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松永, 司 ; Matsunaga, Tsukasa
概要:
金沢大学医薬保健研究域薬学系<br />ヌクレオチド除去修復(NER)において、XPGとXPF-ERCC1はそれぞれ損傷の3′側と5′側の切断酵素として働くが、XPGやERCC1をノックアウトしたマウスはいづれも成長阻害、離乳前死亡というN
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ER欠損だけでは説明できない重篤な症状を示す。また、XPGはXPF-ERCC1による5′側切断にも関与している可能性が示唆されており、本研究ではXPGの除去修復エンドヌクレアーゼとしての機能以外の役割に注目した。1. Two-hybridシステムを用いた解析より、XPGとERCC1の相互作用が示唆された。プルダウンアッセイを用いて試験管内で確認したところ、バキュロウィルス高発現系から精製されたリコンビナントタンパクや試験管内転写/翻訳反応により合成されたタンパクで両者の相互作用が確認できた。また、その相互作用ドメインのマッピングを行い、XPGはN末とC末の2箇所(主にN末)にERCC1はN末の領域に特定できた。本研究で示されたXPGとERCC1との相互作用は、XPF-ERCC1の損傷部位へのリクルートに関与しているのかもしれない。2. XPGタンパクはNERとは別の修復機構である塩基除去修復(BER)にも関与する可能性が示唆されており、この点について検討した。まず、ウラシルを1個のみ含むDNA基質を用いて塩基除去修復の試験管内切断反応系を確立した。これを用いて各種細胞粗抽出液の切断活性を比較したところ、XP-G患者由来細胞や放医研の塩見らによって樹立されたxpgノックアウトマウス由来細胞の抽出液は、正常細胞に比べて常に低い切断活性(50-80%)を示すことがわかった。また、この低切断活性はウラシルDNAグリコシラーゼの反応効率の低下に起因していた。しかし、リコンビナントXPGを反応系に添加しても相補されず、XPGの塩基除去修復への関与は間接的なものであることが示唆された。<br />研究課題/領域番号:10165206, 研究期間(年度):1998<br />出典：「除去修復エンドヌクレアーゼの機能とその欠損による分子病態に関する研究」研究成果報告書 課題番号10165206（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10165206/)を加工して作成
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松永, 司 ; Matsunaga, Tsukasa
概要:
我々は近年、紫外線誘発DNA損傷のシクロブタン型ピリミジンダイマーや(6-4)光産物を超高感度に検出定量する系を開発し、(6-4)光産物に対するヌクレオチド除去修復欠損をバックアップする機構の存在を示唆してきた。本研究では、その実体を明らか
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にすることを目的として以下の解析を行った。1)完全欠損型ノックアウトマウス由来細胞を用いて1J/m^2の紫外線照射後の(6-4)光産物の修復動態を調べたところ、24時間後に30-50%の(6-4)光産物が消失し、CPDについても程度は低いものの有意な消失が認められた(48時間で20-30%)。2)日本人XP-A患者に多い変異であるAlwNI型変異をもつXPA cDNAをHeLa細胞に導入して安定発現する形質転換細胞を得たところ、ベクターのみを導入したコントロール細胞と同じ修復能を示したことから、この変異型XPAタンパク質はドミナントネガティブ効果がないことがわかった。3)シクロブタン型ピリミジンダイマーの検出感度をさらに10倍上昇させることに成功し、健常人由来細胞で100%、XP-A細胞でも90%程度が生存できる0.1J/m^2という紫外線照射後の修復動態をXP2BI細胞(XP-G)で調べたところ、シクロブタン型ピリミジンダイマーの時間依存的な消失がより顕著になり、新規のDNA修復機構が(6-4)光産物と同様にシクロブタン型ピリミジンダイマーに対しても働きうることが示唆された。4)適応応答についても検討を行ったが、前日に極低線量(0.2J/m^2)を照射しておくことで1J/m^2照射後の修復効率にわずかな亢進が見られたものの、適応応答の存在を確信するには至らなかった。以上の結果より、(1)この修復活性はヌクレオチド除去修復の残存活性ではなく別の機構によること、(2)この機構はヒトのみならずマウスにも存在すること、(3)修復効率はヌクレオチド除去修復と同様にシクロブタン型ピリミジンダイマーより(6-4)光産物の方が効率的であること、(4)この経路には少なくともXPAおよびXPGは関与しないことが明らかとなった。<br />We have established a super-sensitive detection method for measuring cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) and (6-4)photoproducts (6-4PPs) induced by biological doses of ultraviolet (UV) light and suggested that human cells might have a novel repair system mainly for 6-4PPs other than nucleotide excision repair which has been thought to be only repair system for those lesions in humans so far. In this study, we have obtained the following findings.1.The removal of 6-4PPs was observed even in the embryonic fibroblasts derived from xpa(-/-) or xpg(-/-) knock-out mice (30-50% after 24 hr). In addition, the removal of CPDs was also detected in those cells with a less efficiency (20-30% after 48 hr).2.HeLa cells stably expressing AlwNI-type mutant XPA did not show any impairment of nucleotide excision repair activity, suggesting that this mutant XPA protein does not have a dominant-negative effect.3.We have further sensitized the detection method for CPDs, enabling us to determine the repair kinetics of CPDs in cells exposed to non-killing doses of Was low as 0.1 J/m^2. Under this condition, we have found that xeroderma pimentosum cells significantly remove CPDs (〜40% after 48hr).4.We could observe some weak enhancement of repair efficiency after UV irradiation of 1 J/m^2 when the human cells had been pie-exposed to 0.2 J/m^2. However, we need more extensive experiments to conclude whether the back-up repair system is under the control of adaptive responses.Taken together with those results, we concluded that mammalian cells have a certain back-up repair system, independent of XPA and XPG, which removes mainly 6-4PP but also CPDs with a less efficiency.<br />研究課題/領域番号:15310036, 研究期間(年度):2003-2004<br />出典：「ヒト細胞におけるヌクレオチド除去修復のバックアップ機構に関する研究」研究成果報告書 課題番号15310036 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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