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論文 |
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中西, 義信 ; Nakanishi, Yoshinobu
概要:
金沢大学薬学系<br />細胞性因子によるアデノウイルス12型(Ad12)DNAの転写と複製の調節機構について以下に述べる研究成果が得られた。1.Ad12DNAの転写と複製を調節する細胞性因子の同定。(1)NFーIの同定。Ad12E1A遺伝
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子の2つの転写のうちD転写を特異的に促進する因子をエ-ルリッヒ腹水癌細胞の核抽出液中に見い出し、精製を行った。精製標品は48,53,55kDaの3つのペプチドを含んでいた。この因子はAd12DNAの左端を1番としたとき22番〜48番の領域に結合したが、この配列はHeLa細胞のNFーIが認識する配列と一致した。さらにこの因子は、Ad2DNAの複製開始反応とHeLaNFーIと同程度に促進した。よってこの因子はマウスNFーIであると結論された。マウスNFーIはAd12DNAの左端付近に結合することにより、転写と複製両反応を調節すると考えられる。(2)ESFー1の同定。HeLa細胞の核抽出液中に存在するESFー1と名づけた因子が、Ad12E1A遺伝子のP転写を促進することが分った。この因子はTATAボックス直前の5'ーTGTCAー5'配列に結合する。2.Ad12E1A遺伝子転写の自己調節。DNAトランスフェクションにおいて、135mRNA由来のE1Aタンパクが自己遺伝子転写を約10倍促進することが分った。12SmRNA由来のタンパクは影響を与えなかった。E1Aタンパクの作用を解析するためにAd12E1Aタンパクの大量生産を、酵母と用いた系により行った。現在まで粗抽出液中にそれらしいペプチドを検出でき、抗体による確認を行っているところである。得られたE1AタンパクとNFーI、ESFー1との相互作用を調べる予定である。<br />Celluar factors that regulate transcription and replication of adenovirus type-12(Adl2)DNA were analyzed.1 Identification of cellular factors regulating transcription and replication of Adl2 DNA.(1) Identification of nuclear factor I (NF-I) that stimulates distal transcription of the AD12 E1A gene and replication of Ad DNA.A factor stimulating Adl2 EIA gene transcription in vitro was purified to near homogeneity from nuclear extracts of Ehrlich ascites tumor cells. A purified factor contained three peptides with molecular masses of 48, 53 and 55 kDa. This factor bound to a region located at the left end of Adl2 DNA where NF-I of, HeLa cells bound. Moreover, a purified factor stimulated replication initiation of Ad2 DNA in'vitro to the same extent as HeLa NF-I did. We thus concluded that a purified factor is mouse NFI. These results indicate that NF-I regulates both transcription and replication of Ad 1 2 DNA - by binding to the left end of the viral genome.(2) Identification of ESF-1 that stimulates proximal transcription of the Adl2 ElA gene.A factor stimulating proximal transcription of the Adl2 ElA gene was found in nuclear extracts of HeLa cells. This factor, designated ESF-1, recognizes a sequence 5'-TOTCA-3' located in a region adjacent to a TATA box. Purification of ESF-I is in progress.2 Autoregulation of Adl2 EIA gene.ElA protein derived from 13S, but not 12S. MRNA stimulated transcription of its own gene in a DNA transcription assay. This indicates that Adl2 EIA gene transcription is under a positive autoregulation. To elucidate a precise mechanism for this regulation, production of ElA protein is now in progress, usinga yeast expression system.<br />研究課題/領域番号:02680154, 研究期間(年度):1990-1991<br />出典：「細胞性因子による腫瘍ウイルスDNAの転写と複製の調節機構」研究成果報告書 課題番号02680154(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）) 本文データは著者版報告書より作成
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生水, 真紀夫 ; Shozu, Makio
概要:
金沢大学医学部・附属病院<br />本研究の成果は、以下の4点に集約される。1.子宮筋腫組織ではエストロゲン合成酵素であるアロマターゼが、正常子宮筋と比較して10-20倍程度高いことを、1)mRNAレベル(合成RNAを内部標準とした定量的R
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T-PCR法)、2)蛋白レベル(ミクロソーム分画を用いたWestem blottingによる半定量法)、3)酵素活性(トリチウムラベルアンドロステンジオンを基質としてミクロソーム分画のトリチウム水産生速度を測定するいわゆるwater assay法)の3法により証明した。2.ついで、アロマターゼの発現細胞が子宮筋腫組織中のどの細胞であるかをに確認した。抗アロマターゼ抗体を用いた染色では子宮筋腫に高い免疫原性が証明された。また、子宮筋腫内に存在する動脈壁の線維細胞にも弱い抗原性が認められた。したがって、子宮筋腫細胞アロマターゼを発現していることが明らかとなった。3.そこで、アロマターゼにより産生されるエストロゲンの意義について検討した。子宮筋腫組織より酵素消化法により分離培養した初代培養細胞を用いて、1)生理的に存在するレベルのアンドロステンジオン(10^8M)から筋腫細胞自身がエストラジオールを産生すること、2)このエストラジオールにより自らの増殖が促進されること、3)このアンドロステンジオンの細胞増殖効果はアロマターゼインヒビターにより特異的に阻止されることが確認された。さらに、この細胞増殖効果はメデイウム中のエストラジオール濃度をほとんど上昇させることなく認められることから、オートクライン・パラクライン・イントラクライン効果によるものと推定された。4.子宮筋腫組織におけるアロマターゼの発現は、gonadotrophin releasing homone agonist(GnRHa)の術前投与により著明に減少することが明らかになった。GnRHa療法時にみられる子宮筋腫の速やかな退縮効果には、子宮筋腫におけるin situ estrogen合成の抑制効果も関与しているものと推定された。GnRHaのアロマターゼ抑制効果は、in vitroでも一部再現可能であったことから、GnRHaが子宮筋腫細胞に直接作用している可能性が考えられた。<br />In the this study we characterized in detail the expression of aromatase P450 in leiomyomas to determine the physiological and pathological role of in situ estrogen in the growth advantage of leiomyomas.1) We demonstrated over-expression of aromatase P450 in leiomyoma tissues in comparison to the surrounding myometrium by three different and complementary methods: The levels of aromatase P45O transcripts were quantitated by quantitative competitive RT-PCR The amount of protein was semi-quantitated by Western blot analysis using microsomal fractions of leiomyoma tissues. Enzyme activity was measured by tritiated water-releasing assay using microsomal fractions.2) To identify a cell type that express aromatase P450 in leiomyoma tissues, immunohistochemical analysis was performed on the tissue samples and the leiomyoma cells that were released and cultured from the fresh leiomyoma tissues. Strong immunoreactivity was localized in the cytoplasm of leiomyoma cells.3) To determine whether endogenous aromatase P450 plays a role in the growth promotion of leiomyoma cells, we evaluated the cell W growth of leiomyoma cells treated with various concentration o of estrogens as well as androgens using a WST-1 assay and thymidine incorporation assay. We confirmed mat leiomyoma cells per se synthesize estrogen, which promotes their growth via an autocrine/intracrine mechanism.4) The expression of aromatase P450 in leiomyoma tissues was profoundly suppressed by preoperative gonadotrophin releasing hormone (GnRH) agonist therapy. In vitro experiment indicated that GnRH agonist acted directly on the leiomyoma cells to reduce the expression of aromatase. This direct inhibitory action of GnRH agonist on in situ aromatase seems to contributes to the rapid regression of leiomyoma during GnRH agonist therapy.<br />研究課題/領域番号:11671602, 研究期間(年度):1999 – 2000<br />出典：「アロマターゼ過剰発現を手がかりとした子宮筋腫の病因解明とその治療応用」研究成果報告書 課題番号11671602（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-11671602/ ）を加工して作成
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