally effective peptide-like drugs. Additionally, Octn2 was shown to be involved in the intestinal absorption of carnitine. This finding suggested that influx transporters, such as PEPT1 and PCTN2, also have important roles in the intestinal absorption of drugs, and that further intensive in vivo researches will be lead to the improvement of bioavailability in oral administrations. Furthermore, study on protein-protein interaction provided the information about regulation mechanisms for drug transporter. PDZ-K1, a membrane scaffold protein was clarified, to regulate or modify the expression, stability and activity of drug transporters. Therefore, it was suggested that transporters are physiologically governed via interactions with membrane scaffold proteins. Information obtained from this project lead to build up high-through-put screening. Xenopus laevis oocytes system expressed with transporters and membrane scaffold protein.<br />研究課題/領域番号:16390039, 研究期間(年度):2004-2006<br />出典：「パスポートタンパク質・ゲートウェイタンパク質の機能を利用した薬物動態制御」研究成果報告書 課題番号16390039 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
ペプチドトランスポーターを利用した選択的な抗がん剤デリバリーの可能性を検証する目的で以下の検討を行った。1.ヒト小腸オリゴペプチドトランスポーターhPEPT1 cDNAをHeLa細胞に遺伝子導入し強制発現細胞(HeLa-hPEPT1)を得、
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その輸送活性を確認した。2.HeLa-hPepT1を背部皮下に移植した担がんマウス(Balb/c nu/nu)に、ベスタチンおよび[3H]カルノシンを投与し組織移行性を検討した結果、細胞間液のみ分布する[14C]イヌリンの値と比べ有意に高く、両ペプチドが腫瘍細胞内に蓄積することが示された。3.in vitroでのベスタチンに対する感受性の変化をMTT法により検討したところ、HeLa-hPEPT1細胞については2.2μg./ml似上の濃度において顕著な増殖抑制効果がみられた。in vivo実験として担がんマウスにベスタチン(0.5mg/kg)を28日間経口投与した結果、HeLa-hPEPT1を移植した腫瘍の増殖はmock細胞の腫瘍に比べて顕著に抑制された。4.ヒト由来の各種株化腫瘍細胞25株について、ペプチドトランスポーター遺伝子の発現量をリアルタイム定量PCR解析した結果、PEPT1の発現量はML-1細胞、NakajimaおよびCaco-2に顕著な発現が見られた。PEPT2は殆どの細胞に発現が見られた。各細胞のペプチド取り込み活性と比較した結果、トラスポーター発現量と輸送活性とが必ずしも一致しないことから、新規のペプチドトランスポーターの存在が示唆された。5.がん細胞に発現するOCTN、OATP等のトランスポーターのクローニングならびに機能特性解析、体内動態制御への利用法についての検討も行った。6.腫瘍細胞の増殖に関与するアミノ酸トランスポーターLAT1およびLAT2が、血液脳関門を形成する脳毛細血管内皮細胞にも発現すること明らかにした。<br />In the present study, we studied feasibility of drug delivery using oligopeptide transporter which expressed in some tumor cell lines. During this study period, we obtained following findings.1. A stable cell line which over expresses human oligopeptide transporter PEPT1 was established by transfecting hPEPTl cDNA into HeLa cells. Its transport actiyity was confirmed by measuring glycylsarcosine and termed the cell line HeLa-hPEPT1.2. Nude mice (Balb/c nu/nu mice) inoculated with HeLa-hPEPT1 bared tumor within several weeks. In these mice, I.v. injected an anti-tumor drug bestatine, and dipeptide carnosine were accumulated in the hPEPT1-expressing tumors.3. HeLa-hPEPT1 was more sensitive to bestatine than parent HeLa cell line by in vitro MTT assay. Tiimor growth of HeLa-hPEPT1 in nude mice was strongly suppressed by oral dose of bestatine to the mice, while that of HeLa inoculated mice was not affected.4. Messenger RNA expression levels of known oligopeptide transporters that is PEPT1 and PEPT2 were quantitatively analyzed by the real time PCR in iridivisual 25 tumbf lines. Among them ML-1, Nakajima and Caco-2 cells expressed PEPT1in high level on the other hand, PEPT2 expression was observed majority of cell lines examined. Comparing mRNA expression and transport activity profiles, we found little correlation between them. Therefore, existence ofnovel transporter that represents the uptake of peptides has been suggested.5. Molecular cloning of CDNA of organic cation transporter OCTNs and OATPs were performed and some of which were expressed in tumor cell lines.6. We have proved that expression of amino acid transporter LAT1 and LAT2, which play roles in tumor growth, in the blood-brain barrier.In conclusion, detailed characterization of many kinds of transporters which expressed in tumors will provide us valuable information to establish method for tumor specific delivery of drugs.<br />研究課題/領域番号:12557204, 研究期間(年度):2000-2001<br />出典：「ペプチド輸送系の組織特異的発現と分子認識多様性を利用した腫瘍選択的薬物デリバリー」研究成果報告書 課題番号12557204 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
本研究は、薬物の体内動態に影響を与えるトランスポーター群の多様な薬物構造認識・輸送機構を小腸、腎臓、肝臓、脳などの特定臓器に焦点を当て、臓器レベル、細胞レベル、オルガネラレベル、分子レベル、遺伝子レベルで解明し、薬物動態の臓器普遍性または臓
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器特異性を明確にすることを目的として、1)PEPT1、OCTN1、OCTN2、NPT1等について、各トランスポーター発現細胞における詳細なin vitroでの分子構造認識・輸送特性を明らかにした。2)有機アニオン系、有機カチオン系、ペプチド系等の薬物に対して生体に備わった物質輸送、蓄積、排泄機構の組織、細胞および細胞膜レベルでの検討を行った。3)それらのin vivo、in vitro実験の情報を元にした新規トランスポーター群(mOCTN1,mOCTN2,mOCTN3,OATP-B、OATP-C、OATP-D、OATP-E)のクローニングに成功した。4)クローニングしたトランスポーターに対する抗体の作成とそれを用いた組織内および極性細胞における細胞内局在性を明らかにするとともに、発現細胞を作成してその輸送特性を明らかにし、生体の種々生体物質および薬物輸送における役割について検討した。5)血液脳関門の持つ輸送機構の詳細を明らかにするため、不死化ラット脳毛細血管内皮細胞株を確立し、種々トランスポーターの機能発現を確認した。中枢移行性の少ない種々ニューキノロン抗菌薬やH1-アンタゴニストの輸送機構とABCトランスポーターの関与を明らかにした。6)OCTN2やOATP-C等のSNPsの機能特性を明らかにした。7)トランスポーターを発現するアデノウイルスベクターを構築し、本組換えウイルスをラットおよびマウスに投与することによって肝臓や血液脳関門に新たな薬物輸送活性を付与することに成功した。本研究によっていくつかの薬物の体内動態に及ぼすトランスポーターの意義が明確にされた。本研究の成果は、今後、合理的な医薬品の分子設計の提言し、臓器標的化を指向したドラッグデリバリーシステムの開発に役立てて行く必要がある。<br />The author' s research on transporter-mediated pharmacokinetics focuses on the molecular functional characteristics of drug transporters including oligopeptide transporter, monocarboxylic acid transporter, anion transporter, organic cation transporters, organic cation/carnitine transporters (OCTNs) and the ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and MRP2. We have successfully demonstrated that the transporters play important roles in the influxes and/or effluxes of drugs in intestinal and renal epithelial cells, hepatocytes and brain capillary endothelial cells that form the blood-brain barrier. In the systemic carnitine deficiency (SCD) phenotype mouse model, juvenile visceral seatosis (jvs) mouse, a mutation in the OCTN2 gene was found. Furthermore, several types of mutation in human SCD patients were found, demonstrating that OCTN2 is a physiologically important carnitine transporter. OCTNs transport not only carnitine but also various organic cationic drugs in a sodium-independent manner. It is suggested that OCTNs are multifunctional transporters for the uptake of carnitine into tissue cells and at the same time for the elimination of intracellular organic cationic drugs. In this research term, novel cDNA of organic anion transporters i.e., OATP-B, OATP-D and OATP-E have been isolated and functionally characterized. Furthermore, single nucleotide polymorphism of OATP-B, OATP-C and OCTN2 in the Japanese population was analyzed. Although more data should be collected, such information will enable us to establish ultimate drug delivery system.<br />研究課題/領域番号:12307057, 研究期間(年度):2000-2002<br />出典：「薬物トランスポーター群の分子認識・輸送の多様性に基づいた臓器移行性の制御」研究成果報告書 課題番号12307057 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
本研究においては薬物の消化管吸収性促進を目的とし、小腸上皮細胞に備わるトランスポーターならびに膜動輸送機構に関する研究を行った。その結果、モノカルボン酸輸送については、アニオン交換輸送体として働く分子的実体の一つとしてAE2やMCT1が安息
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香酸やサリチル酸などのモノカルボン酸系化合物の消化管吸収に働いていることがわかった。即ち、pH依存的なモノカルボン酸輸送系としてMCT1やAE2が重要な役割を果たしていることが示唆され、モノカルボン酸系化合物の小腸上皮細胞膜輸送におけるトランスポーターの重要性が明らかとなった。一方、ペプチドトランスポーターPepT1については抗ウイルス薬アシクロビルのバリンエステル体がその基質となることを明らかにした。本結果はPepT1の基質認識に対してペプチド結合が必須でないことを示す新しいPepT1の機能特性を提示するものである。また、パーキンソン病治療薬L-dopaのペプチド誘導体を合成し、その吸収性促進効果について検討を行った結果、L-dopaがアミノ酸輸送系を介して吸収されるよりも誘導体がペプチド輸送系を介して膜透過されるほうがより高い吸収性が期待できることが示された。以上の成果は、PepT1の機能ならびに経口デリバリーへの応用性について新たな知見を与えるものである。さらに分子サイズの大きなペプチドの経口デリバリー法の樹立を目的とし、小腸における吸着介在型エンドサイトーシス機構について検討をした。その結果、小腸には塩基性ペプチドを幅広く取り込むエンドサイトーシス機構が備わっていることを明らかにできた。以上、本研究成果は、消化管に備わるトランスポーターあるいは膜動輸送機構が薬物の消化管吸収に機能することを実証するものであり、またそのような膜輸送機構が薬物の消化管吸収性を制御する手法として有用であることを示すものである。<br />In the present study, identification and functional significance of intestinal transporters in the drug absorption were studied. The obtained results are as follows :1. Monocarboxylic acids have been thought to be absorbed by passive diffusion mechanism according to pH-partition theory. However, in the present study, two transporters that are present at the intestinal epithelial cells and accept monocarboxylic acids as the substrates were identified. MCT1 is a proton-cotransporter for monocarboxylic acids such as lactic acid and pyruvic acid. However, when MCT1 was stably transfected to MDA-MB231 cells, it exhibited transport activity for acidic drugs such as benzoic acid and salicylic acid In addition, anion antiporter AE2 also transported such monocarboxylic acids. Furthermore, immunohistochemical analysis demonstrated the presence of MCT1 at the brush-border membrane as well as basolateral membrane. These results suggest that monocarboxylic acid drugs are absorbed via specific trans porters and will be useful for the enhancement of intestinal absorption of acidic drugs by utilization of these transporters.2. Peptide transporter, PepT1 is present at the brush-border membrane of intestinal epithelial cells and mediates absorption of various di- and tri-peptides in a pH-dependent manner. L-dopa, which has low bioavailability, was derivated to dipeptide and the mechanism of intestinal absorption was examined. L-dopa-L-phe, a peptide-derivative of L-dopa, showed significantly higher permeability than that of L-dopa across the intestinal epithelial monolayers and the permeability was significantly decreased in the presence of high concentration of native dipeptides. So, peptide-derivation is expected to be useful for the increased intestinal absorption by utilizing peptide transporter PepT1.These lines of studies provide new insight of the significance of membrane transporters and new strategy to control intestinal absorption of drugs by utilizing the transporters in the intestinal epithelial cells.<br />研究課題/領域番号:10557214, 研究期間(年度):1998-1999<br />出典：「小腸上皮トランスポーター遺伝子発現系による経口薬物スクリーニングシステムの開発」研究成果報告書 課題番号10557214 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
本研究では、薬物や生理的物質の体内動態に関わるトランスポーターの同定・機能解析を目的とした。得られた第一の成果は、新規に遺伝子クローニングに成功したOCTNトランスポーターファミリーの薬物ならびに生理的基質としてのカルニチン輸送解析である。
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本研究では、特にヒト及びマウスOCTN2の遺伝子クローニングを行い、その組織分布性や機能特性から生理的役割として脂肪酸代謝に重要なカルニチントランスポーターであることを実証した。すなわち、カルニチン欠乏症状を示すjvsマウスならびに臨床医の協力を得て得られた患者におけるOCTN2遺伝子解析によって、OCTN2遺伝子変異が直接的にカルニチン欠乏症と関連していることを示すことに成功した。さらに、OCTNはカルニチンとともに有機カチオンも輸送することが示された。しかも、カルニチンはナトリウムイオン依存的に、有機カチオン輸送はナトリウムイオン非依存的に輸送する多機能的トランスポーターであることが示された。本研究成果は、全身性カルニチン欠乏症の原因遺伝子の同定という、生理的・医学的に極めて意義のある研究成果となった。特にカルニチン欠乏症は小児においては致死的あるため、その遺伝子診断など臨床的に極めて有用な情報を提供する基礎研究成果となった。その他には、血液脳関門で働くモノカルボン酸トランスポーターMCT1の機能発現の実証、元来リン酸トランスポーターとしてクローニングされたNpt1がアニオン性薬物を輸送しその腎・肝排泄に関わること、キノロン系抗菌薬の臓器移行・排泄にはMRP2やP-糖蛋白質を含む複数のトランスポーターが関与していること等の結果が得られた。これら薬物輸送に働くトランスポーターの同定、機能解析、発現部位の同定、および薬物速度論的なトランスポーターの役割の解析研究は、トランスポーターを利用した薬物動態制御法の可能性を強く示すものである。<br />Various transporters that mediate membrane transport of drugs as well as physiological compounds were clarified by molecular cloning of the genes and their functional analysis by gene expression systems. The obtained results are as follows :1. Novel transporter family OCTNs were molecularly cloned and their transport functions were analyzed by transfection of the gene to HEK293 cells. Human and mouse OCTN2 transported physiologically important carnitine in a sodium dependent manner. JVS mice that show systemic carnitine deficiency(SCD) syndrome had a mutation in OCTN2 gene with loss of carnitine transport function. Furthermore, various mutations in OCTN2 gene were identified in patients who show the SCD syndrome. From these results, it was clarified that OCTN2 is a physiologically important camitine transporter and its mutation leads to the SCD. Interestingly, OCTN2 and its isoform OCTN1 transported organic cations in a sodium independent manner. Accordingly, OCTNs are unique transporters which have are multifunctionality by transporting carnitine and organic cations in the distinct mechanisms.2. Molecular characterization of the transporter for monocarboxylic acids at the blood-brain barrier (BBB) was performed. Monocarboxylic acid transporter MCT-1 gene was expressed at the BBB and was found to play important role in the transport of organic weak acids by the in vitro cultured cells and in vivo studies.3. Multiple efflux mechanisms for new quinolone antibacterial agent were found to be expressed at the BBB. They are P-glycoprotein and unknown transporters sensitive to anionic compounds. These multiple efflux transporters seem to restrict the brain distribution of quinolones and other drugs, resulting in a low distribution into the central nervous system.These lines of studies provide new insight of the siginificance of membrane transporters and new strategy to control disposition of drugs by focusing on the transporters function present in various tissues.<br />研究課題/領域番号:10470510, 研究期間(年度):1998-1999<br />出典：「薬物のトランスポーター介在輸送に基づいた臓器移行性の制御」研究成果報告書 課題番号10470510 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />薬物間相互作用(DDI)は薬物療法のリスクになるため、その回避が求められる。従来、DDI機構として薬物代謝酵素やトランスポーターが指摘されている。しかし、従来のDDIは血漿中濃度変動に基づいており、実
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際に薬物が作用する組織・細胞内濃度に対する評価は欠如していた。本研究では組織局所でのDDIとしてLocal DDIという概念を仮定し、汎用される医薬品ドネペジルならびにシロスタゾール間でのトランスポーター上でのDDIによる心毒性リスクの増大を示した。組織中濃度測定は容易ではないが、従来のDDIのリスク回避を一歩進めるために、様々な事象よりLocal DDIリスクを評価・予測する必要を提唱できた。<br />Clinical reports indicate that cardiotoxicity due to donepezil occurs after co-administration with cilostazol. We speculated that the concentration of donepezil in heart tissue might be increased by interaction with cilostazol at efflux transporter BCRP in heart. In this study, donepezil was found as a substrate of BCRP. Cilostazol inhibited BCRP with IC50 of 130 nM, which is less than clinically achievable unbound plasma cilostazol (about 200 nM). In in vivo rat study, we found that cilostazol significantly increased the donepezil concentrations in heart and brain, where BCRP functions as the blood-tissue barrier, whereas the plasma concentration of donepezil was unaffected. In addition, in vitro accumulation of donepezil in heart tissue slices of rats was significantly increased by cilostazol. Accordingly, donepezil-cilostazol interaction at BCRP may be clinically relevant in heart and brain without any apparent change in plasma concentration, resulting in side effect of donepezil.<br />研究課題/領域番号:26670075, 研究期間(年度):2014-04-01 – 2016-03-31
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学薬学部<br />本研究では、血液脳関門に存在するトランスポーターの分子的・機能的探索と新規評価系の確立を試みた。二年間の研究を通じて、血液中から脳内への栄養物輸送に働く種々のトランスポーターの同定に成功した。まず、乳酸やピルビン酸
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輸送に働くモノカルボン酸トランスポーターMCT1である。二番目はアミノ酸輸送に働くLAT1、LAT2およびその補助因子4F2hcであり、三番目はカルニチントランスポーターとして働くOCTN2である。いずれのトランスポーターも脳内への物質取り込みに働くタイプであり、これらが安息香酸、L-DOPAやアセチルカルニチンなどの薬物の脳内移行にも働くことを示した。また、薬物の中枢移行についてはH1アンタゴニストのエバスチンおよび代謝産物カレバスチン、さらにキノロン系抗菌薬のグレパフロキサンに着目した。その結果、いずれの薬物もP-糖タンパク質による排出により脳内移行性が低く保たれており、中枢性副作用が低いものと推定された。さらにグレパフロキサシンについてはP-糖タンパク以外の排出輸送機構の存在が示唆され、複数の排出輸送系により脳内の恒常性が維持されているものと考えられた。本研究を通じて、新たな評価系として脳毛細血管内皮の不死化細胞RBEC1の樹立を行い、研究成果を得る上で有用な実験系となった。さらに、より生理的機能を維持できると考えられるin viro血液脳関門評価系として、脳毛細血管内皮細胞とアストロサイトの共培養系の導入を行った。共培養により血液脳関門マーカーや密着結合性の向上が見られたが、さらなる改善の必要性を示す結果となった。以上、本研究成果として新たな血液脳関門機能を分子・機構論的に見いだすことに成功するとともに、マススクリーニングに適した評価系の確立を試みた。評価系についてはさらなる改善が必要であるが、見いだされた新規血液脳関門機能は今後の脳内への薬物デリバリーに有用な情報を与えるものとなった。<br />In the present study, we studied membrane transporters equippecd, in the brain capillary endothelial cells that are functional as the blood-brain barrier. Through this study, we found three new transporters that are expressed at the blood-brain barrier.One of those transporters are monocarboxylic acid transporter MGT1, which tworks for uptake and/or efflux organic weak acids such as lactic acid, pyruvic acid and benzoic acid. The second transporter is neutral amino acid transporters LAT1 and LAT2. These two amino acid transporters work for the uptake of amino acids that are relatively hydrdphpbic and large molecules, including leucine, tyrosine and phenylalanine. These are also important for the brain livery of L-DOPA that is effective for perkinsonism. The third transporter is OCTN2that is callsified as the carnitine/organic cation transporter. OCTN2 is a Na^+-dependent carnitine transporter and works for the brain uptake of acetyl-L-carhitirie that is expected to be useful for Aitzhe imer's disease. On the other hand, brain efflux transporters that protect brain from the toxic xenobiotics. As the model drugs, H1-antagonist, ebastine and carebasitine and fluoroquinolone, grepafloxacine, was used in the present study. Generally, fluoroquinolonesand H1 antagonists exhibit adverse effects such as epilepsy and sedative effects, while the drugs studied in the present study do not show such adverse effects. We expected that these drugs might not have enough permeability across the blood-brain barrier, resulting in the insufficient delivery to the brain to cause unfavorable adverse effects. Varipus Kinds of studies on the BBB transport of these drugs demonstrated that there are at least two types of brain efflux transporters, including p-glycoproteih and anion exchange transporter, of which molecular identification remains to be succeeded.All of these studies were performed by using various BBB-transport techniques. Especially, newly developed cell line RBEC1 that were derived from rat brain capillary endothelial cells was useful for the success of the present study. Furthermore, we challenged of the coculture of the endothelial cells and astrocytes in order to mimic the in vivo BBB. Although we partly succeeded to prepare the in vitro BBB model, further improvement will be essential for the efficient and complete model for the evaluation of blood-brain barrier transport.<br />研究課題/領域番号:12557229, 研究期間(年度):2000-2001<br />出典：「血液脳関門の機能的実体解明に基づいた薬物中枢移行性評価法の確立」研究成果報告書 課題番号12557229 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学大学院自然科学研究科<br />カルニチン欠乏症は、最終的には心機能異常など致死的症状を示す病態であるが、主に遺伝性の全身性カルニチン欠乏症と、また臨床的な薬物投与や食事等栄養状態による二次性カルニチン欠乏症に分けられる。本研究では
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二次性カルニチン欠乏症の中で、薬物誘導型カルニチン欠乏症におけるOCTN2の寄与の可能性について、腎を中心とした臓器におけるOCTN2の有機カチオン輸送や薬物によるカルニチン輸送活性変動について解析を行うことにより、OCTNトランスポーターの生理的・薬物動態的役割ならびにカルニチン欠乏症との関連について解析を行った。ヒトならびにマウスOCTN2は、カルニチンをNa^+依存的に、有機カチオンの一種であるテトラエチルアンモニウム(TEA)をNa^+非依存的に輸送した。また、TEA以外にもメピラミンやベラパミル及びキニジンなどのカチオン性薬物を輸送した。一方、これらカチオン性化合物に加え、中性ならびにアニオン性化合物によってもカルニチン輸送活性は機能阻害を受けた。OCTN2が存在する腎臓においては、カルニチンはNa^+を駆動力とした再吸収に働くが、このような臨床的に使われる医薬品によって機能阻害を受けるということは、薬物誘導型の二次性のカルニチン欠乏症発症原因の一つとしてOCTN2が関与することを示すものであることが明らかになった。一方、他のOCTNメンバーOCTN1ならびにマウスOCTN3についても解析を行った結果、OCTN3精巣特異的な発現であり、またOCTN1は低いカルニチン輸送活性しか有せず、全身性カルニチン欠乏症としてはOCTN2が最も重要であることが示唆された。<br />In the present study, novel Na^+-dependent carnitine/organic cation transporter family, OCTNs from human and mouse were identified and functionally characterized. We isolated two and three members of OCTN family from human and mouse, respectively. OCTNs are present in various tissues, including kidney, heart, skeletal muscle and placenta strongly, and in several human-derived cancer cell lines. By immunohistochemical analysis in kidney, mouse OCTNs localized commonly in luminal membrane of tubular epithelial cells. Most of human and mouse OCTNs exhibited multifunctionality by transporting both of carnitine and organic cation, tetraethylammonium (TEA). Furthermore, sodium ions were essential for carnitine transport by human and mouse OCTN1 and 2. In systemic carnitine deficiency (SCD) phenotype mouse model, juvenile visceral steotosis (jvs) mouse, mutation in OCTN2 gene was found. Furthermore, several kinds of mutation in human SCD patients were found, demonstrating that OCTN2 is a physiologically important carnitine transporter. Interestingly, TEA transport was sodium independent. In addition, OCTNs transporterd various cationic drugs such as quinidine, verapamil, and actinomycin D.Furthermore, since one mutation of human OCTN2 lost carnitine transport activity but retained TEA transport activity, it was suggested that OCTN2 have differential functional sites for carnitine and organic cations. So, OCTNs are thought to be multifunctional transporters by transporting carnitine and organic cations by sodium ion dependent and independent manner, respectively, and would be important for disposition of organic cationic drugs as well as carnitine. Furthermore, since carnitine transport via OCTN2 is inhibited various compounds, including organic cations, organic anions such as valproic acid and neutral compound such as cortisole, it is anticipated that drug-induced secondary carnitine deficiency could be caused by interaction on OCTN2.<br />研究課題/領域番号:11672212, 研究期間(年度):1999-2000<br />出典：「高親和性カルニチントランスポーターの機能特性と薬物誘導型毒性発症機構との関連」研究成果報告書 課題番号11672212(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学大学院自然科学研究科<br />本研究では、薬物や生理的物質の体内動態に関わるトランスポーターの同定・機能解析を目的とした。得られた第一の成果は、新規に遺伝子クローニングに成功したOCTNトランスポーターファミリーの薬物ならびに生理
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的基質としてのカルニチン輸送解析である。本研究では、特にヒト及びマウスOCTN2の遺伝子クローニングを行い、その組織分布性や機能特性から生理的役割として脂肪酸代謝に重要なカルニチントランスポーターであることを実証した。すなわち、カルニチン欠乏症状を示すjvsマウスならびに臨床医の協力を得て得られた患者におけるOCTN2遺伝子解析によって、OCTN2遺伝子変異が直接的にカルニチン欠乏症と関連していることを示すことに成功した。さらに、OCTNはカルニチンとともに有機カチオンも輸送することが示された。しかも、カルニチンはナトリウムイオン依存的に、有機カチオン輸送はナトリウムイオン非依存的に輸送する多機能的トランスポーターであることが示された。本研究成果は、全身性カルニチン欠乏症の原因遺伝子の同定という、生理的・医学的に極めて意義のある研究成果となった。特にカルニチン欠乏症は小児においては致死的あるため、その遺伝子診断など臨床的に極めて有用な情報を提供する基礎研究成果となった。その他には、血液脳関門で働くモノカルボン酸トランスポーターMCT1の機能発現の実証、元来リン酸トランスポーターとしてクローニングされたNpt1がアニオン性薬物を輸送しその腎・肝排泄に関わること、キノロン系抗菌薬の臓器移行・排泄にはMRP2やP-糖蛋白質を含む複数のトランスポーターが関与していること等の結果が得られた。これら薬物輸送に働くトランスポーターの同定、機能解析、発現部位の同定、および薬物速度論的なトランスポーターの役割の解析研究は、トランスポーターを利用した薬物動態制御法の可能性を強く示すものである。<br />Various transporters that mediate membrane transport of drugs as well as physiological compounds were clarified by molecular cloning of the genes and their functional analysis by gene expression systems. The obtained results are as follows :1. Novel transporter family OCTNs were molecularly cloned and their transport functions were analyzed by transfection of the gene to HEK293 cells. Human and mouse OCTN2 transported physiologically important carnitine in a sodium dependent manner. JVS mice that show systemic carnitine deficiency(SCD) syndrome had a mutation in OCTN2 gene with loss of carnitine transport function. Furthermore, various mutations in OCTN2 gene were identified in patients who show the SCD syndrome. From these results, it was clarified that OCTN2 is a physiologically important camitine transporter and its mutation leads to the SCD. Interestingly, OCTN2 and its isoform OCTN1 transported organic cations in a sodium independent manner. Accordingly, OCTNs are unique transporters which have are multifunctionality by transporting carnitine and organic cations in the distinct mechanisms.2. Molecular characterization of the transporter for monocarboxylic acids at the blood-brain barrier (BBB) was performed. Monocarboxylic acid transporter MCT-1 gene was expressed at the BBB and was found to play important role in the transport of organic weak acids by the in vitro cultured cells and in vivo studies.3. Multiple efflux mechanisms for new quinolone antibacterial agent were found to be expressed at the BBB. They are P-glycoprotein and unknown transporters sensitive to anionic compounds. These multiple efflux transporters seem to restrict the brain distribution of quinolones and other drugs, resulting in a low distribution into the central nervous system.These lines of studies provide new insight of the siginificance of membrane transporters and new strategy to control disposition of drugs by focusing on the transporters function present in various tissues.<br />研究課題/領域番号:10470510, 研究期間(年度):1997-1998<br />出典：「薬物のトランスポーター介在輸送に基づいた臓器移行性の制御」研究成果報告書 課題番号10470510 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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中西, 猛夫 ; Nakanishi, Takeo
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />本研究成果により、炎症を媒介するケミカルメディエータであるprostaglandin(PG) E2は、炎症組織で活性化されるマクロファージ細胞(Mφ)内に発現するPGトランスポーター(OATP2A1)
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により、リソゾーム等の酸性オルガネラに貯留された後、炎症刺激に伴って開口分泌されることが示された。げっ歯類動物を用いたOATP2A1の遺伝的および化学的抑制は内毒素による発熱効果を減弱させたことから、OATP2A1は解熱薬の新規標的として期待される。<br />The present study indicates that an important chemical mediator prostaglandin (PG) E2 is transported into acidic organelles including lysosome via OATP2A1, which is a transporter with high affinity to PGE2, in macrophages activated under inflammatory condition, and then it is secreted by exocytosis. Since genetic and chemical suppression of Oatp2a1 attenuated endotoxin-induced fever in rodent models, OATP2A1 is expected to be a novel target for antipyretic drugs.<br />研究課題/領域番号:15K15181, 研究期間(年度):2015-04-01 - 2017-03-31
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中西, 猛夫 ; Nakanishi, Takeo
概要:
5-アミノレブリン酸(5-ALA)は腫瘍組織選択的に光増感性蛍光物質プロトポルフィリンIX(PPIX)の蓄積を誘導する光力学療法薬である。しかし、5-ALAによる腫瘍組織選択的PPIX誘導メカニズムは未解明である。本研究では、光線力学治療・
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診断に有効な腫瘍種を判断する分子診断技術の確立を目指し、5-ALAに曝露したヒト腫瘍組織由来株化がん細胞において、細胞内PPIX蓄積性決定因子を検討した。その結果、細胞内PPIX蓄積は、PPIX生合成、フェロキラターゼ酵素活性、およびPPIXの排出により決定されることが示唆された。<br />5-Aminolevulinic acid is one of the most potent photodynamic therapeutic agents, because it induces tumor cell-specific intracellular accumulation of a photosensitizer, protoporphyrin IX (PPIX). However, molecular mechanisms of such 5-ALA-induced PPIX accumulation remain unclear. In the current study, in order to establish a basis to predict efficacy of photodynamic therapy to treat cancer, molecular mechanisms of intracellular accumulation of PPIX induced by 5-ALA were studied in various human cancer cell lines exposed to 5-ALA. Results suggested that PPIX accumulation is likely determined by PPIX biosynthesis, ferrochelatase (FECH) activity and PPIX efflux.
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玉井, 郁巳 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />OATPなど薬物動態を左右する輸送体の活性変動機構として新たにマイクロRNA（miRNA)の関与に関する検討を行った。その結果、消化管、肝臓両組織で機能するOATP2B1の発現に関与するmiRNAの同
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定に至った。さらにOATP基質となるスタチン類に伴う筋毒性診断に応用可能な新規miRNAを示唆するに至ることができた。一方、食品との薬物の相互作用機構としてのmiRNAの検討も並行して進めた結果、リンゴ由来ナノ粒子に含まれるmiRNAが消化管輸送体の発現調節に働く可能性を示唆することもできた。一方、新たに消化管で薬物吸収に寄与する核酸輸送体の同定にも成功した。<br />To understand the mechanisms for altered drug absorption and disposition by co-administered drugs and foods, we studied possible involvement of micro RNA (miRNA) on the expressional regulation of drug transporter OATPs. (1) OTAP2B1, which is expressed both in liver and intestine, was found to be regulated by specific miRNA by in vitro experiments. (2) Statins are very good substrates of OATPs and they have possibility to cause myopathy as side effect. We succeeded to suggest several miRNA that can be used for diagnosis of myopathy. (3) As the mechanism of drug-food interaction, it was demonstrated that apple-derived nanoparticles include many miRNAs and they affect expression of OATP2B1, suggesting that food-derived miRNAs could regulate expression of OATPs, (4) Transporters responsible for intestinal absorption of anti-cancer nucleoside analogue were identified and further studies to demonstrate the mechanisms to regulate their expression, including miRNA should be conducted.<br />研究課題/領域番号:16K15158, 研究期間(年度):2016-04-01 - 2018-03-31
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玉井, 郁巳 ; Tamai, Ikumi
概要:
尿酸調節に働く腎臓の新規トランスポ-タ-ならびに薬物との相互作用を明確にするとともに、解析モデルとしてラットの有用性をラット尿酸トランスポーターの詳細を解析することにより明らかにした。さらにヒトへの展開を目的としたPETプローブの合成ならび
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に腎外排泄経路として消化管の重要性を分子論・速度論的に明確にした。本成果は今後の尿酸変動機構の解析並びに高尿酸血症との治療薬の探索・評価に有用である。<br />Transporter molecule that control renal handling of uric acid and effect of uricosuric-and anti-uricosuric drugs were analyzed using in vitro and in vivo model. OAT2 was newly found as the uric acid transporter in kidney. As the animal model, uric transporters expressed in rats were characterized and found to be useful as the model of uric acid disposition. In addition, as the extra-renal elimination pathways of uric acid, intestinal secretion was found to be very important and the BCRP transporter was found to be responsible for that process. Furthermore, for in vivo analysis in human, the method for the synthesis of PET probe of uric acid was succeeded. It was preliminarily applied in PET analysis in rats. All these studies related to the mechanism and evaluation method of uric acid disposition is useful for future development of drugs that can control serum uric acid level and physiological and pathological significance of uric acid.<br />研究課題/領域番号:21390044, 研究期間(年度):2009-2011
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荒川, 大 ; Arakawa, Hiroshi
概要:
核磁気共鳴イメージング (MRI)は天然同位体に利用可能であるため、腫瘍における化合物の蓄積を可視的に評価できる可能性を持つ。本研究ではがんに高発現するペプチドトランスポーター（PEPT）を標的とし、フッ素誘導体PEPT基質の核磁気共鳴イメ
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ージング (MRI)プローブとしての有用性を検証することを目的とした。結果として、PEPT1およびPEPT2に良好な基質の合成に成功し、そのうち良好なMRIプローブとして期待された化合物のマウスにおける体内動態特性を調べた。一方、MRI解析を行った結果、すい臓がん細胞の担がんマウスモデルでは腫瘍への良好な集積は確認されなかった。<br />Magnetic resonance imaging (MRI) is available for natural isotopes, which has the potential to be able to visually assess the accumulation of compounds in tumors. In the present study, we aimed to synthesize a novel MRI probe targeting peptide transporters (PEPT) that are highly expressed in cancer. As a result, we succeeded in synthesis of good substrates for PEPT1 and PEPT2, among which the pharmacokinetic characteristics of the compound expected as a good MRI probe were investigated in mice. On the other hand, favorable tumor accumulation was not observed in xenograft mouse models of pancreatic cancer cells by MRI analysis.<br />研究課題/領域番号:16K18865, 研究期間(年度):2016-04-01 - 2019-03-31
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />研究代表者等がこれまでにクローニングしたOCTN2は、全身性カルニチン欠損症の原因遺伝子である。本年度我々はマウスよりOCTN2のホモログとして、OCTN1およびOCTN3のクローニングを行い、生理的
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物質の維持とゼノバイオティクスの排除への関与について検討を行った。OCTN1、OCTN2、OCTN3はいずれも腎臓に共通して発現が認められたが、OCTN3は精巣でもっとも高い発現を示した。各遺伝子産物について、カルニチンおよび有機カチオン性ゼノバイオティクス(TEA)の取り込み活性を測定した結果、OCTN1およびOCTN2はNa^+依存的に、OCTN3はNa^+非依存的にカルニチンを輸送された。またOCTN1およびOCTN2はTEAを輸送したのに対し、OCTN3は輸送しなかった。よって遺伝子の存在がマウスのみに確認されているOCTN3は、カルニチンに対して特異性が高い特徴的なトランスポーターであることが明らかとなった。OCTN3のカルニチン輸送はNa^+非依存的でその発現が精巣に特に強く認められることから、生理的には精巣での役割が主であると考えられた。OCTN1のカルニチン輸送活性はOCTN2、OCTN3と比べ非常に低いことから、OCTN1が有機カチオントランスポーターとして重要な役割を持つと考えられた。OCTN2はカルニチンおよびTEAのいずれも効率的に輸送するが、腎尿細管における輸送の方向性は、カルニチンがNa^+依存的に再吸収方向に輸送されるのに対して、TEAは分泌方向の輸送となる。すなわち、OCTN2は生体に必要なカルニチンの再吸収と生体異物である有機カチオンの分泌に働く多機能性トランスポーターであることが示された。これらの結果は、OCTN2によるカルニチンのinfluxとTEAのeffluxがシンクロナイズしていることを示すものであり、OCTN2が生理的物質の維持とゼノバイオティクスの排除とがシンクロナイズした生体防御機構の一部として機能している可能性が考えられた。<br />研究課題/領域番号:11167237, 研究期間(年度):1999-2000<br />出典：「ゼノバイオティックス取り込み・排出輸送と化学変換がシンクロナイズした生体防御機構」研究成果報告書 課題番号11167237（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11167237/)を加工して作成
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宮本, 謙一 ; Miyamoto, Ken-ichi
概要:
金沢大学理工研究域<br />腫瘍細胞は生体内の微小環境にいて生体内因子に応答して悪性形質を発現していると考えられる。AH66細胞はin vivoでシスプラチン(CDDP)耐性を示す。そこで、対照細胞としてAH66から分離されたAH66F細
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胞を用い、AH66細胞のin vivo耐性の機序を検討した。AH66F細胞のin vitroにおけるCDDP感受性は、腹水の添加によってもIL-1β、IL-6、TNF-αの添加によっても全く変化しなかったが、AH66細胞のCDDP感受性は、腹水の添加だけでなく、IL-1β、TNF-αにより有意に低下した。そして、この感受性の変化は、PKC阻害剤で抑制できたが、PKA阻害剤の影響を受けなかった。細胞内メチロチオネイン(MT)含量を測定したところ、AH66F細胞ではいずれの処置によってもMT含量は変化することはなかったが、AH66細胞は、腹水中で培養することによりMT量が著しく増加することが明らかとなった。さらにAH66細胞を腹水中で培養することによりCDDP取り込み量が低下することも見出した。これに伴い、細胞外へのCDDP排出量が増加した。CDDPはグルタチオン抱合した後、アニオントランスポーターにより細胞外へ排出されるため、AH66細胞に発現しているアニオントランスポーターを検索したところ、MRP、cMOATの他数種類のトランスポーターの発現を確認した。しかし、腹水により発現量が変化したのはcMOATのみであった。対照細胞のAH66Fでは、CDDP取り込み量はAH66細胞より著しく高く、上記のような処理によっても細胞内CDDP量には変化がなかった。また、AH66F細胞はMRPを発現していたが、cMOATmRNAの発現は確認できなかった。以上のように、in vitroでは検知し得ないin vivo薬剤耐性を提示できたこと、この様な現象が生体内での癌細胞の増殖環境で起こっていることを示したことは意義深いものと考える。<br />研究課題/領域番号:10169218, 研究期間(年度):1998<br />出典：「微小環境における腫瘍細胞の悪性誘導機序の解析と制御」研究成果報告書 課題番号10169218（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10169218/)を加工して作成
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崔, 吉道 ; Sai, Yoshimichi
概要:
金沢大学理工研究域<br />中枢へ抗がん剤を送達するためには、その移行障壁となる血液脳関門(BBB)を克服する必要がある。そこで本研究では、脳腫瘍に焦点をあて、ペプチドトランスポーターをBBBに発現させることにより、ペプチド様抗がん剤を選
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択的に送達することを目的として以下の検討を行った。1.ペプチド性抗がん剤を輸送するオリゴペプチドトランスポーターhPEPT1を発現するアデノウイルスベクターAdhPEPT1-EYFPを作製し、血液脳関門におけるペプチド輸送機能発現を株化細胞RBEC1を用いてin vitroで確認した。AdhPEPT1-EYFPの感染効率はその他の培養細胞と比較してあまり高いものではなかったが、放射性標識カルノシンを基質とした輸送活性はGFP発現アデノウイルス感染細胞あるいは非感染細胞と比較して、約10倍程度の取り込み上昇が見られた。2.In vivoでの輸送機能発現を検討するに当たって、まずは感染効率の高い肝臓を用いてin vivoでの外来オリゴペプチドトランスポーター導入により、どの程度のペプチド化合物の組織移行性向上が見られるかを検討した。マウスにAdhPEPT1-EYFPを静脈投与し、hPEPT1-EYFPの発現をRT-PCRならびにWestern blot、凍結切片の免疫染色により検討したところ、いずれの実験によってもhPEPT1-EYFPの発現が確認された。そこで、AdhPEPT1-EYFPに感染したマウスにカルノシンを静脈内投与して、30分後に肝臓への組織移行性を評価したところ、カルノシンのKp値は約7倍に増大した。このことから本ベクターを用いてin vivoにおいても臓器レベルでペプチド輸送活性を有効に付与できることが示された。一般に脳移行性の低い化合物について同様の検討を行った場合、例えば細胞間隙にのみ分布するイヌリンを用いて測定すると、約0.2程度の値がえられる。このことから、もし仮にAdhPEPT1-EYFPによる脳毛細血管内皮細胞への発現効率が肝臓の35分の1以上であるとするならば、血液脳関門においても何らかの輸送活性が検出できる可能性が考えられた。<br />研究課題/領域番号:13218052, 研究期間(年度):2001<br />出典：「BBB指向性トランスポーター発現アデノウイルスベクターを用いた抗がん剤脳腫瘍送達」研究成果報告書 課題番号13218052（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13218052/)を加工して作成
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辻, 彰 ; Tsuji, Akira
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />本研究は、オリゴペプチド、有機アニオンおよび有機カチオン系薬物を輸送する一次性(ABC)トランスポーターおよび二次性のトランスポーターが、生体外異物(ゼノバイオティックス)の細胞内取り込みおよび排出に
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関わるシンクロナイズした生体防御のシステムの一つとして機能しているかを明らかにすることを目的とした。グレパフロキサシンは経口投与後の吸収率が良好なニューキノロン抗菌薬である。本薬物は胆汁クリアランスが高い特徴を持ち、遺伝子欠損ラットEHBRを用いた検討からMRP2の基質であると考えられている。そこで、HEBRを用いて消化管吸収過程に関わる分子メカニズムを解析した。小腸組織をUssing型チャンバーに装着し、グレパフロキサシンの経組織輸送を測定したところ、正常ラットにおいては分泌方向の輸送が吸収方向の2倍高かったが、EHBRにおいて分泌輸送は顕著に低下していた。正常ラットでみられた分泌輸送はMRP2阻害剤およびABCトランスポーターMDR1の阻害剤に感受性であった。肝臓においてMRP2はグレパフロキサシンの抱合代謝物の胆汁排泄に働くことが明らかにされている。また、昨年度の我々の研究により、グレパフロキサシンは小腸上皮細胞刷子縁膜に発現するMDR1によっても排泄されることが明らかにされている。これら2つの分泌型トランスポーターの基質となる一方で、前述のように本薬物は優れた消化管吸収性を示すことから、吸収方向にも何らかの非常に強力なトランスポーターが関与する可能性が強く示唆される。以上のことから、グレパフロキサシンの消化管吸収過程には、細胞取り込みに働く未同定のトランスポーター、グレパフロキサシンの細胞への侵入に対して防御的に働くMDR1、さらにおそらく細胞に取り込み後に未変化体および代謝物の分泌輸送に関与するMRP2がシンクロナイズして働いているものと考えられた。<br />研究課題/領域番号:13022226, 研究期間(年度):2001-2002<br />出典：「ゼノバイオティックスの取り込みと排出輸送がシンクロナイズした生体防御機構」研究成果報告書 課題番号13022226（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13022226/)を加工して作成
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久保, 義行 ; Kubo, Yoshiyuki
概要:
金沢大学理工研究域<br />本課題では、有機カチオン/カルニチントランスポーター・OCTN1およびOCTN2に焦点を絞り、これら分子の取り込み・排出機能が薬物の体内動態に及ぼす影響・メカニズムを解明することを目的とした。本年度は、作製を完
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了したoctn1遺伝子欠損動物(octn1^<-/->マウス)を用いて動態解析を実施した。octn1^<-/->マウスに放射標識化テトラエチルアンモニウム([^<14>C]TEA)静脈投与後し、その血中濃度・累積尿中蓄積量を経時的に測定した結果、octn1^<-/->マウスでは野性型と同等レベルを示された。また、各臓器の血漿/臓器濃度比に関してもoctn1^<-/->野性型マウス間で有意な差は見出されなかった。これらのことから、TEAの体内動態にOctn1が影響を及ぼす可能性は低いと考えられた。また、Octn2の機能欠損マウスであるjvsマウスを用いてH1アンタゴニストであるメピラミンの体内動態試験を実施した。この結果、野性型-jvsマウス間において心臓や腎臓などにおいてメピラミンの臓器分布に顕著な差が見出された。臓器スライスを用いたin vitro実験では、Octn2が心臓のメピラミン排出に関わることが示され、以上の結果から、生体において、Octn2はカルニチンを細胞内に取り込むインフラックス・トランポーターである一方で、有機カチオンに対してはエフラックス・トランスポーターとして機能することが示された(投稿準備中)。また、H1アンタゴニストには心臓毒性が知られており、今後、心臓毒性とOctn2の関わりを検討が重要と考えられる。今年度の結果は、Octn2の薬物体内動態における寄与が示され、また、心臓毒性との関わりが示唆された。その一方、Octn1に関しては、それを示す結果が得られなかったが、今後、多様な化合物を試みることにより、その役割を解明できると期待される。<br />研究課題/領域番号:17790118, 研究期間(年度):2005 – 2006<br />出典：「インフラックス・トランスポーターの異物取り込み・排出分子機構」研究成果報告書 課題番号17790118（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-17790118/)を加工して作成
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成橋, 和正 ; Naruhashi, Kazumasa
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同志社女子大学 / 金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />本研究では,小腸における薬物トランスポーターの機能的変動および変動影響因子の解明を目的として,総胆管結紮ラットにおけるin situ, in vitro系での小腸タウロコール酸輸送
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変動の検討,およびヒト小腸モデルCaco-2細胞における内因性物質によるMRP2, ASBT mRNA発現変動の検討を行った。胆管結紮3日後のラット小腸において,apical sodium-dependent bile transporter (ASBT)のmRANの発現量が有意に増加した。しかし、小腸薬物輸送能の検討として、closed loop法およびUssing chamber法でタウロコール酸の吸収の吸収を測定したところ,コントロール群,胆管結紮ラット群間で小腸のどの部位においても有意な差がみられなかった。よって、ASBT mRNAの発現増加は小腸での吸収機能にまで影響するものではなかった。また,どちらの実験系においても上部,中部で分泌指向性がみられたことから,上部,中部では内因性胆汁酸を分泌方向に輸送する未知のトランスポーターが存在し,機能している可能性が示唆された。胆汁鬱滞の状態では血中ビリルビンに加え,胆汁酸,サイトカインが増加することを確認した。これら内因性物質のトランスポーター発現調節の検討では,タウロコール酸およびコール酸はmultidrug resistance-associated protein 2(MRP2),ASBT mRNA発現に影響を与えないことが明らかになった。一方,ビリルビンおよびTNF-α処理によってMRP2 mRNA発現量が減少した。また,TNF-αとIL-1βの同時処理によって,MRP2 mRNA発現量が減少した。この結果から,胆汁鬱滞により増加する血漿中内因性物質のうち,ビリルビンおよびサイトカインが,小腸MRP2 mRNA発現量の減少に関与している可能性が示唆された。<br />研究課題/領域番号:15790092, 研究期間(年度):2003 – 2005<br />出典：「病態時の薬物消化管吸収の変化におよぼす薬物トランスポーターの影響」研究成果報告書 課題番号1579009（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-15790092/)を加工して作成
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玉井, 郁己 ; Tamai, Ikumi
概要:
金沢大学薬学部<br />薬物動態特性は薬効に著しい影響を及ぼすため、未然の薬物間相互作用予測や副作用防止のためには、薬物動態制御機構の解明が必要である。薬物動態に影響する生体側因子の一つはトランスポータータンパク質である。薬物のような生体
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異物輸送に働く分子の中には幅広い基質選択性を有する場合が多い。そのような基質多選択性(multispecificity)に関する検討が行われてきているが、未だ不明である。本研究では、薬物輸送に働く有機アニオントランスポーターOATPならびに有機カチオン/カルニチントランスポーターOCTN2に焦点を当て、その基質多選択性発現機構に関する検討を行った。OCTN2は生理的基質としてカルニチンを、異物としてTEAのような有機カチオン輸送に働く。カルニチン輸送における駆動力はNa^+であるが、TEA輸送にはNa^+が関与しない。OCTN2上にはカルニチンに特異的なCOO^-基を認識する部位が存在し、その活性化にNa^+の関与が示唆された。一方、TEAにはCOO^-基がなく、Na^+の影響を受けないと考えられた。カルニチンとTEAは相互阻害を示すが,完全な競合阻害形式ではなく、両者はOCTN2タンパク質上の活性部位を一部共有しており、完全には一致しないものと推定された。Na^+はカルニチン輸送の駆動力となるが、TEAはそれ以外のエネルギーを利用していると考えられる。従って、同一のトランスポーター上で基質により膜輸送機構が異なるトランスポーターの多機能性(multifunctionality)が、トランスポーターの示す基質多選択性の一メカニズムとして関与していることが示された。このようなトランスポーター分子のmultifunctioniltyに基づくmultispecificityの解析は例がなく、薬物トランスポーターの基質選択性の解明に新たなアプローチを提示する成果を得ることができた。<br />Pharmacokinetic characteristics are important for the adequate drug therapy and they are affected by many factors, including binding proteins, drug metabolizing enzymes and membrane transporters. Among them, drug transporter are important for the intestinal absorption, tissue distribution, and hepatic and renal excretion of drugs. Accordingly, it will be important what kinds of drugs are accepted as substrates for each transporter. However, some drug transporters accept various compounds as substrates and it has not been clarified the mechanism for such multispecificity of drug transporterOrganic cation/carnitine transporter OCTN and organic anion transporting polypeptide OATP-C also accept various physiological and drug compounds as substrates. In the present study, we studied the mechanism for the multispecificity in the substrate recognition of those transporters by focusing on the multifunctionality of themOCTN transports carnitine as physiological substrates and cationic compounds as xenobiotics. When OCTN transports carnitine, it exclusively shows Na^+-dependence, while the transport of organic cation such as tetraethylammonium (TEA) is Na^+-independent. The study using mutant protein of OCTN exhibited that carnitne and TEA partially shares the substrate recognition sites on OCTN2, while they are not identical. Na^+ largely affect the affinity of carnitine to OCTN2, while TEA did not show any change in the affinity to OCTN2 by Na^+. However, carnitine and TEA exhibited mutual inhibitory effect, while they are not explained by complete competitive inhibition kinetics. The difference in the transporting mechanism between carnitine and TEA could be explained by the presence of the carboxylmoiety that is specific for carnitine and the Na^+ affect the interaction between carboxylmoiety of carnitine and OCTN2 protein. These observations suggested that multispecificity of OCTN is due to the multifunctionality of OCTN by changing the transport mechanisms depending on the substrates, regarding the driving force, Na^+. Accordingly, clarification of the driving force of the transporter for each substrate is important to clarify the mechanism of multispecificity of transporters. In the case of OATP, at present no driving force has been clearly demonstrated, while OATP accept various compounds as substrates. To clarify the mechanism for the multispecificity of OATP, it will be essential to identify the driving force for each substrate in future<br />研究課題/領域番号:13470513, 研究期間(年度):2001 – 2002<br />出典：「薬物トランスポーター群のmultispecificity発現機構に関する研究」研究成果報告書 課題番号13470513（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-13470513/134705132002kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/)を加工して作成
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