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論文 |
論文
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中尾, 眞二 ; Nakao, Shinji
概要:
Diazepam binding inhibitor-related protein-1(DRS-1)に対する特異的なT細胞が、骨髄不全患者における発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)形質血球の出現に関与しているか否かを明らかにするため、抗
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DRS-1抗体を持つPNH型血球陽性の再生不良性貧血(再不貧)患者から、PIG-A遺伝子に異常を持つPNH型lymphoblastoid cell line(LCL)を樹立した。このPNH型LCLにレトロウイルスベクターや電気穿孔法を用いてDRS-1 cDNAの導入を試みたが、インヒビターが存在しているためか、恒常的にDRS-1を発現させることはできなかった。一方、組換えモエシンを用いたELISAを作製し67人の再不貧患者血清を調べたところ、25人(37%)において高力価の抗モエシン抗体が検出された。PNH型血球陽性再不貧患者43人とPNH型血球陰性再不貧患者24人のそれぞれの抗体保有率は47%、21%であり、PNH型血球陽性患者で有意に高頻度に抗モエシン抗体が検出された。モエシンはUT-7、K562などの骨髄系白血病細胞株と健常者由来CD34+細胞からエクソゾームとして細胞外に分泌されていた。これまでに我々が同定した抗DRS-1抗体、PNH型血球と、今回同定したが抗モエシン抗体の少なくとも一つを認めた再不貧患者では26例中22例(85%)が免疫抑制療法に反応して改善したのに対し、いずれも認めない再不貧患者2例では免疫抑制療法が無効であった。これらの所見から、再不貧患者では造血細胞由来のモエシンに対するB細胞の反応が高頻度に起こっており、抗モエシン抗体、抗DRS-1抗体、PNH型血球の検出を組み合わせることによって、免疫病態が関与する再不貧を診断できる可能性が示唆された。抗モエシン抗体を検出するための酵素免疫抗体法を開発し、特許(再生不良性貧血患者血清に存在する自己抗体の検出方法、特願2004-333725)を取得した。<br />In an attempt to determine whether CD4^+ T cells specific to diazepam-binding inhibitor protein-1 (DRS-1) contribute to the survival advantage of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH)-type stem cells, we established a lymphobastoid cell line with PIG-A mutation from an aplastic anemia (AA) patients showing a high titer antibodies speicific to DRS-1. We tried to transfect the PNH-type LCL cells with DRS-1 cDNA using various methods such as retroviral vectors and electroporation to use them as a target of DRS-1 specific CD4^+ T cells. However, all the methods failed to induce expression of DRS-1 gene in LCL cells, probably due to inhibitory mechanisms for the DRS-1 expression inherent to B lymphocytes. Thus, we suspended this experiments and focused on another candidate autoantigen, moesin.We screened the sera of AA patients possessing small populations of PNH-type cells for the presence of antibodies (Abs) which recognize proteins derived from a leukemia cell line, UT-7. Immunoblott ing using proteins derived from lysates or culture supernatants of UT-7 cells revealed the presence of IgG Abs specific to an 80 kD protein. Peptide mass fingerprinting identified this 80 kD protein as moesin. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using recombinant moesin showed high titers of anti-moesin Abs in 25 (37%) of 67 AA patients. Moesin was secreted from several myeloid leukemia cell lines other than UT-7, such as OUN-1 and K562, as an exosomal protein. The presence of anti-moesin Abs was significantly correlated with the presence of PNH-type cells and anti-diazepam-binding inhibitor-related protein-1 (DRS-1) Abs. AA patients that did not show any of these three markers tended to respond poorly to immunosuppressive therapy. These findings suggest that a B-cell response to moesin, possibly derived from hematopoietic cells, frequently occurs in patients with AA and that detection of anti-moesin Abs in combination with other markers may be useful in diagnosing immune pathophysiology in AA patients.<br />研究課題/領域番号:17390275, 研究期間(年度):2005-2006<br />出典：「骨髄不全における自己抗原特異的T細胞を介したPNHクローン増幅メカニズムの解明」研究成果報告書 課題番号17390275 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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中尾, 眞二 ; Nakao, Shinji
概要:
一部の再生不良性貧血(再不貧)患者血清抗体によって認識される白血病細胞株UT-7由来の80kD蛋白を同定するため、免疫沈降により精製したこの蛋白のアミノ酸配列を質量分析を用いて同定した。その結果、この蛋白は細胞膜関連蛋白のモエシンであること
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が判明した。患者血清中の抗モエシン抗体価をELISA法により測定したところ、再不貧患者43例中20例(46.5%)が陽性であった。抗体の陽性率は、自己免疫性再不貧のマーカーであるPNH型血球陽性の再不貧患者では22例中14例(64%)であったのに対し、PNH型血球陰性の再不貧患者では18例3例(17%)のみであった。一方、UT-7由来のcDNAライブラリーのスクリーニングにより同定した蛋白diazepam-binding inhibitor-related sequence-1 (DRS-1)に対する抗体はPNH型血球陽性再不貧例84例中の32例(38.1%)に検出された。DRS-1のcDNA断片に由来するGST融合蛋白を作成し、各々に対する抗体の有無を決定したところ、抗体陽性者の約半数において、173-198位のペプチドに対する抗体が検出された。HLA-DR15蛋白と結合するT細胞エピトープのペプチドを合成し、DRS-1ペプチド特異的T細胞の前駆細胞頻度をELISPOTアッセイで調べたところ、抗DRS-1抗体陽性でDR15を持つ患者では、検討した2例の両例においてDRS-1特異的T細胞の前駆細胞が高頻度に存在することが示された。このDRS-1ペプチドによって患者末梢血単核細胞から誘導したDRS-1特異的CD4陽性T細胞は、DR15陽性白血病細胞株KH88を用量依存性に傷害した。したがって、抗DRS-1抗体を持つHLA-DR15陽性再不貧患者においては、DRS-1特異的CD4陽性が骨髄不全の発症に関わっている可能性が示唆された。<br />To identify an 80-kD protein derived from a leukemia cell line, UT-7, that was recognized by scrum IgG of a plastic anemia (AA) patients, we purified this protein using immunoprecipitation and determined amino acid sequence with mass fingerprinting. The protein proved to be moesin. When patients' sera were screened using ELISA and recombinant moesin, 20 of 43 (46.5%) AA patients were positive for anti-moesin antibodies. The antibody was detected in 14 of 22 (64%) patients possessing increased paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH)-type cells which are known to be a marker for lmmunopathophysiology of AA while it was detected in only 3 of 18 (17%) patients without increased PNH-type cells.We also identified diazepam-binding inhibitor-related sequence-1 (DRS-1), as a candidate autoantigen of AA using immunoscreening of cDNA library derived from UT-7. Antibodies to this protein were detectable in 32 of 84 (38.1%) of AA patients possessing increased PNH-type cells. Epitope mapping using GST-fusion protein fragments derived from DRS-1 cDNA showed that a 26 mer peptide (amino acid 173-198) contained a hot spot of antibody epitopes which was recognized by nearly half of AA patients showing anti-DRS-1 antibodies. When peripheral blood lymphocytes were examined using ELISPOT assay for the presence of T-cell precursors specific to a DRS-1 peptide which has high affinity to HLA-DR15, two AA patients carrying HLA-DR15 and anti-DRS-1 antibodies showed high frequency of DRS-1-specific CD4^+ T cells. DRS-1-specific T cells generated from one of the two AA patients by stimulating T cells with the DRS-1 peptide showed cytotoxicity against an HLA-DR15^+ and DRS-1-expressing leukemia cell line KH88 in a dose-dependent manner. These findings indicate that in AA patients possessing HLA-DR15 and anti-DRS-1 antibodies, DRS-1-specific T cells may contribute to development of bone marrow failure.<br />研究課題/領域番号:15390298, 研究期間(年度):2003-2004<br />出典：「再生不良性貧血における自己抗原の解析: 自己抗体によって同定された造血幹細胞抗原におけるCD4陽性T細胞エピトープの同定」研究成果報告書 課題番号1539029 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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高松, 博幸 ; Takamatsu, Hiroyuki
概要:
モエシンKOマウスは以下の表現型異常が認められた。末梢血白血球減少、貧血、体重減少と脾腫大、骨髄造血幹細胞の減少、骨髄・脾臓のB細胞・形質細胞の減少とT細胞の増加、脾臓の濾胞構造の不明瞭化である。一方、モエシンKOマウスにモエシン蛋白質を免
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疫したところ、抗モエシン抗体が産生された。前処置後の野生型マウスに抗モエシン抗体を産生する脾臓・骨髄細胞を骨髄内移植したところ、野生型マウスに抗モエシン抗体産生、TNFαとIFNγ濃度の上昇、白血球減少がみとめられたが、血小板減少と貧血は認められなかった。<br />Moesin KO mice grew normally. However, the body weight of moesin KO mice was lower than that of WT mice. Complete blood counts of moesin KO mice revealed leukocytopenia and macrocytic anemia ; platelet counts were comparable. Moesin KO mouse spleens were heavier than those of WT mice and follicle formation in spleens of moesin KO mice were obscure with increased CD3^+lymphocytes and reduced CD19^+lymphocytes as compared with WT mice. BM of moesin KO mice was normocellular and characterized by increased CD3^+lymphocytes and reduced CD19^+lymphocytes as seen in spleens of moesin KO mice. The number of lineage negative, Sca-1^+, and c-Kit^+(LSK) mouse HSCs in moesin KO BM tended to be lower than that of WT mice. Moesin KO spleen/BM cells capable of producing anti-moesin antibodies were infused into BM of WT B6 male mice. Transplanted mice showed leukocytopenia and increase of TNFαand IFNγin plasma compared to WT B6 male mice transplanted with WT spleen/BM cells, but anemia and thrombocytopenia were not observed.<br />研究課題/領域番号:21591237, 研究期間(年度):2009-2011
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